天山花楸葉黃酮提取物抗心肌缺血再灌注損傷作用機理分析

林偉，熊尚全

福建中醫藥大學附屬人民醫院心血管內科，福建福州 350000

抗心肌缺血再灌注損傷（MIRI）為臨床常見現象，對機體危害性強，極易導致病死[1]。MIRI 是加重心肌梗死的重要原因。為預防病死，應進行促進心肌血氧供恢復治療[2]。血供恢復中極易造成再灌注損傷，加重細胞損傷，或致不可逆損傷，在此過程中心肌代謝、心功能和電生理功能等都可能加重受損，出現心肌梗死范圍擴大、心律失?；蛐募〗M織缺血性壞死[3]。天山花楸葉是新疆地區出產的天然藥材，常用于咳、喘、痰瘀等治療。現代研究顯示，該藥可舒張心肌血管，改善心肌缺血[4]。相關研究證明黃酮類成分可治療心肌缺血和抗氧化，但對天山花楸葉中所含有的黃酮提取物在MIRI 治療中的作用機制研究較少[5]。該文選取2020 年1 月—2021 年1 月大鼠試驗樣本50 只，以網絡藥理學為主要方法，篩選藥物化合成分，定位抗MIRI 的有效成分和作用靶點，評價其藥效學作用?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

①試劑：選用自制91%質量分數的天山花楸總黃酮。鹽酸、氯化鎂、氯化鈣、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、碳酸氫鈣等選用國產試劑。mPTP 孔抑制劑選用CDZ，用于陽性對照。SOD、T-AOC 線粒體制備試劑盒。

②樣本：選用SD 大鼠（雄性）作為試驗體樣本，符合動物實驗要求。提前1 周領取樣本適應環境，分籠飼養，自由飲食。

③設備：使用離心心臟灌注設備、天平、多功能酶標儀、超聲波清洗器以及超低溫冰箱、離心機、切片機、勻漿機等標準操作儀器設備。

1.2 方法

1.2.1 試劑調配 配制K-H 灌流液、肝素鈉溶液、總黃酮溶液、CDZ 溶液和水合氯醛溶液。

1.2.2 明確藥物靶標 根據ADME/T 標準篩選有效化合物以及核心靶標，定位藥物靶標，構建相關互動網絡與大鼠心肌缺血再灌注損傷模型。

1.2.3 用藥方法 ①對照組（n=10）：使用K-H 灌注液給藥，在恒壓狀態下進行110 min 灌注。②模型組（n=10）：K-H 液20 min 灌注，予以20 min 全心停灌，然后予KH 液60 min 復灌。③高劑量FST 組（n=10）：予K-H 液20 min 灌注，再灌注10 min 總黃酮，劑量為1.5 mg/L，然后停灌20 min，K-H 液復灌60 min。④低劑量FST 組（n=10）：予K-H 液20 min 灌注后，使用0.5 mg/L 金絲桃苷實施10 min 灌注，停灌20 min，K-H 液復灌60 min。⑤CDZ 組（抑制劑組）（n=10）：予K-H 液20 min 灌注，1 μmol/L 含抑制劑 灌注液灌注20 min，停灌20 min，K-H 液復灌60 min。

1.3 觀察指標

檢測血流動力學情況、梗死面積，進行病理檢查，分析FST 預處理和氧化應激、mPTP 孔開放相關性。

1.4 統計方法

采用SPSS 24.0 統計學軟件分析數據，計量資料用（）表示，比較采用t 檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 篩選化合物

天山花楸葉可提取化合物62 個，從中篩選獲得34個候選化合物。候選化合物中，金絲桃苷和蘆丁口服用藥時難以被有效利用，然而含量豐富，藥理學活性較廣，其余成分類藥性較好，口服用藥生物利用率較高。在上述成分中，靶點數目較高度分子包括黃酮類、有機酸類和揮發油類3 種。上述分子可針對多靶點起效，藥理活性多樣化。小鼠實驗證明，該藥粗提物可活化超氧化物歧化酶，抑制丙二醛與乳酸脫氫酶，緩解ISO 引起的急性缺血損傷。相關試驗顯示，天山花楸醋酸乙醇提取物可抗MIRI，其揮發油成分可對至少9 種病菌產生抑制作用。

2.2 化合物與靶標和疾病關系分析

利用數據庫篩選34 個候選化合物的靶標，通過對839 個靶標去重處理，總計265 個靶標。靶標度值降序排序，篩除度值＜4 的靶標，其中與候選化合物相關性密切的靶標為78 個。利用數據庫篩選靶標相關疾病，總計31 類443 種，32 種與心血管疾病相關，29 個靶標（占比37%）關于心血管疾病。經分析，TSPO 是心肌缺血關鍵靶點，黃酮類化合物是核心化合物。

2.3 靶標蛋白分析

針對34 個相關化合物構建靶標蛋白互作網絡予以分析，可確定TSPO 為關鍵靶點，該靶點和黃酮類化合物具有緊密聯系。TSPO 屬于苯二氮卓類受體，在心血管病程中和氧化應激反應中具有影響作用。相關文獻顯示，TSPO 可通過調節呼吸鏈、線粒體膜電位調控線粒體功能，對ATP 水解、合成產生影響，ROS 形成與促凋亡蛋白也受其影響。

mPTP 孔開放抑制可通過TSPO 抑制實現，心肌血氧供應阻斷或再灌注導致能量代謝異常，減弱ATP 依賴型質子泵作用，造成線粒體跨膜電位減弱和失衡。多因素影響下，mPTP 開放性增強，提升線粒體膜通透性，消除或減弱線粒體跨膜電位，繼而增強mPTP 開放性，形成不良循環。為抑制mPTP 開放，可抑制TSPO，抑制氧化過激，調節線粒體膜電位和細胞鈣離子，預防鈣超載，促進線粒體ATP 穩定供應，降低ROS 活性，對再灌注損傷予以防控。

2.4 血流動力學分析

針對大鼠MIRI 進行建模，可知再灌注后，樣本心肌細胞舒縮水平在模型組中降低，高劑量FST 組和低劑量FST 組輸送功能增強，CDZ 組有一致性表現，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組血流動力學指標比較（）

表1 各組血流動力學指標比較（）

注：較之對照組，*P＜0.05，**P＜0.01；較之模型組，*P＜0.05，**P＜0.01，1mmHg=1.333 Pa

2.5 TTC 染色心肌梗死影響分析

對照組心肌梗死面積占比為（2.21±0.13）%，模型組占比為（72.03±6.82）%，模型組占比較高，差異有統計學意義（F=41.579，P=0.011）。高劑量FST 組占比（46.19±4.58）%，低劑量FST 組為（62.71±5.29）%，抑制劑組為（50.24±4.80）%，上述各組與模型組比較，差異有統計學意義（F=47.62，P=0.013）。提示上述用藥方式皆可促進心肌組織保護，緩解心肌梗死。在眾組中，高劑量用藥效果較先顯著，差異有統計學意義（F=51.403，P=0.017）。見表2。

表2 各組心肌梗死面積比較[（）,%]

表2 各組心肌梗死面積比較[（）,%]

2.6 HE 染色分析

對樣本進行HE 染色處理，借助顯微鏡分析心肌組織病理切片。樣本觀察顯示：

①對照組未見細胞形態顯著異常，心肌細胞處于有序排列狀態，結構相對完整，可見清晰肌纖維橫紋，未見炎癥性腫脹、壞死發生，未發生肥大或萎縮，具有較完整的長橢圓核形態。觀察細胞外膜、間質和相關血管，皆為正常狀態。

②觀察模型組樣本時，可見心肌發生明顯病理變化，細胞排列紊亂且稀疏。心肌細胞出現腫脹狀態，肌纖維間隙擴大，肌纖維橫紋發生斷裂跡象或消失。部分心肌細胞發生局灶性壞死或崩解，可見心肌細胞間質出現充血，發生炎性細胞浸潤。

③觀察高劑量組可見心肌病理變化緩解，肌纖維排列稍顯稀疏但較整齊，可見輕度腫脹，未見局灶性水腫或脂肪變性，心肌纖維未見斷裂表現，炎性細胞影響范圍縮小。

④在低劑量組中，對比模型組，心肌病理變化較弱，纖維排列稍見稀疏和紊亂，水腫程度較輕。炎癥細胞浸潤、纖維橫紋斷裂、消失的情況較輕。

⑤在抑制劑組中，心肌病理變化緩解，細胞整齊排列，肌纖維較稀疏，可見輕度細胞腫脹，未見局灶性細胞脂肪變性，少見炎癥細胞浸潤，未發生肌纖維斷裂情況。

2.7 心肌氧化應激反應與FST 相關性分析

FST 可提升心肌組織抗氧化水平，抑制再灌注損傷。較對照組，模型組SOD、CAT 等活性減弱，差異有統計學意義（F=46.221、44.159，P=0.020、0.024），MDA 活性增強，差異有統計學意義（F=40.735，P=0.021）。較模型組，其余各組CAT、SOD 活性增強，MDA 活性較弱，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組心肌氧化應激指標比較[（）,U/mg]

表3 各組心肌氧化應激指標比較[（）,U/mg]

2.8 大鼠mPTP 孔開放和黃酮提取物的相關性分析

mPTP 孔開放條件是CaCl2達到200 μmol/L，在此條件下，線粒體A520 指標下降。較之模型組，各組可有效抑制mPTP 開放，緩解線粒體腫脹。

3 討論

3.1 中草藥對心血管疾病的適用性

在現代，心血管疾病是威脅生命安全的高發病。相關研究顯示，心血管疾病病死率在現代疾病中占比最高[6]。導致心血管疾病發生的原因較多，遺傳因素、飲食，以及肥胖等，均為關鍵因素。一旦疾病發生，患者極容易死亡。在因病死亡人群中，超過40%是因心血管病死亡[7]。為降低病死率，有效防控心血管疾病具有必要性。生活習慣、飲食結構不良是心血管疾病的常見消極因素，通過促進健康作息與飲食可促進預防，在其治療中，需要積極探索不良反應低、藥效顯著的藥物[8]。中草藥屬于天然藥物，此類藥物自然生成，不同藥材成分和藥效各異，為疾病治療提供助力。通過中草藥研究，研究者們從藥物提取物中發現更多可用于心血管病癥治療的有效成分[9]。

3.2 缺血性心臟病的臨床特點

缺血性心臟病是現代常見高病死率疾病，對生存質量和存活期有顯著消極影響。在臨床治療中，可采用介入療法、用藥治療或采用超聲療法，也可進行基因治療。藥物治療風險較低，適用范圍廣，為常用手段。為此，醫學研究致力于發掘對癥藥物，促進有效治療[10]。

心肌血氧供應中斷或不足對心肌細胞器、心肌酶結構、細胞結構變化有不良影響，損傷心肌功能，分析其內在原因，是因缺血誘發細胞鈣超載，導致自由基含量提升，影響線粒體能量無法常規合成[11]。因血氧缺失影響出現線粒體損傷，此種損傷蔓延，對細胞宏觀功能造成破壞。在抑制和修復缺血性損傷時，治療要點是促進血供恢復[12]。有研究人員對狗進行心肌缺血損傷治療試驗，在試驗中，結扎狗冠狀動脈，使其持續缺血，然后解除結扎恢復血供，血流灌注恢復較突然，該過程引起室顫，造成狗死亡[13]。

3.3 MIRI 治療理念與黃酮類化合物應用

醫學研究進展后，有研究者提出MIRI 概念，醫學研究認為，心肌缺血后血供恢復過程極易發生重癥損傷，導致心肌細胞發生結構和功能等變化，影響常規代謝，此種損傷較之缺血損傷更嚴重，或見不可逆損傷[14]。醫學研究顯示，黃酮類化合物可改善心腦組織缺血問題，對組織氧化和衰老具有抑制作用，還可抑制腫瘤和炎性反應，對氧自由基具有清除作用，還可提升免疫力。相關文獻顯示，在MIRI 預防中黃酮類化合物可發揮有效作用[15]。

3.4 該次研究發現

該次研究中，以天山花楸葉為研究對象，提取其化合物，應用軟件建模，分析化合物與靶標和疾病之間的相關性，經過研究可知靶標中和心血管疾病聯系密切的成分總計29 個，29 個靶標中TSPO 為核心靶標，直接影響心肌缺血，黃酮類化合物是核心化學物分子。針對心血管疾病和相關靶標蛋白創建互作網絡進行驗證，顯示TSPO 為核心靶點。該靶點可對線粒體功能進行調節，對線粒體電位造成影響，并可影響能量代謝過程。為對線粒體膜mPTP 孔進行開放干預，可抑制TSPO，促進mPTP 孔閉合，通過此干預穩定線粒體膜電位，避免發生鈣超載，減少氧自由基產生，緩解再灌注損傷，調節能量代謝狀態。

該研究經提取物用藥后分析顯示，心肌梗死情況在高劑量組中得到有效抑制，心肌梗死面積控制在46.19%左右。同類研究中，使用高劑量后也可見一致性表現，在該研究中，高劑量用藥后心肌梗死面積為46.22%左右[16]。

3.5 用藥方案深度分析

通過模型構建，監測再灌注全周期中血流動力學變化[16]，對比模型組，顯示從天山花楸葉中提取的黃酮化合物可顯著增強心肌收縮力和心功能，降低再灌注損傷。分析TTC 染色結果，高劑量預處理可緩解再灌注誘發的心肌梗死，縮小損傷面積。

切片觀察心肌組織顯示，高劑量預處理可修復再灌注后心肌細胞腫脹，緩解炎性細胞浸潤問題，抑制心肌纖維斷裂。經過心肌組織病理分析可直觀了解心肌組織在再灌注中發生的損傷。再灌注發生時，線粒體無法常規進行氧化磷酸化過程，中性粒細胞發生大規模聚集，加之黃嘌呤在水解過程中過度生成活性氧自由基，導致膜脂過氧化作用加重，通透性增強，酶與蛋白質受損，結構功能由此發生變化，核酸、染色體受到攻擊，加速細胞凋亡[17]。

為分析氧自由基造成的心肌組織損傷，對MDA 指標、SOD 指標以及CAT 指標進行檢測。通過T-AOC 分析可評價心肌組織宏觀抗氧化水平。當鈣離子超載時，線粒體膜中mPTP 受此影響開放，粒子中＜1 500 質量的部分大量透過mPTP 在線粒體基質中發生作用并提升線粒體滲透壓，誘發線粒體水腫，此種腫脹導致細胞能量代謝異常加重，心肌組織因此受損。較之模型組，CDZ 組、FST 預處理用藥等可抑制mPTP 孔開放，緩解鈣超載以及細胞腫脹導致的細胞損傷，對心肌細胞產生保護作用[18]。

綜上所述，天山花楸葉中提取的黃酮化合物可調節心肌舒縮水平，縮小心肌梗死面積，緩解心肌細胞腫脹，抑制氧化應激損傷。對TSPO 靶標蛋白對癥施加影響后，線粒體mPTP 孔開放得到有效抑制，線粒體腫脹顯著緩解，能量代謝優化，防控再灌注損傷。