HS-SPME-GC-MS分析比較肉桂揮發(fā)性成分

韋露玲，謝鳳鳳，黃飄玲，任佳妮，滕建北

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧 530200）

肉桂為樟科植物肉桂（Cinnamomum cassiaPresl）的干燥樹皮，具有補(bǔ)火助陽，引火歸元，散寒止痛，溫通經(jīng)脈的功效，主治陽痿宮冷，腰膝冷痛，腎虛作喘，虛陽上浮，眩暈?zāi)砍啵母估渫矗摵聻a，寒疝腹痛，痛經(jīng)經(jīng)閉［1］。現(xiàn)代研究表明，肉桂主要有擴(kuò)張血管、促進(jìn)血液循環(huán)、增強(qiáng)冠脈及腦血流量、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、解熱、抗驚厥等作用［2］。桂枝為樟科植物肉桂的干燥嫩枝，具有發(fā)汗解肌，溫通經(jīng)脈，助陽化氣，平?jīng)_降氣的功效，主治風(fēng)寒感冒，脘腹冷痛，血寒經(jīng)閉，關(guān)節(jié)痹痛，痰飲，水腫，心悸，奔豚［1］。現(xiàn)代應(yīng)用中桂枝主要有降低腸道緊張度，輕度促進(jìn)膽汁分泌，可抗凝、利尿等藥理作用。桂丁為樟科植物肉桂的幼嫩果實(shí)，具有溫里散寒，止痛，止嘔功效，主治心胸疼痛，胃腹冷痛，惡心，噯氣，呃逆，嘔吐，肺寒咳喘［3］。現(xiàn)代主要應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的鎮(zhèn)痛、降壓作用和抗氧化作用［4］。三者同源而異用，不同的功效與三者間不同的物質(zhì)基礎(chǔ)是否存在著一定的關(guān)聯(lián)性，本研究擬通過HS-SPME-GC-MS研究三者主要含有的揮發(fā)性成分的異同，揭示三者間功效不同的物質(zhì)依據(jù)。

目前，通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)分析鑒定肉桂、桂枝的化學(xué)成分的研究較多。袁鵬飛等［5］采用HPLC化學(xué)成分指紋圖譜方法，分析桂枝、肉桂指紋圖譜的特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)兩者化學(xué)成分種類相似，但是含量上存在差異。龔正等［6］采用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析比較肉桂、桂枝揮發(fā)油成分，發(fā)現(xiàn)兩者揮發(fā)油的主要成分是桂皮醛。劉浩［7］通過應(yīng)用2WA型阿貝折射儀，測(cè)定肉桂和桂枝的揮發(fā)油折射率，通過HPLC法測(cè)定肉桂、桂枝成分，發(fā)現(xiàn)肉桂中桂皮醛含量高于桂枝，但在其他成分種類上兩者的化學(xué)成分相似。胡錦亮等［8］運(yùn)用氣相色譜質(zhì)譜對(duì)桂丁揮發(fā)油的化學(xué)成分進(jìn)行分離鑒定，鑒定出19種醛類化合物。目前未見到國內(nèi)外文獻(xiàn)中有運(yùn)用HS-SPME-GC-MS法對(duì)肉桂、桂枝及桂丁揮發(fā)性成分進(jìn)行比較分析的研究報(bào)道。本研究利用HS-SPME-GC-MS法對(duì)肉桂、桂枝及桂丁的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析和比較，并用面積歸一化法測(cè)定揮發(fā)油各組分的相對(duì)含量，旨在從揮發(fā)性成分的角度比較分析肉桂、桂枝、桂丁的異同點(diǎn)，為三者揮發(fā)油進(jìn)一步開發(fā)利用提供試驗(yàn)依據(jù)。

頂空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）技術(shù)是集采樣、萃取、濃縮和進(jìn)樣于一體的一種快速采樣技術(shù)［9］，通過結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）可以快速分析頂空固相微萃取儀富集樣本中絕大部分的揮發(fā)性成分［10，11］。因其操作簡(jiǎn)單、采樣迅速、重現(xiàn)性和線性良好，能夠有效避免有機(jī)溶劑提取和濃縮的繁瑣操作［12］，且所需樣品量少，樣品處理時(shí)間短，不使用有機(jī)溶劑，能夠真實(shí)地反映樣品揮發(fā)性組分的特點(diǎn)。因頂空固相微萃取的這些優(yōu)點(diǎn)，使得其在食品、醫(yī)藥和環(huán)境檢測(cè)鑒定揮發(fā)性組分的分析中得以廣泛應(yīng)用。因此本試驗(yàn)采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)對(duì)肉桂、桂枝、桂丁三者的揮發(fā)性成分進(jìn)行快速萃取和分析，研究肉桂、桂枝、桂丁化學(xué)成分的特點(diǎn)，以期為三者的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品

供試藥材肉桂、桂枝、桂丁采自廣西壯族自治區(qū)藤縣平福鄉(xiāng)仁厚村，自然陰干，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院梁子寧教授鑒定分別為樟科植物肉桂的干燥樹皮、干燥嫩枝、幼嫩果實(shí)。

1.2 儀器

Agilent 7697A型自動(dòng)頂空進(jìn)樣器；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（7890B GC-5977B MSD，配備30 m×250 μm×0.25 μm的HP-5MS石英毛細(xì)管色譜柱）；20 mL頂空進(jìn)樣瓶、密封瓶蓋、封蓋器，美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 揮發(fā)性成分提取 取肉桂、桂枝、桂丁粉末樣品約0.5 g，置于帶有硅橡膠隔墊的卷邊蓋透明頂空進(jìn)樣瓶中（20 mL），將頂空進(jìn)樣瓶放置在樣品盤中。自動(dòng)頂空進(jìn)樣，頂空平衡溫度為70℃，平衡時(shí)間為10 min，樣品環(huán)溫度為80℃，傳輸線溫度為90℃，進(jìn)樣時(shí)間為0.5 min，氣相色譜循環(huán)時(shí)間為50 min［13］。

1.3.2 氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）條件 色譜條件：經(jīng)查閱文獻(xiàn)及考察最終確定色譜柱為HP-5MS石英毛細(xì)管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；升溫程序從70℃開始，以5℃/min升至170℃，保持2 min，再以10℃/min升至230℃，保持1 min；進(jìn)樣方式為頂空自動(dòng)進(jìn)樣，不分流，載高純度He，柱流速1 mL/min。質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源（EI），電離能70 eV，離子源溫度為230℃，四級(jí)桿溫度150℃，接口溫度為250℃，掃描質(zhì)量范圍30～550 amu［14］。

2 結(jié)果與分析

經(jīng)化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理及采用面積歸一化法從各總離子流中計(jì)算各組分相對(duì)百分含量，按各峰的質(zhì)譜圖經(jīng)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索，結(jié)合相對(duì)保留時(shí)間，確定各成分。從肉桂中檢出25個(gè)峰，鑒定出22種成分，其中（E）-桂皮醛占揮發(fā)性成分32.14%，古巴烯占總揮發(fā)性成分的29.88%；桂枝中檢出18個(gè)峰，共鑒定出17種成分，其中（E）-桂皮醛含量為三者中最高，占揮發(fā)性成分的87.74%，古巴烯占總揮發(fā)性成分的2.65%；桂丁中檢出23個(gè)峰，鑒定出20種成分，（E）-桂皮醛占揮發(fā)性成分的79.90%，古巴烯占總揮發(fā)性成分的3.83%。具體結(jié)果見圖1、圖2、圖3及表1。由表1可知，肉桂、桂枝、桂丁都含有（E）-桂皮醛、古巴烯、α-衣蘭油烯、（1S-順式）-1，2，3，5，6，8α-六氫-4，7-二甲基-1-（1-甲基乙基）-萘等揮發(fā)性成分。特別是（E-）-桂皮醛成分在三者中占比都是最高的，通過HS-SPME-GC-MS檢測(cè)肉桂、桂枝、桂丁（E-）-桂皮醛成分，發(fā)現(xiàn)相同成分含量最高的（E-）-桂皮醛在13.568 min左右有最大吸收，相似度分?jǐn)?shù)大約為99.56%。化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖4，質(zhì)譜和鏡像質(zhì)譜見圖5、圖6。古巴烯在16.345 min左右有最大吸收，相似度分?jǐn)?shù)大約為98.77%。化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖7，質(zhì)譜和鏡像質(zhì)譜見圖8、圖9。

圖7 古巴烯結(jié)構(gòu)式

圖8 古巴烯MS

圖9 古巴烯鏡像MS

表1 肉桂、桂枝、桂丁揮發(fā)性成分比較

圖1 肉桂揮發(fā)性成分總離子

圖2 桂枝揮發(fā)性成分總離子

圖3 桂丁揮發(fā)性成分總離子

圖4 桂皮醛結(jié)構(gòu)式

圖5 桂皮醛MS

圖6 桂皮醛鏡像MS

3 討論

研究結(jié)果表明，肉桂、桂枝及桂丁三者揮發(fā)性成分的組成存在異同，肉桂中揮發(fā)性成分含量最高的為（E）-桂皮醛（32.14%）、古巴烯（29.88%）、（1S-順式）-1，2，3，5，6，8α-六氫-4，7-二甲基-1-（1-甲基乙基）-萘（11.12%）、α-衣蘭油烯（9.12%）、γ-衣蘭油烯（3.72%）等；桂枝中揮發(fā)性成分含量最高為（E）-桂皮醛（87.74%）、古巴烯（2.65%）、（1S-順式）-1，2，3，5，6，8α-六氫-4，7-二甲基-1-（1-甲基乙基）-萘（1.79%）、3-苯基-2-丙烯（1.13%）、α-衣蘭油烯（0.89%）等；桂丁中揮發(fā)性成分含量最高的為（E）-桂皮醛（79.90%）、古巴烯（3.83%）、反式-4-甲氧基肉桂醛（2.75%）、苯乙醇（1.62%）、2-（芐氧基）丙酸乙酯（1.57%）等。三者間的主要揮發(fā)性成分（E）-桂皮醛、古巴烯都是相同的，肉桂與桂枝主要的揮發(fā)性成分相似程度比桂丁大，這可能是由物質(zhì)基礎(chǔ)造成桂丁與肉桂、桂枝功效差異的原因之一。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，桂皮醛具有抗炎作用［15-29］，主要是通過減低MMP-9的表達(dá)，達(dá)到減輕BBB的通透性效果，從而減輕炎癥反應(yīng)。抗病毒作用［20-23］，桂皮醛通過顯著升高IFN-β的量（感染甲型流感病毒的MDCK細(xì)胞上清液中所含物質(zhì)），顯著上調(diào)細(xì)胞中TLR7、IRAK-4、IFN-βmRNA表達(dá)水平從而達(dá)到對(duì)抗病毒作用。抑菌作用［24-27］，桂皮醛的抗菌機(jī)制為破壞細(xì)胞壁多糖結(jié)構(gòu)、破壞細(xì)菌正常的生理代謝或與細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、激素等因子相結(jié)合達(dá)到抑菌殺菌效果。抗腫瘤作用［28-32］，對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞通過增加Bax、Caspase-3的活性及抑制Bcl-2的表達(dá)從而實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用。桂皮醛作為肉桂、桂枝、桂丁的主要有效成分，在含量上肉桂比桂枝、桂丁都低，而桂皮醛作為解熱、鎮(zhèn)痛、通血脈的主要成分，這與桂枝主發(fā)汗解肌功效相通。

肉桂與桂枝、桂丁比較，含有2-亞甲基-5-（1-甲基乙烯基）-8-甲基-雙環(huán)［5.3.0］癸烷（1.30%）、α-二去氫菖蒲烯（0.82%）、（-）-異硫氰酸酯（0.79%）、T-杜松醇（0.49%）、反式-α-佛手柑堿（0.33%）等成分。桂枝與肉桂、桂丁比較，除相同成分外還含有1-（1，5-二甲基-4-己烯基）-4-甲基-苯（0.56%）、α-石竹烯（0.55%）、（E）-1-甲基-4-（6-甲基庚-5-烯-2-亞基）環(huán)己-1-烯（0.45%）、順式-1-羥基-2-吲哚甲酸酯（0.36%）、（1R，5R）-2-甲基-5-（R）-6-甲基庚-5-烯-2-基）雙環(huán)［3.1.0］六角-2-烯（0.33%）；桂丁與肉桂、桂枝相比，還含有反式-4-甲氧基肉桂醛（2.75%）、2-（芐氧基）丙酸乙酯（1.57%）、香豆素（0.77%）、（Z）-2-甲氧基肉桂醛（0.46%）、（-）-馬兜鈴烯（0.36%）、胡蘆烯（0.34%）等不同揮發(fā)性成分。其中肉桂特有的（-）-異硫氰酸酯具有高度的生物活性，具有抗癌、抗腫瘤活性，可以防止多環(huán)芳烴、雜環(huán)胺、亞硝胺等致癌物質(zhì)引起的DNA損傷和癌癥疾病［33］。香豆素?fù)]發(fā)性成分具有抗氧化、抗凝血作用、降血糖作用［34］。通過本研究發(fā)現(xiàn)肉桂、桂枝、桂丁的揮發(fā)性成分存在著異同，物質(zhì)基礎(chǔ)的差異可能是導(dǎo)致三者功效差異的主要原因，對(duì)三者揮發(fā)性成分進(jìn)行比較，為肉桂、桂枝、桂丁的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。