基于網絡藥理學探究丹參治療慢性肝炎的作用機制

霍蘇 崔鶴蓉 顧昱昊 戴子琦 李文 劉小靖 韓娜娜 馬濤 王鵬龍 雷海民

摘要 目的：運用網絡藥理學的方法預測丹參治療慢性肝炎的主要活性成分、靶點及信號通路，探究其潛在作用機制。方法：通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）篩選丹參的有效成分;輸入Pharm Mapper數據庫獲得相應基因;檢索GeneCards數據庫獲得慢性肝炎的靶點基因;利用R語言3.6.3截取交集網絡獲得潛在靶點;使用Cytoscape3.7.2將“中藥-化合物-靶點-疾病”網絡可視化處理;在STRING平臺構建蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡;利用DAVID數據庫對候選靶點進行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路注釋。結果：獲得丹參中65個活性化合物、109個不重復的靶標信息、89個慢性肝炎治療靶點。GO功能富集得到GO條目48個（P<0.05），其中生物過程（BP）條目1 796個，細胞組分（CC）條目73個，分子功能（MF）條目130個;KEGG通路富集得到88條信號通路（P<0.05）。結論：丹參中的有效成分異隱丹參酮（Isocryptotanshi-none）、1，2，5，6-tetrahydrotanshinone、丹參醌新酮Ⅰ（MiltiononeⅠ）、二氫丹參內酯（Dihydrotanshinlactone）、4-methylenemiltirone、丹參酮Ⅱa（TanshinoneⅡa）、木犀草素等可能作用于ADRB2、OPRM1、PTGS1、CA2、PTGS2等關鍵靶點通過調控Hepatitis B、IL-17 signaling pathway、Hepatitis C、T cell receptor signaling pathway、PI3K/AKT signaling pathway等干預了活性氧代謝過程、循環系統血管功能、氧化應激反應、凋亡，從而發揮治療慢性肝炎的作用。

關鍵詞 網絡藥理學;丹參;慢性肝炎;藥物作用機制;靶點;信號通路;生物功能

Abstract Objective：To predict the main active components，targets and signal pathways of Radix Salviae Miltiorrhizae in the treatment of chronic hepatitis and to explore the mechanism of action.Methods：The effective components of Radix Salviae Miltiorrhizae were screened by TCMSP database.The corresponding genes were obtained by entering Pharm Mapper database.The target genes of chronic hepatitis were obtained by searching GeneCards database.We used R language 3.6.3 intercept intersection network to obtain candidate targets; With the help of Cytoscape 3.7.2，the network of “drug-compound-target-disease” was visualized.We built PPI network on STRING platform; the DAVID database was used for GO enrichment analysis and KEGG pathway annotation of the candidate targets.Results：A total of 65 effective compounds，109 non-repeated targets and 89 disease treatment targets were obtained.There were 48 GO items（P<0.05），among which 1796 were biological process（BP） items，73 were cell components（CC） items，and 130 were molecular function（MF） items.There were 88 signal pathways enriched by KEGG pathway（P<0.05）.Conclusion：The effective ingredients of Radix Salviae Miltiorrhizae Isocryptotanshi-none，1，2，5，6-tetrahydrotanshinone，miltionone I，dihydrotanshinlactone，4-methylenemiltirone，Tanshinone IIa，Luteolin may act on key targets such as ADRB2，OPRM1，PTGS1，CA2，and PTGS2 by regulating Hepatitis B，IL-17 signaling pathway，Hepatitis C，T cell receptor signaling pathway，PI3K-AKT signaling pathway，etc.，intervening in the process of reactive oxygen metabolism，circulatory system vascular function，oxidative stress response，apoptosis，and thus play a role in the treatment of chronic hepatitis.

Keywords Network pharmacology; Radix Salviae Miltiorrhizae; Chronic hepatitis; Drug mechanism; Targets; Signaling pathway; Biological function

中圖分類號：R285;R284文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.20.006

慢性肝炎是一類肝病的統稱，人體被病毒感染，飲食不當、過度操勞、情志郁結等對肝臟的損害引起的，病程至少持續6個月以上的肝臟壞死和炎癥，是對肝臟慢性變態性損害過程[1-6]。慢性肝炎主要有慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B）;慢性丙型肝炎（Chronic Hepatitis C，CHC）;由于體內的自身免疫過度造成的，稱為自身免疫性肝炎（Autoimmune Hepatitis，AIH），常見于婦女[4];慢性酒精性肝病（Alcoholic Liver Disease，ALD）和由長期服用某些藥物引起的藥物性肝損傷（Drug-induced Liver Injury，DILI）比如甲基多巴、異煙臍、醋氨酚等[7]。慢性肝炎按病重可分為輕、中、重度慢性重型肝炎。慢性肝炎的共同特征，即：不同程度的肝組織壞死和炎癥，隨后發生肝纖維化，最終可發展為肝硬化[8]。

慢性肝炎的治療包括保肝、抗纖維化、抗病毒、預防肝癌等方面，根據不同的病因，采取不同的治療手段，為治療慢性肝炎最重要的原則，治療慢性肝炎患者的關鍵在如何消除肝臟炎癥，使肝臟纖維化減輕[9]。現代醫學在治療慢性肝炎方面仍然不足：需要長期使用藥物，成本高，用藥不方便，臨床應用受到一定的限制[10]。中醫對慢性肝病是扶正祛邪，常用治法有清熱解毒、化痰通絡、疏肝理氣、活血化瘀、軟堅散結、益氣養陰、健脾化濕、補腎柔肝、清熱解毒、化濕解毒、活血解毒、扶正解毒等。

丹參，歸心、肝經。丹參能改善微循環，活血化瘀，調整組織修復和再生，可以顯著降低肝臟的脯氨酸含量，抑制成纖維細胞增殖和膠原在細胞內的合成，改善肝臟功能，具有多個目標綜合抗纖維化的藥理作用[11]。近幾年研究顯示，中藥丹參制劑在慢性肝炎的治療中研究較多，它具有保肝作用，能夠有效改善肝組織壞死;可以改善肝臟微循環，具有抑制細胞纖維化的作用;丹參為良好的抗氧化劑，具有抑制星狀細胞的增殖與活化，促進肝細胞的再生等作用[12-14]。

網絡藥理學（Network Pharmacology）是以系統生物學、藥理學和計算機技術為基礎，實現對藥物作用的全面網絡分析，特別適合以多成分、多靶點、多機制為特點的中藥研究[15]。因此，本研究擬通過網絡藥理學方法提取丹參抗慢性肝炎潛在有效成分及其作用靶點，分析其作用機制，為丹參在慢性肝炎上臨床應用提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 資料來源

本研究通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php;GeneCards數據庫https：//www.genecards.org/;Uniprot數據庫http：//www.uniprot.org/;Pubchem數據庫https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/;Pharm Mapper數據庫http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/submitfile.html;Cytoscape（3.7.2）軟件http：//cytoscapeweb.cytoscape.org/;DAVID數據庫https：//david.ncifcrf.gov/;String數據庫平臺https：//string-db.org/cgi/input.pl獲取相關資料[16]。

1.2 丹參活性成分篩選及其靶點的獲取

在TCMSP中預測丹參中化學成分的吸收、分布、代謝。本研究共收集了丹參中的202個化合物，并通過口服生物利用度（OB）、類藥性（DL）和藥物藥代動力學篩選高活性化合物，其中，OB是指藥物口服后被人體吸收進入血液循環的相對數量和速率;DL反映了化合物中特定官能團與已知藥物的相似性，對評價中藥化學成分的活性具有重要意義。查閱文獻，取OB≥30%，DL≥0.18作為域值篩選高活性區的關鍵化合物[17]。

1.3 丹參有效成分靶點規范化

因丹參有效成分靶點來源不統一引起丹參靶點名稱不規范，因此需要對篩選得到的靶蛋白和基因信息進行校正。將所獲得的靶點在Uniport數據庫中進行搜索，將物種設置為人，獲得靶點標準的Uniport名稱。

1.4 疾病靶點的獲取與交集靶點的篩選

在GeneCards數據庫輸入關鍵詞Chronic hepatitis獲得慢性肝炎的蛋白靶點基因并與1.1篩選出的藥物靶點進行韋恩分析，獲取交集靶點。

1.5 中藥-疾病-靶點交互網路建立

本研究將丹參和慢性肝炎的共同靶點與丹參中關鍵化合物使用Cytoscape3.7.2軟件進行繪制網絡圖，以闡明丹參治療慢性肝炎的機制。在這個網絡圖中，關鍵化合物和靶點以節點表示，節點之間相互作用的關系以邊來表示。

1.6 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡構建

考慮到靶標之間的相互作用，我們將89個靶標基因引入String數據庫平臺，得到PPI關系，并以“>0.9”的評分篩選PPI關系，隱藏離散點。下載PP網絡圖，篩選前30個核心基因。

1.7 基因本體（GO）富集分析

將藥物疾病共有靶點進行GO的生物過程（Biological Process，BP）、細胞組分（Cell Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）富集[18]，引用String數據庫，將校正P值≤0.05的項目進行篩選。使用R 3.6.3軟件，安裝并引用clusterProfiler、enrichplot、ggplot2包，進行柱狀圖和氣泡圖繪制。

1.8 京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析

將藥物疾病共有靶點進行KEGG通路富集分析，引用String數據庫，將校正P值≤0.05的項目進行篩選。使用R 3.6.3，安裝并引用clusterProfiler包后，進行柱狀圖和氣泡圖繪制。

2 結果

2.1 藥物化學成分及藥物靶點篩選

利用TCMSP篩選丹參中的202種已知成分，通過OB≥30%和DL≥0.18篩選出丹參中65種高活性關鍵化合物，包括丹參酮、紫杉醇、丹參醛、丹酚等。見表1。其中65種有效成分對應935相關靶點，有680個有效相關靶蛋白和109個靶基因。

2.2 疾病靶點

查詢丹參中以上65個化合物的靶標信息，并通過Uniprot基因ID注釋獲取丹參的基因ID，在Genecard數據庫中找到慢性肝炎相關靶點共8 046個，與丹參共有靶點89個。見表2。并用R3.6.3繪制維恩圖。見圖1。

2.3 活性成分-潛在靶點網絡關系圖

網絡共涉及節點（Nodes）114個，其中紅色為疾病，即慢性肝炎，藍色部分為丹參高活性成分，紫色為丹參，黃色為疾病的預測靶點，邊線表示化合物、靶點、藥物、疾病之間存在相關性。通過插件cytoNCA按照度（Degree）、緊密度（Closeness）2種屬性分別取排序靠前的成分或者靶點。成分有異隱丹參酮（Isocryptotanshi-none）、1，2，5，6-tetrahydrotanshinone、丹參醌新酮Ⅰ（MiltiononeⅠ）、二氫丹參內酯（Dihydrotanshinlactone）、4-methylenemiltirone、丹參酮Ⅱa（TanshinoneⅡa）、木犀草素等，靶點有ADRB2、OPRM1、PTGS1、CA2、PTGS2。見圖2。

2.4 PPI網絡構建

將潛在治療靶點基因導入STRING數據庫，物種選擇人類，篩選評分>0.9的蛋白質相互作用關系，構建PPI網絡。見圖3。其中藍線代表基因共同進化的證據，紅線代表基因融合的證據，黃線代表文本挖掘的證據。完成PPI網絡。見圖4。該網絡包含263條邊，59個節點。其中，評分≥0.99的PPI蛋白為CDKN1A-CCND1、AKT1-NOS3、TP53-MDM2、NCOA2-AR、CDKN1A-CCNA2、CDKN1A-PCNA、AKT1-GSK3B、JUN-FOS、CDKN1A-TP53、EDN1-EDNRA、NCOA2-NR3C1、CCNA2-CCNB1、PTPN1-INSR、EGFR-STAT3、IL10-IL6、RXRA-NCOA2、IL10-TNF、IL6-STAT3、MYC-CDKN1A、IL6-IL4、AKT1-CDKN1A、ESR1-NCOA2、JUN-MAPK14、IL10-STAT3、VEGFA-STAT3、AKT1-STAT3、AKT1-CASP9、AKT1-TP53、VEGFA-NOS3、STAT3-CCND1、CDKN1A-CCNB1、TNF-NFKBIA、TNF-IL4、MYC-JUN、MYC-AKT1、JUN-TP53、AKT1-MDM2、AKT1-ESR1、CCNA2-TP53、ESR1-CCND1、GSK3B-CCND1、TP53-MAPK14、MYC-STAT3。RBl-CCNDl;ESR1-CCNDl;USK3B-CCNDl。通過計算每個基因節點數的連接，找到前30個核心PPI。見圖4。即：STAT3、JUN、AKT1、TNF、TP53、MAPK14、CCND1、CDKN1A、IL6、MYC、EDN1、ESR1、FOS、VEGFA、IL2、IL4、GSK3B、CASP3、EGFR、IL10、NR3C1、CCNA2、ERBB2、MMP9、NCOA2、NFKBIA、NOS2、NOS3、、PTPN1、AR。見圖4。

2.5 GO富集分析結果

將藥疾病共有靶點進行GO的生物過程（BP）、細胞組分（CC）富集、分子功能（MF），引用String數據庫，將校正P≤0.05的項目進行篩選，總共富集到1 796條生物過程，130項與分子功能相關，73項與細胞組成相關，結果可視化繪制柱狀圖和氣泡圖。見圖5。

2.6 KEGG通路富集

將藥物疾病共有靶點進行KEGG通路富集分析，引用String數據庫，將校正P值≤0.05的項目進行篩選，總共富集到88條信號通路，根據P值由小到大篩選排名前20的通路繪制柱狀圖和氣泡圖。見圖6。經分析的得到乙型肝炎、IL-17信號通路、丙型肝炎、HIF-1信號通路、內分泌的阻力、T細胞受體信號通路、PI3K/AKT信號通路，這7條信號通路是治療慢性肝炎的主要通路。

3 討論

近年來越來越多的研究表明，治療慢性肝炎的關鍵在如何消除肝臟炎癥，肝臟纖維化。丹參可使肝細胞粗面內質網和線粒體具有顯著的恢復和更新作用，顯著增加肝細胞DNA和RNA含量，有利于肝細胞的修復和再生，從而抑制細胞內膠原的合成和肝纖維化。現已從丹參中分離得到丹參酮llA、丹參酮I、丹參酮、隱式丹參酮等脂溶性成分;丹酚酸等水溶性成分;木犀草素等黃酮類成分共100余種。本研究采用網絡藥理學方法，首先通過OB和DL篩選丹參的有效成分，通過與慢性肝炎相關的有效成分靶區預測丹參治療慢性肝炎的有效成分。最終分析活性成分與疾病是受生物過程影響并參與信號通路的共同靶點。從信號通路的角度探討丹參治療慢性肝炎的可能機制。

通過PPI篩選發現STAT3、JUN、AKT1、TNF，TP53、MAPK14、CCND1、CDKN1A、IL6、MYC等是丹參治療慢性肝炎的關鍵靶點。STAT3作為STAT家族的主要成員之一，是介導細胞間信號轉導的經典轉錄因子，最初被發現是作為對IL-6等炎癥介質的產生應答的關鍵胞內分子。正常情況下存在于細胞質中，被磷酸化Tyr705激活后調控基因的表達。研究發現STAT3介導分化、凋亡、免疫和炎癥反應在內的多等種生物學過程，STAT3可與核因子κB交互作用，有助于核因子κB活化，上調多種炎癥介質，而活化的核因子κB可產生白細胞介素-6（Interleukin 6，IL-6），進一步激活STAT3，上述正反饋過程，促進炎癥發生發展。肝炎病毒感染可誘導肝細胞合成大量TNF，TNF也可誘導體內產生IL-6，二者關系密切。因此在肝組織中可以發現大量的炎癥介質。這些炎癥介質參與肝臟促炎癥反應，肝細胞損傷，多種肝細胞分化和增殖，從而導致永久肝臟慢性炎癥，并導致纖維化的形成。JUN是JNK的下游產物，當JNK被活化后，JUN磷酸化，JUN的激活依賴于轉錄的凋亡信號通路，肝細胞凋亡是導致肝損傷的一個重要機制，促進肝臟炎癥及纖維化的發展，抑制JUN磷酸化可抑制細胞的凋亡與自噬，抑制肝臟炎癥及纖維化的發展。MAPK14是絲裂原活化蛋白激酶14，可介導多種炎癥介質的激活如TNF、IL-6等，促進肝細胞炎癥的產生;同時MAPK14可磷酸化P53，是細胞周期阻滯在G1、G2期，誘導細胞凋亡，促進肝臟炎癥的發展。TP5是細胞腫瘤抗原，通過調控DNA修復基因的轉錄等相關通路，達到抗炎、抗病毒、增強免疫力的作用。AKT1（蛋白激酶），在調控細胞成活和凋亡中有重要作用，激活AKT1可保護肝細胞，抑制肝臟受損。

依據GO富集分析結果可知，BP主要涉及活性氧代謝過程、循環系統血管功能、氧化應激反應、凋亡等。肝細胞凋亡是導致慢性肝炎的重要機制之一，丹參通過調控肝細胞凋亡過程，減輕肝損傷，抑制肝臟炎癥的發展。乙醇代謝過程中產生的大量活性氧，氧自由基的毒性反應使人體發生氧化應激，是酒精性肝病發生發展的關鍵機制之一，丹參通過參與調控活性氧代謝過程和氧化應激反應，治療慢性酒精性肝炎，調控涉及CCNA2、CCKN1、JUN等。肝內血管的炎癥、破壞、阻塞及增生病變，引起肝供血障礙，這貫穿慢性肝炎發展的整個階段。丹參通過調控循環系統血管功能，促進肝臟內皮細胞增殖、提高血管通透性從而達到治療慢性肝炎的目的，調控涉及EGFR、AKT1、VEGFA等。

依據KEGG富集分析結果可知，在治療過程中相關度較高的通路有乙型肝炎、IL-17信號通路、丙型肝炎、HIF-1信號通路、內分泌的阻力、T細胞受體信號通路、PI3K/AKT信號通路等。PI3K/AKT信號通路為生物體內重要的生存信號通路。在PI3K/AKT信號通路中，可介導AKT的活化，活化的AKT可促進肝損傷細胞增殖，抑制細胞凋亡，促進慢性肝炎的發展，丹參可通過抑制PI3K/AKT信號通路，抑制AKT的活化，降低肝細胞損傷、氧化應激及凋亡，減輕肝炎癥的發生。IL-17參與肝細胞損傷和炎癥的發病機制，IL-17具有強的中性粒細胞募集和活化，可誘導T細胞活化，刺激成纖維細胞、上皮細胞和巨噬細胞生成IL-1、IL-6等多種炎癥介質和化學激活素從而誘導炎癥，丹參可直接介導IL-17信號通路，減輕其活性從而控制炎癥的擴大化。T細胞受體（TCR）在T細胞的功能和免疫突觸的形成中起著關鍵作用。它在T細胞和抗原呈遞細胞（APC）之間提供連接。激活T淋巴細胞是免疫系統有效反應的關鍵事件。TCR的激活受多種共刺激受體調控。丹參激活TCRT通路，通過免疫反應直接殺死乙型肝炎和丙型肝炎病毒，抑制慢性乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒的發展。缺氧誘導因子1（HIF-1）是調節氧穩態的主要因子，HIF-1的靶基因編碼增加氧氣輸送的蛋白質，并介導對缺氧的適應性反應。HIF-1不僅是由于氧利用率降低而引起的，而且是由其他刺激物（如一氧化氮）或各種生長因子引起的，丹參介導HIF-1信號通路，通過調控一系列缺氧相關基因的表達，增強肝細胞在低氧環境下的代謝適應能力，并參與肝病惡性轉化的生物過程。

綜上所述，丹參治療慢性肝炎的作用機制可能是其有效成分通過STAT3、、JUN、AKT1、TNF，TP53、MAPK14、CCND1、CDKN1A、IL6、MYC等關鍵蛋白介導乙型肝炎、IL-17信號通路、丙型肝炎、HIF-1信號通路、內分泌的阻力、TCR信號通路、PI3K/AKT信號通路等協作產生凋亡、免疫殺傷、抑制炎癥產生等直接作用以及增加肝細胞的低氧代謝能力來防治慢性肝炎。本研究揭示了丹參治療慢性肝炎是多成分，多靶點，多生物過程的，體現了中醫藥治病的整體理念，為后期的臨床應用奠定了理論基礎。但網絡藥理學尚存在局限性，有待后期更多的基礎及臨床實驗的進一步證實。

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（2020-05-20收稿 責任編輯：楊覺雄）