絞股藍多糖對D-半乳糖致衰小鼠腎臟組織結構的影響

劉新勇，黎木蘭，黃嘉琳，王欣雨，唐小川，王曉麗

（1.廣西大學動物科學技術學院，南寧 530005；2.南寧市動物疫病預防控制中心，南寧 530001）

腎臟是機體最為重要的排泄器官，也是毒廢物作用的靶器官，具有排泄水溶性代謝產物，調節酸堿平衡以及機體多種生物活性物質的分泌等功能。同時，腎臟也是機體中最容易受到損傷的器官之一，除了各種疾病導致的腎臟損傷外，還有研究表明，隨著年齡增加或在衰老動物模型構建中使用致衰劑所致的衰老，可以導致腎臟組織結構、腎功能指數等發生變化，導致腎臟功能喪失而直接影響機體健康［1，2］。因此，防治腎臟病損的研究越來越受到重視。多糖是目前研究較多的免疫增強劑，其在機體臟器功能防護上也有一定的功能。有研究表明多糖可以對酒精致小鼠腎臟損傷具有良好的保護作用［3］，能夠改善D-半乳糖致衰小鼠的腎臟結構與腎臟功能［4］。

絞股藍（Gynostemma pentaphyllum）在中國分布廣泛，是較有發展前途的經濟植物和藥物，其成分復雜，其中主要化學成分為皂苷、多糖以及黃酮類化合物。以往的研究，人們更多關注在絞股藍皂苷類成分上，而對絞股藍多糖（Gynostemma pentaphyllumPolysaccharide，GPP）的研究較少。近年來雖然對GPP開展了一些研究［5，6］，但對腎臟機能方面的研究較少，尤其是致衰腎臟方面的研究在國內外還尚未見文獻報道，因此本研究以健康昆明系小鼠作為研究對象，頸背部注射D-半乳糖建立衰老模型，采用石蠟切片、HE染色結合光學顯微鏡觀察絞股藍多糖對致衰老小鼠腎臟形態結構的影響，從組織形態學角度為研究絞股藍多糖對致衰老小鼠腎臟的保護作用以及絞股藍的開發利用提供理論和試驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康昆明小鼠60只，4周齡，體重（20±1）g，雌雄各半，購自廣西醫科大學動物實驗中心（許可證編號：SYXK桂2014-0001）。飼養于廣西大學動科院一樓實驗動物房的標準鼠籠中，讓其自由進食、飲水。適應性飼養3 d后隨機分為6組：Ⅰ-空白對照組（生理鹽水組）；Ⅱ-模型組（D-半乳糖致衰老組）；Ⅲ-陽性對照組（Vc組）；Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ為絞股藍多糖（GPP）低、中、高劑量組。

Ⅰ組每天在頸背部皮下注射和腹腔注射生理鹽水，Ⅱ-Ⅵ組各鼠頸背部皮下注射200 mg/（kg·d）D-半乳糖；Ⅱ組腹腔注射生理鹽水；Ⅲ組腹腔注射Vc［200 mg/（kg·d）］；Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組分別腹腔注射GPP（低50 mg/（kg·d）、中100 mg/（kg·d）、高200 mg/（kg·d））；共計42 d。

1.2 石蠟切片制作

將小鼠CO2窒息處死，解剖后，取其腎臟組織置于事先準備好的波恩氏固定液中48 h以上，做好標記。常規方法制作石蠟切片，切片厚度7 μm；HE染色，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

1.3 統計分析

分別隨機選擇各組腎臟5張切片，每張切片隨機選取腎小球10個，總計50個，利用Image J測量出切片中腎小球直徑和腎小囊寬度后（腎小球直徑為最大直徑，腎小囊寬度分別取最大直徑的兩側及其尿極一側中間部位共3處測量取平均值），利用SPSS 26軟件進行統計學處理。

2 結果與分析

2.1 HE染色觀察

高倍鏡下，空白對照組的腎組織結構正常，腎小球結構清晰，腎小球直徑大小正常，腎小囊腔明顯，腎小管排列緊致，結構完整（圖1A）；而D-gal組腎小球明顯萎縮，直徑變小，腎小囊腔變大，腎小體周圍腎小管排列松散，管腔明顯，管壁上皮細胞界限不清，模糊（圖1B）。注射Vc的陽性對照組和3個劑量的絞股藍多糖組均能較明顯地改善腎臟的結構損傷，腎小球形態正常，周圍的腎小管排列較緊致，結構明顯有所恢復（圖1C、1D、1E、1F）。結果表明，絞股藍多糖可以不同程度地抑制D-gal造成的腎臟組織結構的損傷，對腎臟起到保護作用。

圖1 各組小鼠腎臟組織切片（HE染色×40）

2.2 絞股藍多糖對D-半乳糖致衰老小鼠腎小球直徑及腎小囊寬度的影響

由表1得知，絞股藍多糖各濃度組的腎小球直徑均顯著高于D-gal組（P＜0.05），與Vc組相比差異不顯著，與空白對照組相比差異顯著（P＜0.05），各多糖組間腎小球直徑差異均不顯著。結果表明，D-gal致衰老小鼠的腎臟腎小球直徑明顯變小，使用Vc和絞股藍多糖均可以使腎小球直徑有所改善，但與空白對照組相比，絞股藍多糖的改善效果要好于Vc。

表1 絞股藍多糖對D-半乳糖致衰老小鼠腎小球直徑和腎小囊寬度的影響

絞股藍多糖50 mg/（kg·d）組和100 mg/（kg·d）組與D-gal組相比，腎小囊寬度減小，差異顯著（P＜0.05），而200 mg/（kg·d）多糖組與D-gal組差異不顯著；50 mg/（kg·d）多糖組和100 mg/（kg·d）多糖組與空白對照組差異均不顯著，與200 mg/（kg·d）多糖組相比差異顯著（P＜0.05）。結果表明，D-gal致衰老小鼠的腎臟腎小囊寬度明顯變大，使用Vc和絞股藍多糖低、中劑量均可以使腎小囊寬度有所改善，與空白對照組相近，以上結果表明絞股藍多糖對D-gal致衰老小鼠的腎臟的腎小球直徑和腎小囊寬度有一定的保護作用。

3 小結與討論

衰老是一種不可逆轉的現象。在自然條件下，隨著年齡的增長，身體機能、環境穩定性和應激能力都在一定程度上惡化，各種器官的活動也在發生變化，而腎臟的衰老速度又比其他器官還要迅速［7，8］。腎臟的形態及功能在衰老后會改變，腎小球濾過率降低是腎臟衰老的主要特征［9］，且機體的衰老會造成腎臟內炎性反應的增長［10，11］，衰老的過程中往往伴有炎癥穩態失衡，而炎癥又會導致進一步的衰老，炎癥和衰老兩者之間相互影響［12］。

有研究發現，枸杞多糖通過增強機體的抗氧化能力、減少自由基的產生、減輕炎癥反應等方面對酒精致小鼠腎臟損傷具有良好的保護作用［3］，還可以改善D-gal致衰老腎臟血液循環和腎組織形態，具有延緩腎衰老作用［13］；金福菇多糖可以使D-gal誘導的衰老腎臟中超氧化物歧化酶的活力提高，丙二醛的水平降低，腎臟的病理性變化在一定程度上被修復，而且腎臟中p53蛋白的表達量在一定程度上減少［14］；靈芝多糖可以通過抑制腎臟組織中Zeb1、P16和P21的蛋白水平，上調抗衰老酶SIRT1的表達緩解腎臟衰老［15］；菟絲子多糖能使衰老小鼠腎組織中MDA下降，SOD及GSH-PX活力提高達到抗衰老作用［16］；歸芪多糖可保護D-半乳糖所致衰老大鼠腎組織的氧化損傷，從而起到保護腎臟衰老的作用［17］；黃芪多糖聯合二甲雙胍可對衰老糖尿病腎臟病變具有保護作用［18］；山茱萸炮制前后多糖成分對腎陰虛模型小鼠也均具有一定的抗衰老作用［19］。

本研究也發現，各GPP組均可以一定程度上改善由D-gal致衰引起的腎小球萎縮，腎小囊腔變大，腎小體周圍腎小管排列松散，管壁上皮細胞界限不清、模糊等形態變化。該結果提示，GPP可以保護由D-gal致衰引起的腎臟組織結構損傷，從而起到保護腎臟衰老的作用。綜合來看，50 mg/（kg·d）多糖組和100 mg/（kg·d）多糖組效果比較明顯，其中以100 mg/（kg·d）多糖組效果最佳。

目前最受關注的有關衰老的學說幾乎均認為與自由基有關，而GPP前期研究［5，20，21］表明GPP具有抗氧化、增強免疫的作用，因此推測GPP可能是通過免疫促進作用和提高抗氧化物質的活性，清除氧自由基從而降低自由基對機體的氧化損傷，來實現保護致衰腎臟延緩衰老的作用。