大蒜素誘導(dǎo)人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞凋亡的作用機制研究

賈麗 孫翠榮 成艷梅 李研 張凱

摘要 目的：探討大蒜素誘導(dǎo)人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞凋亡的作用機制。方法：分別以二甲基亞砜（空白對照組）、大蒜素（12.5、25、50 μg/mL）和LY294002 5 μg/mL干預(yù)對數(shù)生長期Ishikawa細(xì)胞。48 h后，用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖抑制率，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡狀況，Western Blotting法檢測p-PI3K、p-AKT、Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)。結(jié)果：與空白對照組比較，經(jīng)大蒜素12.5、25、50 μg/mL或LY294002 5 μg/mL干預(yù)能夠提高Ishikawa細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率;經(jīng)大蒜素25、50 μg/mL或LY294002 5 μg/mL干預(yù)能夠下調(diào)p-PI3K、p-AKT、Bcl-2表達(dá)并上調(diào)Cleaved Caspase-3、Bax表達(dá)，提高Bax/Bcl-2比值，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。與LY294002組比較，經(jīng)大蒜素50 μg/mL干預(yù)能夠提高Ishikawa細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率，下調(diào)p-PI3K、p-AKT表達(dá)并上調(diào)Cleaved Caspase-3、Bax表達(dá)，提高Bax/Bcl-2比值，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：大蒜素能夠誘導(dǎo)人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞凋亡，可能與抑制PI3K/AKT信號通路活化而使其下游促凋亡蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 大蒜素;子宮內(nèi)膜癌;LY294002;Ishikawa細(xì)胞;增殖;凋亡;磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B;機制

Abstract Objective：To investigate the effects and mechanism of Allicin on apoptosis of Ishikawa cells in human endometrial carcinoma.Methods：Ishikawa cells in logarithmic growth phase was treated with DMSO（blank control group），Allicin（12.5，25，50 μg/mL） and LY294002 5 μg/mL.48 h later，the cell proliferation inhibition rate was detected by CCK-8 method，cell apoptosis was analyzed by flow cytometry，and protein expression of p-PI3K，p-AKT，Cleaved Caspase-3，Bcl-2，and Bax were detected by Western blotting.Results：Compared with the blank control group，intervention of Allicin 12.5，25，50 μg/mL and LY294002 5μg/mL could increase Ishikawa cells proliferation inhibition rate and apoptosis rate，down-regulate the expression of p-PI3K，p-AKT，Bcl-2 and up-regulate the expression of Cleaved Caspase-3，Bax，increase the ratio of Bax/Bcl-2，all of which were statistically significant（P<0.05 or P<0.01）.Compared with the LY294002 5μg/mL group，intervented by Allicin 50 μg/mL could increase Ishikawa cells proliferation inhibition rate and apoptosis rate，down-regulate the expression of p-PI3K，p-AKT and up-regulate the expression of Caspase-3，Bax，increase the ratio of Bax/Bcl-2，all of which were statistically significant（P<0.05 or P<0.01）.Conclusion：Allicin can induce apoptosis of human endometrial cancer Ishikawa cells，which may be related to the inhibition of PI3K/AKT signaling pathway activation and up-regulation of downstream pro-apoptotic proteins.

Keywords Allicin; Endometrial cancer; LY294002; Ishikawa cells; Proliferation; Apoptosis; PI3K/AKT; Mechanism

中圖分類號：R285.5;R273文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.20.011

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)常見的一種惡性上皮腫瘤，發(fā)病率僅次于宮頸癌居第2位，晚期患者5年生存率不足50%[1]。并且隨著肥胖、糖尿病等高危人群的增加，子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率呈逐年上升且年輕化趨勢，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康[2]。

大蒜素是天然存在于大蒜鱗莖中的一種二烯丙基三硫化物，具有抗炎、抗氧化以及廣泛的抗腫瘤活性[3-6]。本研究發(fā)現(xiàn)大蒜素能夠抑制人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞生長并增強其順鉑化療敏感性[7-8]。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號通路對細(xì)胞增殖和抗凋亡具有關(guān)鍵的調(diào)控作用[9-11]，本研究以Ishikawa細(xì)胞為受試細(xì)胞，探討大蒜素對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡的影響以及PI3K/AKT信號通路在其中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞株由河北醫(yī)科大學(xué)病理教研室提供。

1.1.2 藥物 大蒜素注射液（上海禾豐制藥有限公司，批號：4E41025），規(guī)格5 mL：60 mg;LY294002（Sigma公司，美國，批號：L9908）。

1.1.3 試劑與儀器 胰蛋白酶、胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、RIPA裂解液（杭州四季青生物工程材料有限公司，批號：190514、190427、190605、190517）;CCK-8試劑盒（蘇州宇恒生物有限公司，批號：190115）;Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（南京恩晶生物有限公司，批號：20190130）;磷酸化PI3K（p-PI3K）、磷酸化AKT（p-AKT）、Cleaved Caspase-3、B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：201812017、201903022、201901029、20190302、20190118）;DAB顯色試劑盒（北京中山金橋生物科技公司，批號：20180609）;CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（三洋公司，日本，型號：MCO-15AC）;酶標(biāo)儀（Labsysterms公司，芬蘭，型號：Multiskan Asent）;流式細(xì)胞儀（Partec公司，德國，型號：CyFlow Counter）;垂直電泳槽、轉(zhuǎn)膜槽、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國，型號：Tetra Systerm、Power Pac Basic、GelDoc EZ）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞經(jīng)解凍復(fù)蘇后接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，置CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（5%的CO2、恒溫37 ℃、飽和濕度）中培養(yǎng)，2 d換液1次。本研究方案經(jīng)邯鄲市中心醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2.2 CCK-8法測定Ishikawa細(xì)胞增殖抑制率 ? 待Ishikawa細(xì)胞生長至對數(shù)生長期后，經(jīng)胰酶消化并制備濃度為5×104個/mL的單細(xì)胞懸液，100 μL/孔接種于96孔板，置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)待細(xì)胞貼壁后，分別給予DMSO（空白對照組）、大蒜素（12.5、25、50 μg/mL）和LY294002 5 μg/mL作為觀察組，每組設(shè)10個復(fù)孔;48 h后10 μL/孔加入CCK-8試劑，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h后通過酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度值（OD450 nm），增殖抑制率（%）=（1-觀察組OD450 nm/空白對照組OD450 nm）×100%

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)分析Ishikawa細(xì)胞凋亡狀況并計算凋亡率 取對數(shù)生長期Ishikawa細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后制備濃度5×104個/mL的單細(xì)胞懸液，100 μL/孔接種于6孔板，置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)待細(xì)胞貼壁后，分別給予DMSO（空白對照組）、大蒜素（12.5、25、50 μg/mL）和LY294002 5 μg/mL作為觀察組，每組設(shè)10個復(fù)孔;48 h后胰酶消化、離心（離心半徑10 cm、轉(zhuǎn)速1 500 r/min、時間5 min）。棄上清液，經(jīng)4 ℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，70%乙醇固定1 h，預(yù)冷PBS洗滌2次后，按照試劑盒操作說明，400 μL/孔加入結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，5 μL/孔加入Annexin V-FITC避光4 ℃染色15 min后，通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡狀況并計算凋亡率。

1.2.4 Western Blotting法檢測Ishikawa細(xì)胞蛋白表達(dá) 取對數(shù)生長期Ishikawa細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后離心（離心半徑10 cm、轉(zhuǎn)速1 500 r/min、時間5 min）。棄上清取細(xì)胞，經(jīng)RIPA裂解液冰上裂解40 min，4 ℃離心（離心半徑10 cm、轉(zhuǎn)速12 000 r/min、時間15 min）取上清液，BCA試劑盒測定總蛋白濃度，沸水浴蛋白變性后，40 μg總蛋白上樣行10% SDS-PAGE凝膠電泳（80 V電壓濃縮膠電泳、120 V分離膠電泳），90 V電壓轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯（PVDF）膜后5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，滴加兔抗人目標(biāo)蛋白、β-actin一抗恒4 ℃孵育過夜，充分洗膜后滴加山羊抗兔IgG二抗于室溫孵育1 h，洗膜后滴加DAB顯色;以β-actin為內(nèi)參，以條帶灰度值半定量目標(biāo)蛋白表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 15.0軟件軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析、兩兩比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖抑制率測定結(jié)果 與空白對照組比較，大蒜素12.5、25、50 μg/mL組和LY294002 5 μg/mL組Ishikawa細(xì)胞增殖抑制率顯著提高（P<0.01）;與LY294002 5 μg/mL組比較，大蒜素50 μg/mL組細(xì)胞增殖抑制率顯著提高（P<0.05）。見表1。

2.2 各組人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞凋亡狀況檢測結(jié)果 與空白對照組比較，大蒜素12.5、25、50 μg/mL組和LY294002 5 μg/mL組Ishikawa細(xì)胞凋亡率顯著提高（P<0.01）;與LY294002 5 μg/mL組比較，大蒜素50 μg/mL組細(xì)胞凋亡率顯著提高（P<0.01）。見圖1、表1。

2.3 各組人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)檢測結(jié)果 與空白對照組比較，大蒜素25、50 μg/mL組和LY294002 5 μg/mL組Ishikawa細(xì)胞p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.05或P<0.01）;與LY294002 5 μg/mL組比較，大蒜素50 μg/mL組p-PI3K、p-AKT表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.01）。見圖2，表2。

2.4 各組人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)檢測結(jié)果 與空白對照組比較，大蒜素25、50 μg/mL組和LY294002 5 μg/mL組Ishikawa細(xì)胞Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)顯著上調(diào)而Bcl-2表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.05或P<0.01）;與LY294002 5 μg/mL組比較，大蒜素50 μg/mL組Cleaved Caspase-3、Bax表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.01），2組Bcl-2表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖3，表3。

3 討論

目前，手術(shù)切除并輔以放化療仍是臨床治療子宮內(nèi)膜癌的首選方案，然而化療藥物不良反應(yīng)顯著并易形成耐藥性，從而導(dǎo)致復(fù)發(fā)和病灶轉(zhuǎn)移[12]。病理生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌疾病進(jìn)展與癌細(xì)胞異常增殖和凋亡抑制密切相關(guān)，因此以誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡為靶點開發(fā)新型抗癌藥物，或許對改善子宮內(nèi)膜癌患者生命質(zhì)量、延長生存期具有重要意義。

近年來，中醫(yī)藥在腫瘤治療中越來越受重視，大蒜為百合科蔥屬植物，其鱗莖可入藥，性溫，味辛、甘，具有溫中健胃、消食理氣之功效。大蒜素是大蒜鱗莖的主要活性成分，具有廣泛的抗腫瘤活性，能夠促進(jìn)人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞、人白血病HL-60細(xì)胞、大腸癌Lovo細(xì)胞凋亡[13-15]。本實驗以人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞為受試細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)大蒜素或LY294002干預(yù)能夠顯著提高Ishikawa細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率，提示大蒜素具有誘導(dǎo)人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞凋亡并抑制其增殖的作用。

細(xì)胞凋亡是一種程序化細(xì)胞死亡過程，該過程有多種基因蛋白參與調(diào)控，其中Caspase家族和Bcl-2家族蛋白發(fā)揮著重要調(diào)控作用。Caspase-3被細(xì)胞色素C激活后參與細(xì)胞凋亡的啟動和執(zhí)行過程，是凋亡級聯(lián)反應(yīng)最關(guān)鍵的促凋亡蛋白酶[16]。Bcl-2家族蛋白可分為抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白兩大類，其中Bcl-2是位于線粒體膜上的一種膜蛋白，能夠通過調(diào)控線粒體膜通透性而抑制細(xì)胞色素C釋放，抑制Caspase-3活化、抑制Ca2+超載等而發(fā)揮抗凋亡作用;Bax則能夠與Bcl-2形成異源二聚體而抑制其抗凋亡活性，并且能夠破壞線粒體膜的完整性而導(dǎo)致細(xì)胞色素C的釋放，激活Caspase-3而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。

PI3K/AKT信號通路在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，AKT是PI3K下游信號分子和靶激酶，p-PI3K能夠促進(jìn)AKT發(fā)生磷酸化（p-AKT）而被激活，p-AKT誘導(dǎo)具有促凋亡作用的糖原合成酶激酶-3β磷酸化而失活，能夠抑制Caspase-3活化而抗凋亡，并且p-AKT能夠抑制促凋亡蛋白Bax的合成[18-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)大蒜素或LY294002干預(yù)能夠有效下調(diào)人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)，上調(diào)Cleaved Caspase-3、Bax蛋白并下調(diào)Bcl-2表達(dá)，并且大蒜素50 μg/mL對p-PI3K、p-AKT、Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)的調(diào)控作用優(yōu)于LY294002 5 μg/mL。

綜上所述，大蒜素能夠誘導(dǎo)人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞凋亡，機制可能與抑制PI3K/AKT信號通路活化而使其下游促凋亡蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

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（2020-06-04收稿 責(zé)任編輯：張雄杰）