乳制品中主要乳蛋白檢測技術的研究進展

韓靜雯，李國輝，王道兵，鄭淼，鐘其頂

(中國食品發酵工業研究院，北京，100015)

乳制品包括液態乳、乳粉、干酪等許多種類，兼具營養價值和生理功能，是人類飲食的重要組成部分[1]。乳制品不但可以為人體供給營養和能量，還能促進兒童及青少年骨骼的生長發育[2]。此外，由于其可能會引起過敏反應，牛乳已經被聯合國糧食及農業組織和世界衛生組織定為八大食品過敏原之一[3]。蛋白質是乳制品中的重要成分，牛乳中蛋白質含量約為3.0%～3.7%，其中酪蛋白約占牛乳總蛋白的80%[4]，其表型包括αS1-酪蛋白(αS1-casein，αS1-CN)、αS2-酪蛋白(αS2-casein，αS2-CN)、β-酪蛋白(β-casein，β-CN)和κ-酪蛋白(κ-casein，κ-CN)，其中β-CN中被關注較多的是A1 β-CN和A2 β-CN[5-7]。乳清蛋白約占牛乳總蛋白的20%，具有獨特的生化特性和營養功能，含有10%～20%的α-乳白蛋白(α-Lactalbumin, α-La)和40%～50%的β-乳球蛋白(β-Lactoglobulin, β-Lg)，除此之外，還含有乳鐵蛋白和免疫球蛋白[8-10]等。蛋白質的種類和含量直接影響乳制品的品質和營養價值，因此對乳蛋白組分進行更加細化的檢測分析尤為重要。目前已報道的乳蛋白檢測方法有電泳法、酶聯免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)、液相色譜-質譜聯用法(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)等，本文對各類方法進行總結，旨在為相關檢測方法的研發與應用提供參考。

1 電泳法

電泳是在不同粒子所帶電荷不同或電荷相同但荷質比不同的情況下，在同一電場中，隨著時間的推移位移不相同來進行分離的方法。電泳法快速簡便，在諸多方法中，聚丙烯酰胺凝膠電泳在蛋白質分析中應用十分廣泛，包括非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(native-polyacrylamide gel electrophoresis, native-PAGE)和變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)。二者都是通過對染色后的蛋白質進行掃描來實現定量，native-PAGE的分離效果受蛋白質的分子質量、形狀和帶電荷情況影響較大[11]；SDS-PAGE添加了SDS和巰基乙醇變性劑且需要加熱，其分離效果主要受蛋白質的分子質量影響[12]。PESIC等[13]利用native-PAGE對綿羊乳和山羊乳中的牛β-Lg和α-La進行分析，通過2種羊乳中牛β-Lg和α-La的譜帶強度與牛乳在其中摻加量的線性關系，能夠快速測定羊乳中牛乳清蛋白的含量。韓奕奕等[14]等通過一系列SDS-PAGE實驗確定了乳制品中β-Lg測定的電泳條件，可對乳制品中β-Lg 的含量進行快速測定。雖然這2種方法被廣泛用于蛋白質的研究，但由于其著色劑和脫色劑需要現配現用導致方法的重現性難以保證。通過對PAGE條件的不斷改良，使用尿素-PAGE可在不進行更復雜的表型鑒定的情況下鑒別牛乳中的A1 β-CN和A2 β-CN[15]。

毛細管區帶電泳(capillary zone electrophoresis, CZE)簡化了添加緩沖液的操作，縮短了樣品分析時間，可在與生理條件相近的情況下對乳蛋白組分進行分離，避免蛋白質在分析過程中發生降解[16]。利用CZE可對液態乳和乳粉中的酪蛋白進行分離并對α-CN、 β-CN、κ-CN進行定量，還可以通過對β-CN的A1和A2表型的定量檢測，得到優質蛋白在總酪蛋白中的占比從而對乳制品質量進行評價[17-18]。與PAGE相比，CZE具有更高的靈敏度，自動化程度高，所需樣品量少，可以分離不帶電荷或帶相反電荷的蛋白質，但電滲現象受被測物質組成影響較大，重現性差。

除此之外，等電聚焦(isoelectric focusing, IEF)是在PAGE的基礎上通過調整pH梯度實現對目標蛋白質的分離檢測。在不需要通過酸或酶促沉淀來消除乳清蛋白的情況下，使用IEF技術可鑒別散裝和單個牛乳樣品是否為A2 β-CN乳，簡化了檢測牛乳中β-CN不同表型相對比例的步驟[19]。將IEF凝膠圖像分析與生物分析儀定量技術相結合可以更加全面地對乳制品中的蛋白質組分進行鑒別，并進一步對蛋白的多態性進行探究，明確其蛋白表型(αS1-CN, αS2-CN, β-CN, κ-CN, β-Lg, α-La)并量化分析[20]。

電泳技術也在向著高通量和高重復性發展，將IEF和SDS-PAGE結合產生的雙向凝膠電泳(two-dimensional electrophoresis, 2-DE)可通過等電點和分子質量對蛋白質進行分離，獲得更加全面、分辨率更高的譜圖[21]，目前在差異蛋白質檢測中應用十分廣泛。在不斷的實踐中對于實驗樣本的多樣性和2-DE技術的操作復雜性問題，有針對性地進行改良和優化將為電泳技術的進一步發展和應用提供更大的空間。

2 酶聯免疫法

ELISA是使與酶連接的抗原或抗體與目標抗體或抗原產生反應，再根據顯色程度進行定性、定量的方法，具有高靈敏性、高特異性、高通量等優點[22]，可用于檢測樣品中含量較低的目標蛋白，在臨床化學、藥理學和生物標志物分析等方面應用廣泛，常見分類有間接ELISA、直接ELISA、競爭ELISA[23]。間接ELISA可使用單克隆抗體對不同品種乳制品中特定乳蛋白進行特異性檢測，在此基礎上與聚合酶鏈式反應相結合可對羊乳中摻雜1%以上的牛乳進行特異性分析，且與羊乳無交叉反應[24]。李媛媛等[25]使用間接競爭ELISA，把兔抗αS-CN多克隆抗體作為一抗，標記辣根過氧化物的羊抗兔免疫球蛋白作為二抗，以此放大一抗信號，增加靈敏度，成功實現了牛乳中的αS-CN的檢測。與間接競爭法相比，雙抗體夾心法對目標蛋白質的檢測靈敏度更高，識別靶向蛋白的抗體群的性質與不同ELISA方法的特殊性影響樣品中乳蛋白的測定[26]。ELISA方法設備成本低、檢測速度快、易于使用、便于樣本批量處理，目前多數應用于乳制品中過敏原蛋白的檢測。

傳統免疫分析與電化學分析相結合形成的電化學免疫法更加快速、靈敏，僅需要適當的緩沖液稀釋即可進行測定。例如，測定β-Lg含量的三明治結構的磁免疫傳感器[27]，將β-Lg共價固定在活化的磁珠上，磁珠被羧基修飾，用辣根過氧化物標記β-Lg作為抗原，將抗體放置在一次性絲網印刷碳電極表面進行捕獲，檢出限可達0.8 ng/mL，可以應用于不同乳源乳制品中β-Lg的檢測。此外，基于IgE線性表位的單克隆抗體和過氧化氫酶介導的熒光夾心酶聯免疫法，可對嬰幼兒配方乳粉中β-Lg進行測定，方法的檢出限為7.81 ng/mL[28]。免疫分析方法特異性極強，許多快速可靠的ELISA檢測試劑盒也已經進入市場，但該方法制備新靶點抗體的過程較為復雜，而且對樣品的要求較高[29]，其高特異性的特點也使得只能對單一蛋白質進行檢測。

目前，免疫法廣泛應用于羊乳、駱駝乳、驢乳等不同奶源乳制品的牛乳摻假檢測中，能夠實現乳制品相互摻假的現場快速檢測，確保乳制品的品質與真實性，而更高的靈敏度和更低的檢出限在免疫法的發展與實際應用中將成為必然要求。

3 高效液相色譜法

HPLC在乳蛋白的檢測方面應用廣泛，對于不同研究目的和蛋白組分的測定已有大量的研究報道(表1)，通常采用熒光或紫外吸收進行定量，方法重現性好[30]。FERREIRA等[31]對不同乳源混合物中同源β-Lg進行了測定，建立了檢測乳制品和乳酪中綿羊乳、山羊乳和牛乳含量的一種非常靈敏且準確的方法，檢出限為2%。研究者通過對前人的方法進行改良開發了一種新的反相高效液相色譜法(reversed-phase HPLC,RP-HPLC)，用于分離和定量牛乳蛋白的不同表型(αS1-CN, αS2-CN, A1 β-CN, A2 β-CN, κ-CN, α-La, β-Lg)。該方法可同時分離和定量所有目標蛋白，可有效評價乳蛋白的組成。對水牛乳中乳蛋白的分析結果顯示，水牛乳蛋白中αS1-CN, αS2-CN, β-CN, κ-CN分別占總酪蛋白含量的32.2%、15.8%、36.5%和15.5%，而β-Lg的含量約為α-La的1.3倍[32-33]。通過進一步對RP-HPLC檢測方法的優化，可在30 min內對牛乳中的主要蛋白質(α-CN, β-CN, κ-CN, α-La, β-Lg)進行分離和定量，檢出限在0.08～0.28 g/L，可用于商品牛乳中蛋白質含量的測定[34]。并且可以從已知基因型的單個動物乳汁樣本中提取純基因變體，在30 min內對樣品中目標蛋白質的不同基因變異體進行分離和定量，以評價目標蛋白質多態性對蛋白含量的影響[35]。盡管目前通過不斷的改良和發展，在一定程度上縮短了檢測時間，但大多數方法仍需要至少15 min清洗和平衡色譜柱[30-35]。

表1 高效液相色譜法檢測乳品中乳蛋白

在傳統HPLC的基礎上，超高效液相色譜(ultra-performance liquid chromatography，UPLC)技術無論檢測速度、分離效果都得到了進一步的提升。BOITZ 等[36]運用UPLC技術快速地測定了牛乳中的β-Lg含量，并通過β-Lg含量來區分液態牛乳的不同熱處理方式，方法檢出限和定量限分別為7 mg/L和23 mg/L， 總運行時間為3 min，比以往的方法更加迅捷。

HPLC在蛋白質分離純化中的優異性使得這項技術在蛋白質組學研究中發揮著重要作用，同時，復雜多樣的實驗樣品也對其提出了更高的要求，推動了HPLC的進一步發展。作為蛋白質檢測中不可或缺的關鍵技術手段，通過與質譜等其他技術相結合，在保證準確性的基礎上縮短檢測時間，實現對蛋白質定性和定量的目的。

4 液相色譜-質譜聯用法

質譜已發展成為分離科學中最流行和最實用的檢測技術之一，質譜檢測技術的引入使得蛋白質分析得到重大改進，它具有獨特的選擇性，并且能夠獲得高度結構特異性的信息[37]。LC-MS可以在蛋白質水平或者肽段水平實現對蛋白質的絕對定量，即可以對完整的蛋白質或者酶解產生的特征肽段進行定量分析，測定時間短，檢出限低，動態范圍寬，在乳蛋白檢測鑒別中的應用越來越廣泛(表2)。現有研究提出了一種快速制樣(有機溶劑提取、酸沉淀、離心)與LC-MS分析相結合的檢測方法，用于檢測牛乳摻入水牛乳和馬蘇里拉奶酪的問題，該方法能夠在15 min內完成樣品分析，同時能夠在每次運行中完全識別β-Lg的變體，對乳蛋白定量也可應用于摻假鑒別中[38]。MIRANDA等[39]用RP-HPLC-MS對6種乳蛋白(αS1-CN, αS2-CN, β-CN, κ-CN, α-La, β-Lg)進行了測定，旨在建立乳制品特征蛋白的質量數據庫，方法對主要亞型的觀測質量和理論質量之間的差異非常小，平均低于0.35 Da。可通過LC-MS的方法鑒定牛乳中3種β-CN變異體A1、A2和I，使得蛋白表型的分析更加細化，其中A2 β-CN在幾種被發現的表型中比例最高，占β-CN的48.2%[40]。

表2 液相色譜-質譜聯用法檢測乳制品中乳蛋白

盡管LC-MS具有高靈敏度和高選擇性，但基質效應可能會影響方法的準確性。加入內標可適當消除基質效應的影響，理論上，最優的內標是被同位素標記的目標蛋白或類似物。CZERWENKA等[41]使用LC-MS定量分析牛乳中的β-Lg，在樣品制備過程中，先后引入山羊β-Lg和水牛β-Lg作為內標，來補償整個實驗中前處理損失和基質效應。REN等[42]以人乳清蛋白作為內標建立了同時對牛乳中α-La和β-Lg定量的超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)，在6 min(總運行時間8 min)內完成了對乳清蛋白的分離檢測，提高了測量精度、準確性和重現性，回收率為94.9%～98.7%，可用于鑒別和定量生物基質中天然形式的蛋白質。

目前，使用LC-MS檢測乳制品蛋白的方法越來越成熟，從對完整蛋白質的檢測發展為對酶解后特征肽段的檢測，并以此為依據進行定量[43]。ANSARI等[37]建立了一種基于固相微萃取的LC-MS方法，重點對α-CN、β-CN、α-La和β-Lg用胰蛋白酶消化后獲得的肽段(5～12個氨基酸)進行分析，考慮了摻假混合物中不同濃度的乳蛋白，此方法對不同食品樣品中天然乳蛋白進行定性、定量分析。KE等[44]建立了一種針對牛乳制品和羊乳制品中4種酪蛋白(αS1-CN, αS2-CN, β-CN, κ-CN)和2種主要乳清蛋白(α-La, β-Lg)的UPLC-MS/MS方法，分析了6種乳蛋白的特征性多肽，并用同位素標記的特征肽段作為內標補償基質效應，方法重現性良好。

基于質譜技術的蛋白組學對乳蛋白的定量分析通常包括樣品前處理、蛋白質提取、蛋白酶酶解、質譜儀檢測和數據分析五部分。其中蛋白質定量方法常用的有同位素標記相對和絕對定量技術 (isobaric tags for relative and absolute quantification, iTRAQ)，串聯質譜標簽技術(tandem mass tag, TMT)和無標定量技術(label-free quantification)[45-46]。iTRAQ 可用于乳蛋白質組差異分析[47-48]，TMT和其原理相近但通量更高，二者被廣泛應用于乳蛋白定量。相較于有標定量昂貴的試劑盒，無標定量只需要分析大量質譜數據，比較相應肽段在不同樣品中的信號強度即可實現相對定量。但無標定量要求儀器保證較高的重復性，為保證結果的可靠性需要進行足夠的技術重復。數據非依賴型的質譜采集技術結合傳統鳥槍法，在數據依賴型采集的基礎上建立成為當下最熱門的質譜技術之一[49]，可以實現良好的重復性、高通量、高準確性，并在逐漸發展中出現了一種新興技術——全碎片離子順序窗口化獲取質譜，將蛋白質組深度覆蓋能力與定量一致性和準確性相結合[50]。但這2種技術對于分析算法要求高，需要結合相應的分析軟件對質譜圖進行解析。

通過將不同技術方法應用于不同種類質譜儀，并結合生物信息學數據分析方法，將幫助研究者們更加深入全面地實現對乳制品蛋白組學的研究。

5 小結

明確乳制品中蛋白質的組分和含量是評價乳制品的營養價值、過敏特性以及真實性的基礎。世界各國都十分重視如何強化乳制品的營養成分和如何降低其致敏性，尤其在“健康中國2030”的背景下，國家大力倡導乳制品的消費，都使得諸多學者將目光著眼于如何更快、更簡潔地分離檢測更多種類的乳蛋白。由總蛋白含量檢測逐步過渡到蛋白組分的分析，利于完善乳制品的品質科學評價與表達，并可預防乳制品真實性問題的出現，保障消費者和誠信企業的合法權益。對于乳蛋白的檢測分析，ELISA法雖然方便快捷、特異性好，但是卻存在交叉反應和無法同時對多種乳蛋白進行檢測的問題；電泳法和HPLC法可獲得較多的成分信息，但部分電泳法的重復性有待進一步提升，HPLC法單次分析時間長，且需花費較長的時間對色譜柱進行維護。LC-MS法在蛋白組學研究領域發揮著自身的優勢，相較于以上幾種檢測方法，LC-MS法的靈敏度更高，檢出限低，能夠在較短的時間內獲得大量的信息，但儀器設備價格昂貴對其推廣造成了一定的阻礙。在乳蛋白檢測分析的實際應用中可根據檢測需求將不同的檢測方法進行整合優化，開發更加快捷、穩定、靈敏的檢測技術，提升方法的適用性和時效性，支撐乳蛋白組分的精細化分析。