血管性癡呆模型及信號通路研究進展

王璽寧，陳真

(中國藥科大學，江蘇 南京 211198)

血管性癡呆(vascular dementia,VaD) 是由一系列腦血管疾病(如缺血性卒中、出血性卒中、腦缺血、腦缺氧等)引起的嚴重認知障礙綜合征，是繼阿爾茨海默病(AD)之后第二大常見的癡呆類型[1]。社會人口老齡化使VaD成為公認的公共衛生問題，引起大家廣泛關注，且VaD由于其高患病率及廣泛的預防和補償性治療潛力而成為許多研究的主題[2]。血管性癡呆常伴隨著進行性認知障礙、記憶力衰退、執行功能喪失(如問題解決、思維、推理、判斷)及語言問題，嚴重的還會出現抑郁和焦慮等精神問題[3]。VaD的發生除了與年齡相關外，還與吸煙和飲酒等不良生活習慣、高血壓和代謝綜合征等多種疾病相關[4]。研究表明，合理的運動、戒煙、固定的認知訓練、治療高血壓及高血糖都能一定程度上預防血管性癡呆的發生[5]。臨床用于VaD的治療藥物較多，有膽堿酯酶抑制劑、N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑(NMDA受體拮抗劑)、降壓藥以及一些用于阿爾茨海默病或已知的降低心血管危險因素的藥物等[6-8]。

目前對于VaD的病理和機制的認知尚不完全清楚，但其主要與氧化應激失衡、神經炎癥反應、內皮和微血管功能障礙、膽堿能系統障礙、興奮性氨基酸損傷等因素有關[9-10]。但由于缺乏合適的VaD動物模型，制約了對疾病的基礎認識和治療方法的發展。本綜述著重匯總VaD目前常用的動物模型及疾病發展的相關病理機制，為VaD的基礎與臨床研究提供理論依據。

1 血管性癡呆模型的建立

1.1 血管阻斷模型

1.1.1 雙側頸總動脈閉塞模型 在VaD發病機制和治療方法的實驗研究中，最常用的模型是雙側頸總動脈閉塞模型，閉塞后動物腦血流量(cerebral blood flow，CBF)早期迅速減少，造成持續的細胞損傷和認知功能障礙，用于再現與VaD患者相同的神經病理和行為改變。2-血管阻斷(2-vessel occlusion，2-VO)模型或永久性雙側頸總動脈阻塞(BCCAO)模型：實驗動物以仰臥位固定在板上，沿中位線切開皮膚，分離雙側頸總動脈和迷走神經，在頸總動脈遠端以4號線永久結扎[11]。現也有采取改進后的實驗方法，采取間隔一周左右分次阻斷雙側頸總動脈，降低動物的死亡率。

1.1.2 多血管阻斷模型 類似2-VO模型，也產生了同樣依賴時間恢復CBF的多血管阻斷模型。三血管阻斷(3-VO)模型：經頸中線切口后，在基底動脈兩側切開硬腦膜和下面的蛛網膜，將腦干膜取下，暴露并永久閉塞椎動脈交界處的近基底動脈，所有經近基底動脈閉塞后存活的動物均進行BCCAO處置[12]。四血管阻斷(4-VO)模型：通過鉗夾椎動脈和頸總動脈10～20 min，導致CBF短期減少，產生學習和記憶缺陷，以及海馬的急性神經元死亡，皮質和丘腦的少突膠質細胞凋亡。實際應用中，4-VO模型也有先永久夾閉或電灼切斷椎動脈的，但會造成急性腦缺血，故改良為左右兩側血管間隔一段時間后分次阻斷。

1.1.3 雙側頸總動脈狹窄(BCAS)模型 通過頸中線切口，暴露兩側頸總動脈并脫離鞘。用絲線輕輕提起動脈，然后將其置于微線圈的環之間，微線圈通過繞頸總動脈旋轉來纏繞，閉塞間隔30 min左右。微線圈的內芯直徑決定了腦損傷的程度，出于死亡率和重復性的考慮，常見采用內徑0.18 mm、節距0.5 mm的微線圈繞雙側頸總動脈纏繞造成狹窄[13]。除了使用硅橡膠線圈外，也有通過外科手術線、電刺激等方法制作頸總動脈狹窄模型。

1.1.4 單側頸總動脈閉塞(UCCAO)模型 這個模型只對一側頸總動脈用縫合線永久結扎，由于慢性腦灌注不足和白質病變，實驗動物出現短期記憶障礙，但是難以檢測到組織學梗死。

1.2 多發性梗死和血管栓塞模型

1.2.1 多發性微梗死模型(MMI) 主要是由微球、膽固醇晶體等誘導的多發性微梗死模型，與動脈粥樣硬化栓塞非常相似。沿頸中線切口，在手術顯微鏡下暴露右側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內動脈(ICA)，用顯微外科夾暫時夾住CCA和ICA,絲線松散地系在ECA的起點，并在ECA的遠端結扎。一個1 mL的注射器連接著一根PE-50管，其尖端在火焰附近加熱逐漸變細，通過微型剪刀做的小切口插入ECA。將導管輕輕從ECA伸入ICA腔內，重新定位顯微外科夾以僅阻斷CCA。新制備的微球或膽固醇晶體緩慢地注入ICA超過1 min。輕輕地取出導管，結扎血管，取出顯微外科夾，關閉頸部切口[14]。MMI誘發的模型表現出與VaD相似的認知功能障礙和病理特征，并誘發遲發性脫髓鞘、海馬損傷、血腦屏障損傷和炎癥。

1.2.2 大腦中動脈梗塞模型(MCAO) 將實驗動物在頸部中線處進行切口，分離肌肉和結締組織，分離雙側頸總動脈結扎，迷走神經受到保護以避免損傷，在頸總動脈上開一個小切口，將線拴置入大腦中動脈起始處[15]。MCAO模型造成局部的腦缺血，線拴的選擇影響腦損傷的嚴重程度。

1.3 其他模型

1.3.1 高脂飲食誘導VaD模型 高脂肪飲食(HFD)和海馬體的認知缺陷之間有很強的聯系，但其機制和影響還沒有明確的研究證明。3個月HFD喂養的大鼠在學習和記憶任務中表現較差，認知障礙程度與衰老或腦損傷的大鼠相當[16]。

1.3.2 易卒中型自發性高血壓大鼠(SHRSP)模型 SHRSP大鼠在出生后逐漸升至穩定的高血壓，在三月齡左右發生腦卒中，若用高鹽飼料喂養可促進血壓上升速度和腦卒中，廣泛應用于高血壓腦卒中的病理生理學改變和機制研究。SHRSP大鼠在卒中后或在血管閉塞模型下，均表現出認知功能障礙，并出現小血管壁硬化、BBB破壞和炎癥反應[17]。

1.3.3 糖尿病小鼠模型 用大劑量或多劑量的鏈脲佐菌素(STZ)誘導T1DM小鼠，發現T1DM小鼠海馬中與神經發生和突觸可塑性相關的基因減少，受到糖尿病誘導的微血管改變和血腦屏障破壞導致小鼠長期認知的障礙[18]。

2 通路研究進展

2.1 MAPK級聯信號通路 絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，可以將胞外信號從細胞表面傳遞至細胞內，同時通過響應各種外界刺激，如細胞因子、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、氧化應激(ROS)、生長因子(VEGF)、激素等，調節細胞增殖、分化、炎癥、凋亡的過程[19]。MAPK信號級聯反應由至少3個層次順序的激酶成分組成：MAPK激酶激酶(MAP3K)、MAPK激酶(MAP2K)和MAPK。 MAP3Ks磷酸化并激活MAP2Ks，而MAP2Ks磷酸化并激活MAPK。活化的MAPK磷酸化各種靶蛋白，包括轉錄因子(例如c-Jun、c-Myc和ATF2)以及凋亡相關蛋白(例如Bcl-2和Bad)[20]。MAPK家族共有5個亞族,Erk1/2、P38 MAPK、c-Jun氨基酸激酶(JNK)、Erk5，研究最多的主要是Erk、P38 MAPK和JNK[21]。而P38 MAPKα和β亞型在神經元細胞譜系中普遍表達，并可在氧化應激，局部缺血及促炎細胞因子的作用下募集,從而成為中樞神經系統(CNS)中功能最強大的亞型[22]。

MAPKs可通過調節小膠質細胞或星型膠質細胞源神經炎癥及調節神經可塑性參與血管性癡呆等神經相關疾病的病理生理過程[23]。體外研究表明，在與LPS激活的小膠質細胞共培養的神經細胞中，MAPK信號被激活[24]，且Erk1/2和P38 MAPK均促進急性創傷性脊髓損傷(SCI)區域激活的小膠質細胞中iNOS mRNA及其蛋白表達[25]。激活P38 MAPK可上調NF-κB表達，促進一系列炎癥因子如IL-6、IFN-β的分泌，抑制抗凋亡基因Bcl2表達，促進神經元細胞凋亡。相反，使用p38抑制劑SB239063，可防止IκBα的下游磷酸化和p65(NF-κB)轉移至細胞核[26]。長時程增強(Long-term potentiation，LTP)是神經突觸可塑性的生物學基礎，主要依賴于NMDA谷氨酸受體的激活[27]。而P38 MAPK被認為是NMDA受體的信號傳導下游，增加P38 MAPK的活性會通過增加促炎細胞因子水平抑制LTP及tau[28]蛋白磷酸化。Origlia等[28]通過探討P38 MAPK在β-淀粉樣蛋白(Aβ)誘導的LTP抑制的作用中得出，Aβ損壞LTP主要通過晚期糖基化產物(RAGE)介導的P38 MAPK的激活。此外，抑制P38 MAPK活性會阻斷Aβ誘導的神經突觸的丟失[29]。因此，MAPKs信號通路廣泛參與VaD的發病機制，通過抑制該通路相關蛋白表達，可以有效抑制血管性癡呆等神經疾病的發生。

2.2 PI3K/ AKT信號通路 PI3K-AKT信號通路參與調節不同生物功能，包括營養代謝、細胞增殖、轉錄調節和細胞存活等，所有AKT亞型均在神經系統中高度表達，并在神經保護中起重要作用[30]。腦內各種營養因子(如胰島素樣生長因子1(IGF-1)和腦源神經營養因子(BNDF))通過與它們的同源酪氨酸受體結合，將PI3K募集至質膜附近，PI3K的催化亞基在質膜的內表面生成磷酸肌醇磷酸酯PIP2和PIP3，而PIP3作為第二信使，通過借助它的N末端pleckstrin同源(PH)域，使AKT從細胞質轉移到質膜上，進而通過磷酸化激酶域激活環中的Thr308和調節域HM中的Ser473位點，使AKT被磷酸化激活[28]。PI3K-AKT信號通路被激活后，可通過調節下游靶蛋白mTOR 、GSK3β和Bad等的活性，介導神經元細胞自噬、凋亡和增殖過程。

PI3K/AKT/mTOR通路對神經元細胞的影響有兩個方面：首先，激活該通路會促神經元細胞生存，但是同時會干擾神經元細胞自噬過程，從而導致異常蛋白積聚，產生毒性環境；另一方面，在mTOR水平阻斷PI3K/AKT促存活信號將損害細胞生長和結構，并促進自噬的增加。在這兩種情況下，都必定會增加Aβ水平，最終導致神經元細胞死亡[29]。因此，保護神經功能必須通過刺激或維持正常的PI3K/AKT/mTOR存活途徑和促進自噬兩種途徑協調起作用。AKT介導的另一個生存機制靶點是Bad。AKT可通過磷酸化Bad的Ser136位點，誘導其與14-3-3締合，并阻止其對抗凋亡蛋白Bcl-2的抑制作用，抑制神經元細胞凋亡[30]。研究表明，牛磺酸可通過Akt/Bad途徑抑制海馬神經元凋亡，有望成為改善T2D大鼠學習和記憶能力的候選藥物[31]。N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體的過度刺激介導的谷氨酸誘導的興奮性毒性，是引起神經元繼發性損傷的機制。而NMDA誘導的興奮性毒性需要PI3K/AKT 下游靶蛋白mTORC1和GSK3β的參與，從而證明了這些激酶在神經元對損傷的反應中的重要性[32]。AKT通過負性調節GSK3β，減少GSK3β在Ser9位點磷酸化，增加神經突觸可塑性及神經元存活。此外，GSK3β過表達可阻礙NMDA依賴的LTP的誘導，影響VaD中學習和記憶形成[33]。

2.3 TLR4/NF-κB信號通路 神經炎癥是中樞神經系統(CNS)的復雜免疫反應，參與VaD的病因和病程。細胞(如小膠質細胞和星形膠質細胞)和分子(如細胞因子，補體和模式識別受體)免疫成分是神經炎癥的關鍵調節劑，它們的活性失調會導致不適當的免疫反應，從而導致組織損傷并影響中樞神經系統功能。TLR4是toll樣受體(TLRs)家族的成員，也是脂多糖(LPS)的主要受體，在小膠質細胞中表達廣泛，可通過激活下游轉錄因子核因子(NF)-κB，增加促炎細胞因子[如：TNF-α、白介素(IL)-1β和IL-6]，趨化因子(如細胞間黏附分子ICAM-1、血管內皮黏附分子VCAM-1)以及活性氧(ROS)和氮物質(RNS)的產生[34]。NF-κB是一個普遍表達的轉錄因子系統，通過與抑制劑蛋白IκB相互作用，以失活的形式保留在細胞質中[35]。

研究表明，NF-κB與大腦內的免疫和應激反應密切相關，當NF-κB抑制劑濃度在腦外傷周圍組織中明顯升高時，可減輕繼發性腦損傷并降低炎性細胞因子的表達[34]。通過2-VO在小鼠中誘導長時間的輕度腦灌注不足，會導致白質道內反應性星形膠質細胞和小膠質細胞增生，同時伴隨著星形膠質細胞中NF-κB的激活，表明白質內星形膠質細胞的促炎性變化可能參與VaD的發病機制[36]。內質網應激(ER)被認為是Aβ誘導神經毒性的介質，ER抑制劑salubrinal可通過抑制NF-κB通路，抑制Aβ誘導的神經毒性，從而起到神經保護作用[37]。因此，抑制腦內NF-κB信號通路，有望通過減少神經炎癥反應，減少內質網應激，保護神經元細胞正常功能，抑制VaD的發生和發展。

2.4 JAK/STAT信號通路 JAK-STAT信號傳導與局部腦缺血誘導的腦損傷密切相關，且該通路的炎癥信號可以介導小膠質細胞激活[38]，因此參與了VaD發病機制。Janus酪氨酸激酶(JAK)可由多種細胞外配體，如IL-6、表皮生長因子(EGF)、TNF-ɑ、睫狀神經營養因子(CNTF)與多種膜受體結合后被激活[39]。JAK被激活后可磷酸化細胞質中的STAT，磷酸化后的STAT形成同源或異源二聚體，易位至細胞核，直接與特定靶基因的啟動子區域結合，從而調節與炎癥相關的基因的轉錄[40]。JAK-STAT信號通路蛋白在多種細胞中均有表達，包括神經細胞，比如STAT3、STAT1和JAK1在發育中的成人中樞神經系統中有表達[41]。

大腦損傷會導致大量炎性因子的釋放，大量研究已發現大腦中動脈閉塞(MCA)引起的缺血性損傷會導致一些炎癥因子如IL-6、IL-1β、TNF-ɑ水平增加[42]。因此，局部缺血是先天性易于激活JAK/STAT途徑的疾病。局灶性缺血后，STAT3在反應性小膠質細胞和巨噬細胞中高度表達，并且從缺血后4 d開始STAT1的表達增加[43]。Planas等[44]發現JAK-STAT參與神經節苷脂誘導的小膠質細胞激活過程，JAK抑制劑AG490可減少與炎癥相關的基因，如誘導性一氧化氮合酶(iNOS)、ICAM-1、MCP-1的轉錄，還能抑制神經節苷脂誘導的NO釋放，說明JAK-STAT通路參與腦炎癥反應的早期事件。在MCAO模型中，過表達miR-31可抑制JAK1/STAT3途徑的激活，減少氧化應激誘導的神經元損傷[39]。

2.5 其他相關通路或蛋白 其他相關通路或蛋白也參與了VaD的病理生理過程。膽堿能途徑是最常見的與認知相關的途徑，有研究表明，2VO后4周，海馬中膽堿乙酰基轉移酶(ChAT)和乙酰膽堿(Ach)水平升高，乙酰膽堿酯酶(AChE)降低[45]。腦源神經營養因子BDNF，其在CNS尤其是海馬和皮質分布廣泛，可能是針對腦缺血損傷的內源性保護反應的一部分，因為BDNF的mRNA和蛋白在短暫缺血后均被上調[46]。一些主要的炎癥相關介導者，被報道在缺血性腦損傷中的炎癥起始中發揮重要角色。在2VO大鼠的腦血管內皮細胞中，細胞間黏附分子(ICAM-1)和血管細胞黏附分子(VCAM-1)均有顯著上調[47]，而抑制ICAM-1和VCAM-1則可改善腦缺血引起的認知功能下降[48]。基質金屬蛋白酶(MMP)也會參與缺血性腦損傷的病理生理，MMP-9的上調參與腦血管損傷及脫髓鞘[49]。核轉錄因子Narf2，可通過調節許多抗氧化劑的表達，抑制細胞內氧化應激發生，有研究發現，在Narf2敲除小鼠中發現氧化應激增加及認知功能下降[50]。

3 小結與展望

血管性癡呆是一種年齡相關的神經退行性疾病，隨著人口老齡化日益加速，腦血管疾病及其危險因子導致的血管性癡呆發病率也在上升，如何有效預防和治療血管性癡呆疾病，已成為神經學專家重點關注的對象和領域。盡管目前在定義和理解腦血管疾病與認知障礙和癡呆之間的關系方面已取得了很大進展，但仍存在一些不確定性。本文綜述了血管性癡呆有效的動物模型及相關信號通路研究，為血管性癡呆的藥物研究和開發提供新的思路和理論支撐。