基于網絡藥理學探析補中益氣湯治療變應性鼻炎的作用機制

戚媛媛 韓秀麗 王旗旗 楊祺 王玉明

摘要 目的：基于網絡藥理學探析補中益氣湯治療變應性鼻炎的作用機制。方法：通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）篩選得到補中益氣湯的化學成分和作用靶點，同時利用GeneCards數據庫獲得與變應性鼻炎治療相關的靶基因，利用Cytoscape3.7.1軟件將所獲得數據進行“藥物-成分-疾病-靶點”網絡可視化模型構建，使用STRING數據庫構建共有靶基因的蛋白質-蛋白質相互作用（ PPI）網絡，最后采用R軟件以P<0.05、Q<0.05進行關鍵靶基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG） 功能富集分析。結果：篩選出補中益氣湯有效活性成分172個，其治療變應性鼻炎的機制可能與IL6、VEGFA、JUN、MMP9、MMP2等核心靶蛋白密切相關，推測其主要通過參與IL-17、TNF、HIF-1、Toll樣受體、PI3K-AKT、核因子κB、MAPK、Th1和Th2細胞分化、JAK-STAT等信號通路干預調控變應性鼻炎。結論：本研究揭示了補中益氣湯治療變應性鼻炎多基因、多靶點、多通路的網絡調節機制，從整體角度闡述了中醫藥有效的作用機制，為下一步實驗研究提供分子層面的思路。

關鍵詞 補中益氣湯;變應性鼻炎;網絡藥理學;藥物活性成分;靶點;網絡可視化模型;蛋白質-蛋白質相互作用網絡;通路富集分析

Abstract Objective：To study the mechanism of Buzhong Yiqi Decoction in the treatment of allergic rhinitis based on network pharmacology.Methods：The chemical components and targets of Buzhong Yiqi Decoction were screened according to the traditional Chinese medicine system pharmacology database and analysis platform（TCMSP） database platform.Meanwhile，gene card database was used to obtain the target genes related to the treatment of allergic rhinitis.The network visualization model of drugs，components，diseases and targets was built by using the software of Cytoscape 3.7.1.The PPI network of protein interaction of common target genes was constructed by using STRING database.Finally，the function enrichment analysis of key target genes GO and KEGG was carried out by using R software（P<0.05） Q<0.05 was for functional enrichment analysis of key target genes GO and KEGG.Results：A total of 172 active components of Buzhongyiqi Decoction were screened out.The mechanism of its treatment of allergic rhinitis may be closely related to IL6，VEGFA，JUN，MMP9，MMP2 and other core targets.It is speculated that it mainly participated in the regulation of allergic rhinitis through signal pathways such as IL-17，TNF，HIF-1，Toll like receptor，PI3K-AKT，NF-κB，MAPK，Th1 and Th2 cell differentiation，JAK-STAT etc.Conclusion：This study reveals the network regulation mechanism of Buzhong Yiqi Decoction in the treatment of allergic rhinitis，and explains the effective mechanism of TCM from a holistic perspective，and provide molecular thinking for the next step of experimental research.

Keywords Buzhong Yiqi Decoction; Allergic Rhinitis; Network Pharmacology; Pharmaceutical Active Ingredients; Target; Network Visualization Model; PPI Network; Pathway Enrichment Analysis

中圖分類號：R276.1文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.20.005

變應性鼻炎（Allergic Rhinitis，AR）又稱變態反應性鼻炎，是特應性個體接觸變應原后導致的包含IgE介導的炎癥介質的釋放和多種免疫活性細胞、細胞因子參與的鼻黏膜慢性炎癥性疾病。本病為耳鼻咽喉科常見疾病之一，據WHO公布數據，目前全世界有近6億變應性鼻炎患者，且隨著國家工業化程度的提高而呈現出不斷上升的趨勢[1]。在美國2015變應性鼻炎臨床指南中，強推薦的藥物為鼻內糖皮質激素和第二代口服抗組胺藥，但均存在以緩解癥狀為主而難以根治的局限性[2]。中醫基于整體觀和辨證論治的診療思路，采用中藥復方治療的手段，在臨床上取得了顯著的療效。

補中益氣湯出自金代李東垣《內外傷辨惑論》，具有健脾益氣，升陽舉陷之功效，其藥物組成包括：黃芪、白術、陳皮、升麻、柴胡、人參、甘草、當歸。肺、脾、腎虧虛是變應性鼻炎發病的重要內因，而其中脾虛這一證型發病率相對最高[3]。現代研究表明[4]，補中益氣湯有調節脾、胃、腸功能，調節免疫功能、抗過敏及調節應激反應等作用，臨床上廣泛運用于AR治療且療效確切，強調其藥理學研究有利于進一步充實完善中醫理論，使其在指導AR治療方面有據可循。

網絡藥理學是基于系統生物學的理論，通過對生物系統的網絡分析，選取特定信號節點進行多靶點藥物分子設計的新學科[5]。網絡藥理學強調對信號通路的多途徑調節，可以從多途徑、多成分、多靶點的角度闡明中藥研究的基礎理論，并結合分子功能、生物學過程分析，對分子層面的作用機制進行解釋，為中藥現代化研究提供了全新的思路。本研究擬通過網絡藥理學探析補中益氣湯對AR的治療作用及其作用機制，為補中益氣湯對AR的治療提供細胞分子層面的參考。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 藥物成分及其作用靶點篩選 在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中檢索補中益氣湯中的藥物，并結合文獻收集藥物的化學成分及靶點信息。口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）和類藥性（Drug Likeness，DL）是評價一個化合物是否可以發展成為一個藥物的重要指標[6-7]。根據相關研究，本研究選取同時滿足OB≥30%、DL≥0.18的化學成分作為候選活性成分，并使用Uniprot數據庫，將靶點名稱進行矯正統一。對白術、柴胡、陳皮、當歸、甘草、黃芪、人參、升麻的有效成分進行篩選，結合文獻[8-11]補充納入白術中的白術內酯，柴胡中的柴胡皂苷A、柴胡皂苷D，陳皮中的橙皮苷，當歸中的阿魏酸，甘草中的18β-甘草次酸。

1.2 AR作用靶點篩選 基于GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/）包含治療疾病相關的基因的信息與蛋白質靶標，使用GeneCards數據庫以“Allergic Rhinitis”為關鍵詞進行檢索，獲得AR相關的作用靶點。

1.3 藥物-疾病共同靶點的篩選 于Venny2.1在線軟件作圖工具平臺分別錄入補中益氣湯與AR的靶點，將二者比較取交集，并繪制韋恩圖，得到藥物與疾病的共同靶點。

1.4 網絡可視化模型的構建及分析 利用Cytoscape3.7.1軟件，構建“藥物-成分-疾病-靶點”相互作用網絡圖，基于可視化模型相關網絡特征值數據進行后續分析。

1.5 構建蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡 將所得藥物-疾病共同靶點輸入到STRING數據庫（https：//string-db.org/）中進行檢索，選取置信度（minimum required interaction score）>0.4，構建PPI網絡，并根據蛋白之間的關聯度進行排序。在Venny 2.1在線軟件作圖工具平臺上輸入233個藥物靶點、1 404個疾病靶點，繪制韋恩圖。將補中益氣湯中172個潛在活性成分與109個藥物-疾病共同靶點輸入Cytoscape軟件中，刪除與靶點無交集的成分，繪制出“藥物-成分-靶點-疾病”相互作用的網絡圖。在STRING數據庫中錄入上述109個共同靶點，將物種（Organizm）設置為人類（Homosapiens），分析得到PPI網絡。

1.6 通路富集分析 在R軟件安裝Bioconductor軟件包“org.Hs.eg.db”并運行，將藥物-疾病共同靶點轉換成entrezID。然后于R軟件安裝“ClusterProfiler”包，根據已轉換的entrezID，以P<0.05、Q<0.05進行關鍵靶基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）功能富集分析，以探索補中益氣湯治療AR的潛在生物學效益，并將結果以條形圖的形式輸出。

2 結果

2.1 補中益氣湯活性成分及藥物靶點 共得到有效活性成分172個，共篩選出233個藥物靶點。

2.2 AR相關靶標獲得 以“Allergic Rhinitis”為關鍵詞在GeneCards數據庫進行檢索，獲得AR相關靶點1 404個。

2.3 藥物-疾病共同靶點獲得 在Venny2.1在線軟件作圖工具平臺上輸入233個藥物靶點、1 404個疾病靶點，繪制韋恩圖，二者取交集后獲得藥物-疾病共同靶點109個。見圖1。

2.4 藥物-成分-靶點-疾病 將補中益氣湯中172個潛在活性成分與109個藥物-疾病共同靶點輸入Cytoscape軟件中，刪除與靶點無交集的成分，繪制出“藥物-成分-靶點-疾病”相互作用的網絡圖。見圖2。圖2中紫色代表藥物，藍色代表補中益氣湯中的133種活性成分（39個活性成分靶點與疾病靶點無交集，刪除），綠色代表109個共同靶點，紅色代表疾病。Degree值越大說明該成分在治療AR中發揮越顯著的作用，根據Degree值篩選出排名前10的活性成分，用于補中益氣湯的潛在藥效成分以進一步研究。見表1。

2.5 藥物-疾病共同靶點PPI網絡 在STRING數據庫中錄入上述109個共同靶點，將物種（Organizm）設置為人類（Homosapiens），分析得到蛋白相互作用的PPI網絡。圖3中每條邊代表蛋白與蛋白之間的相互作用關系，線條越多代表關聯度越大，則提示該靶點在AR治療中越起到核心的作用，將得到PPI圖中的靶點進行排序，篩選預測核心靶點，排名前30見圖4。

2.6 GO和KEGG富集分析 將109個共同靶點經R語言運行后GO分析選取生物學過程。GO結果顯示，交集基因集合共富集至2 111條生物學過程通路中，主要包括脂多糖反應、細菌源性分子反應、抗生素反應、氧化應激反應等。見圖5。將109個共同靶點經R語言運行后共得到166條KEGG通路，前20的結果形成KEGG功能富集的條形圖。P代表富集的顯著性，顏色越紅則顯著性越高。結果顯示共同靶點主要富集于IL-17、TNF、HIF-1、Toll樣受體、PI3K-AKT、核因子κB、MAPK、Th1和Th2細胞分化、JAK-STAT等信號通路，提示核心靶點有可能由此參與調控AR進程。見圖6。

3 討論

變應性鼻炎屬于中醫學“鼻鼽”的范疇，多因于臟腑虛損、正氣虧虛、衛表不固所致，其中脾胃虛弱、衛表不固是發病之關鍵。補中益氣湯具有健脾益氣、升陽舉陷、甘溫除熱之良效，以其精妙獨到的組方規律在臨床廣泛應用于消化系統及呼吸系統疾病。本方治療鼻鼽通過重用黃芪、人參等補氣溫中之品，配伍以升提陽氣、益氣祛風的藥物，從而達到和利陽氣、宣通鼻竅、驅邪扶正的效果。另根據中醫五行相生相克的理論，鼻為肺之竅，肺屬金，脾胃屬土，土為金之母。《石室秘錄》云：“治肺之法，正治甚難，當轉治以脾，脾氣有養，則土自生金。”《難經》有云：“虛則補其母，實則瀉其子。”基于鼻鼽脾胃虛損的病機和五行生克理論，補中益氣湯以培土生金之法補肺健脾，使得肺氣調和，則鼻竅通利。

本研究利用網絡藥理學手段，闡述補中益氣湯治療AR的分子作用機制，從微觀角度解釋中藥復方作用機制。在藥物活性成分篩選中，我們預測槲皮素、山柰酚、異鼠李素、β-谷甾醇等在治療AR中可能發揮重要作用。槲皮素、異鼠李素以及柚皮素同屬黃酮類化合物，具有調節免疫功能、抗腫瘤、抗氧化以及抗過敏等多種藥理作用。Maatouk等[12]將柚皮素進行熱處理后發現，小鼠T細胞的細胞毒作用得到抑制，而NK細胞殺傷活性顯著提高。馮欣欣等[13]通過酸性非特異性酯酶染色法檢測到，一定劑量的沙棘黃酮可以提高外周血ANAE陽性淋巴細胞數和D-半乳糖致衰老大鼠白細胞數，從而起到增強免疫的作用。此外，黃酮類化合物還能夠通過增強巨噬細胞吞噬活性，阻礙抑制樹突狀細胞（Dendritic Cells，DC）活化途徑參與調控細胞免疫[14]。研究者利用大鼠進行AR造模發現，槲皮素可以有效改善AR大鼠鼻黏膜的炎癥，其作用機制在于動態平衡變應性鼻炎Th1/Th2細胞因子比率，抑制肥大細胞組胺釋放，拮抗IL-4、IL-5的一系列炎癥趨化作用，從而減輕黏膜水腫和血管擴張[15]。在AR進程中，白三烯B4會引起炎癥部位白細胞的聚集，增強炎癥反應;腫瘤壞死因子-α（TNF-α）可以誘導血管內皮細胞表達黏附分子，從而促進炎癥細胞的浸潤與活化;前列腺素E2（PGE2）具有較強的血管擴張作用，能夠通過提高血管通透性以增加其他炎癥介質的致炎效應。實驗發現，山柰酚可以同時抑制白三烯B4、TNF-α的釋放;β-谷甾醇對IgE介導RBL-2H3細胞PGE2的釋放具有較強抑制作用[16]。由此可見，這些活性化合物通過抑制血管通透性增加，干預炎癥介質致炎效應等作用，發揮治療AR的藥效。AR的發病機制與遺傳性相關的因素占33%～75%，因此，探索遺傳基因與變應性鼻炎易感性之間的聯系具有指導性意義[17]。我們通過PPI網絡分析觀察到，IL-6、VEGFA、JUN、MMP9、MMP2等可能是參與調控AR的核心靶蛋白。目前大量研究已證實，IL-6作為一種炎癥介質，在參與變應性鼻炎的炎癥反應中發揮了重要作用，能夠促進T細胞的活化和增殖。在炎癥反應發生和發展過程中，IL-6還能夠激活炎癥細胞，使其發生聚集并釋放炎癥介質;此外，IL-6的基因多態性也是多種免疫相關疾病的易感基因[18]。血管內皮生長因子A（VEGFA）是PDGF/VEGF生長因子家族的成員，VEGF與組織重塑和呼吸系統變應性炎癥反應有著密切的聯系。VEGF水平上升會使血管通透性升高，從而使血管外間隙滲入大量炎癥介質、血漿蛋白與炎癥細胞[19]，導致炎癥反應加重。基于VEGFA的靶向組織重塑也成為了一種全新的治療方向。相關文獻報道，在AR患者鼻黏膜中，MMP-2、MMP-9的表達顯著增加，其中MMP-9和肥大細胞之間具有強相關性，提示MMPs可能有助于炎癥細胞如肥大細胞等向變應性鼻炎患者鼻黏膜的遷移，證實了在變應性鼻炎的形成中MMPs起到了積極的促進作用[20]。

通過KEGG富集分析顯示，上述核心靶蛋白主要富集于IL-17、TNF、HIF-1、Toll樣受體、PI3K-AKT、核因子κB、MAPK、Th1和Th2細胞分化、JAK-STAT等信號通路，提示復方活性成分很可能通過以上途徑完成疾病進程的干預。白細胞介素-17（IL-17）是由Th17產生的細胞因子。研究指出，Th17參與宿主防御、自身免疫以及過敏反應急性期中性粒細胞浸潤過程，具有強烈致炎效應;而IL-17則有助于誘導變應原特異性Th2細胞活化、嗜酸性粒細胞積累和血清IgE產生;由此可見，IL-17對Th2驅動的過敏免疫反應有調節作用[21]。Amin等[22]采用ECLIA實驗發現，AR患者血清中的IL-17水平顯著高于健康人群，并且能夠促進人B細胞IgE的產生，提出高血清IL-17水平可能與鼻腔炎癥有關，因此靶向IL-17（或增強對抑制性T細胞的調節）可能是一種治療AR的有效方法。Toll樣受體（TLRs）是一種天然免疫受體，主要在細胞膜或細胞質小泡中表達，這種天然免疫受體廣泛識別具有相似特征的配體，即病原體相關分子模式（PAMPs）和損傷相關分子模式（DAMPs），隨后可以參與識別多種病原體/變應原，也可以參與誘導免疫相關疾病[23]。TLR3、7、8是識別單鏈和雙鏈RNA的最重要受體，通過不同的細胞內信號通路激活促炎轉錄因子，基于先天免疫反應在人類促炎性疾病中的關鍵作用，可以推測TLR3、7、8可能在過敏性鼻炎的誘導和進展中意義重大，它們有理由被認為是分子治療的未來靶點[24-26]。HIF-1α是髓樣細胞觸發炎癥的內源性必需物，在調節炎癥反應中起到關鍵作用，它能夠通過細胞自發的核因子κB活化促進上皮炎癥，直接介導iNOS和VEGF的轉錄以誘導血管通透性增加和炎癥反應。有研究發現，HIF-1α拮抗劑（YC-1）在變應性鼻炎和哮喘綜合征（CARAS）的治療中起到積極作用，它能夠減少肺和鼻黏膜中OVA誘導的嗜酸性粒細胞浸潤，抑制核因子κB和PPARα等多種炎癥激活途徑，證明HIF-1α與呼吸道變態反應的發病機制密切相關，提出HIF-1α通路可能是AR有希望的治療靶點[27-28]。

本研究采用網絡藥理學的研究方式，通過多角度、多學科聯合，整合了大量的生物學信息，巧妙運用網絡預測模型具象化體現中藥復方生物效用機制，為AR關鍵靶點、信號通路的后續實驗研究帶來全新展望。考慮到目前尚存在數據庫不夠全面，中藥炮制過程中活性成分定位不夠明確等局限性，復方藥效物質基礎的研究征途依然既艱苦、復雜又漫長，未來仍需進一步臨床試驗研究對預測結果進行驗證。

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（2020-05-21收稿 責任編輯：張樂杰）