華蟾素對人肝癌HepG2.2.15細胞體內外增殖的影響及可能的機制*

馮麗麗 汪曉軍

1.首都醫科大學附屬北京佑安醫院肝病四科 (北京， 100000) 2.首都醫科大學附屬北京佑安醫院中西醫結合中心

華蟾素是中華大蟾蜍皮膚的水提取物，廣泛應用于惡性腫瘤、慢性乙型肝炎、全身或局部感染等疾病[1]。為探索華蟾素治療原發性肝癌(HCC)的療效和可能機制，本實驗通過觀察華蟾素對HepG2.2.15細胞的增殖、凋亡以及對p53基因和蛋白表達的影響，探討華蟾素可能的抗腫瘤機制，為進一步研究華蟾素治療HCC提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 華蟾素、細胞、裸鼠及主要試劑 華蟾素購自陜西東泰藥業有限公司(中國陜西)，溶于生理鹽水中，濃度為500 mg/ml。裸鼠用藥量為：X mg/kg×70 kg×0.0026/20 g=9.1x mg/kg，其中x是成人用藥劑量。HepG2.2.15細胞購買于中國典型培養物保藏中心(中國武漢)。BALB/c裸鼠(n=16；雄性；4周齡；40～50 g)購買自上海杰思捷實驗動物有限公司[合格證編號：20180004051445，許可證號碼：SCXK(滬)2018-0004]，飼養于廈門大學實驗動物中心。小鼠抗p53(sc-47698)和β -tubulin(sc-365791)一抗購自Santa Cruz Biotechnology(美國德克薩斯州)；rabbit anti-p53 (#2527)抗體購自CST(美國波士頓)；Western blot and IP細胞裂解緩沖液(P0013)購買自碧云天生物技術研究所(中國海門)；蛋白質印跡剝離緩沖液(21059)購買于Thermo Scientific(美國麻省)。

1.2 細胞實驗 HepG2.2.15細胞用Dulbecco改良的Eagle培養基(DMEM)，在5%CO2、90%濕度、37℃的培養箱中培養。①MTT實驗:取對數生長期的細胞制成5×104/ml單細胞懸液，按100 μl /孔接種于96孔板中，培養24 h后，華蟾素組給予不同濃度的華蟾素(125 μg/ml，250 μg/ml，500 μg/ml，1 000 μg/ml，2 000 μg/ml)，另設對照組；藥物作用48 h后，酶標儀測定各孔吸光值(OD值)。根據公式計算細胞增殖抑制率：抑制率(%)=[(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值]×100%。利用SPSS 24.0軟件計算細胞的半數生長抑制濃度(IC50)。活性評價：IC50越低，則對腫瘤細胞的生長抑制活性越好。②流式細胞實驗:分別收集濃度為540.00 μg/ml、2 319.36 μg/ml的華蟾素處理48 h的 HepG2.2.15細胞及對照組細胞, 制備成濃度為1×106個/ml的單細胞懸液分別加入1.5 ml離心管中，1 500 rpm，5 min，棄上清；加入PBS 1 ml離心洗滌2次，棄上清。加入100 μl 1×結合緩沖液(試劑盒成份)重懸細胞，并加入5 μl磷脂結合蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和10 μl碘化丙啶(PI)，室溫避光反應15 min。400 μl結合緩沖液，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，FL1為綠色熒光，FL2為紅色熒光。Cellquest 軟件分析細胞凋亡情況。③蛋白免疫印跡法：分組處理細胞，待藥物作用48 h后收集細胞(操作步驟同前)，800 rmp離心5 min，1 ml PBS洗2次，吸干PBS，加適量WB/IP裂解液及苯甲基磺酰氟(PMSF)(1 ml裂解液加10 μl PMSF)，冰上裂解30 min，每10 min震蕩10 S，1.2×103rpm離心10 min(4℃)，上清液用BCA-100蛋白濃度測定試劑盒測定各組蛋白含量。每組樣品各取蛋白40 μg上樣，用10% SDS-PAGE 進行電泳。將凝膠上的蛋白轉移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶在常溫下封閉1 h，依次滴加一抗 (p53單克隆抗體，工作濃度均為1∶750，4℃，過夜)及二抗 (1∶10 000 HRP標記的羊抗鼠IgG，室溫，1 h)，設β-actin 為內參，用TBST(10 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，0.1% Tween-20，pH7.6) 洗膜后，采用ECL化學發光法進行觀察。④Realtime PCR檢測p53基因的表達：分組處理細胞待藥物作用48 h后收集細胞(操作步驟同前)，用Trizol提取總RNA，取5μl RNA用1%瓊脂糖凝膠進行電泳。用HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒把總RNA反轉錄成cDNA，p53 (168 bp) 上游引物為5'- GCCATGGCCATCTACAAG-3'，下游引物為5'-CCTTCCACCCGGATAAGAT-3'；內參照GAPDH(110 bp) 上游引物為5'-CCTCTGACTTCAACAGCGACAC-3'， 下游引物為5'-TGGTCCAGGGGTCTTACTCC-3'。然后根據Ultra SYBR Mixture(with Rox)試劑盒說明書，利用ABI Prism 7500檢測系統對引物進行擴增，20 μl反應體系:Ultra SYBR Mixture(2×)10 μl，上游引物(10 μM)0.4 μl，下游引物(10 μM)0.4 μl，模板2 μl，加RNase-free Water至20 μl。PCR循環參數設置：95℃ 10 min，(95℃ 15 s，60℃ 60 s)×40個循環；然后運用comparative 2-△△CT法分析各基因的相對表達。

1.3 動物實驗 裸鼠飼養在SPF環境中，溫度26～28℃，相對濕度30%～40%，12 h/12 h暗光循環，可自由獲取食物和水。將濃度2×107個/ml的HepG2.2.15細胞按每只0.2 ml接種于裸鼠腋皮下，約20 d后待腫瘤長至50～200 mm3時，根據瘤體積大致相等的原則分為2組：對照組6只，華蟾素組10只，灌胃0.2 ml，每日1次，連續15 d，對照組灌等體積的生理鹽水。每兩天一次測量裸鼠體重，游標卡尺測量瘤組織的長短徑，按計算公式V=ab2/2計算腫瘤的體積(體積：V，腫瘤長徑：a，腫瘤短徑：b)。第16天稱體重，處死小鼠后取瘤組織。用WB/IP裂解緩沖液裂解移植瘤。BCA試劑盒(Thermo，NCI1059CH)進行蛋白質定量。于SDS-PAGE跑膠，轉膜，一抗在4℃孵育過夜。二抗在室溫下孵育1小時，ECL顯影。在Bio-Rad的ChemiDOC XRS+成像系統(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)顯影成像。用Image Lab 5.0版軟件(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)分析灰度值。

1.4 統計學方法 使用SPSS 24.0進行統計學分析。使用雙尾t檢驗，雙向ANOVA和Mann-Whitney檢驗進行比較。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 華蟾素對體外培養的HepG2.2.15細胞增殖和凋亡的影響 MTT實驗結果表明，華蟾素對HepG2.2.15細胞的抑制作用隨濃度的升高而增加，當濃度分別為125 μg/ml、250 μg/ml、500 μg/ml、1 000 μg/ml、2 000 μg/ml時，相應的抑制率分別為24.30%、41.831%、49.62%、64.14%、80.65%(圖1A)。根據所得抑制率及相對應的藥物濃度，計算獲得華蟾素IC50和IC80濃度值分別為540.00 μg/ml和2319.36 μg/ml(圖1A、1B)。流式細胞學檢測結果顯示，華蟾素IC50組、IC80組細胞凋亡率明顯高于對照組，同時IC80組細胞凋亡率高于IC50組，差異均有統計學意義。由此可見，華蟾素可明顯促進HepG2.2.15細胞凋亡，且隨著藥物濃度增加，細胞凋亡率相應升高，二者之間具有一定的濃度依賴關系(圖1C～F)。

圖1 華蟾素對體外培養的HepG2.2.15細胞增殖和凋亡的影響

2.2 華蟾素對荷瘤裸鼠移植瘤體積的影響 分組給藥后，分別監測兩組裸鼠的體重及移植瘤體積的變化。在整個實驗過程中，華蟾素組與對照組裸鼠體重之間的對比沒有差異(P>0.05，圖2C)，證明兩組之間具有可比性；從移植瘤體積的變化中我們可以看出，華蟾素組自用藥第5天起，移植瘤體積的增長率明顯降低，與對照組相比具有統計學意義(0.424±0.472 4vs1.345±1.1276，P<0.05，圖2B)。

圖2 華蟾素對荷瘤裸鼠移植瘤體積和肝功能的影響

2.3 華蟾素對體內外培養的HepG2.2.15細胞p53表達的影響 動物實驗結果顯示，華蟾素組裸鼠移植瘤組織中的p53蛋白表達量明顯高于對照組，差異具有統計學意義(圖3a、b)；細胞學實驗部分結果顯示，華蟾素組(包括IC50組及IC80組)細胞中p53蛋白及p53 mRNA表達量與對照組相比均明顯增加(圖4c～f)，差異均具有統計學意義(P<0.05)；且華蟾素IC80組p53蛋白及p53 mRNA表達明顯高于IC50組，差異具有統計學意義(P<0.05)。因此可見，華蟾素可促進p53蛋白及基因的表達，且具有一定的濃度依賴性。

圖3 華蟾素對體內外培養的HepG2.2.15細胞p53表達的影響

3 討論

在我國，HCC是僅次于胰腺癌的第二大致死性腫瘤[2]，慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是我國肝癌的最主要病因，約85%的HCC患者攜帶HBV感染標志[3,4]。Maucort-B等[5]的研究中納入了全球770 000例HCC病例，結果顯示超過50%的病例歸因于慢性HBV感染，與HCC風險有關的HBV相關因素包括高病毒載量、HBeAg陽性狀態、基因型(C型、F型)、病毒變異以及伴有肝硬化等[6,7]；多項研究表明，這些因素對切除術后HCC復發和患者生存情況亦有負面影響[8,9]，而采用干擾素或核苷(酸)衍生物抑制HBV復制后，HCC的相對危險度可下降50%～60%[10]。本次實驗中采用的HepG2.2.15細胞是將含有HBV基因組的重組載體質粒pDolTHBV-1轉染人肝癌細胞株HepG2，經G418篩選而建立的細胞系，可穩定分泌HBsAg、HBeAg及完整的Dane顆粒。為了更好地模擬實驗藥物在體內對肝癌的影響，我們還將HepG2.2.15細胞接種于裸鼠腋皮下，從而成功建立裸鼠人肝癌移植瘤模型，為今后研究HBV相關HCC提供了一個很好的動物模型。

目前HCC的治療方案主要有手術切除、肝移植、經皮局部消融、化療和分子靶向治療等[11]，但因各種限制因素很難取得理想療效；中醫藥治療HCC可明顯改善患者癥狀，毒副反應小，保持較好全身狀態，延長帶瘤生存期等，在中晚期肝癌的綜合治療中占據越來越重要的地位，其中華蟾素在HCC的中醫藥治療中占有重要的地位。華蟾素有清熱解毒、利水消脹、化癖軟堅等功效，可以起到抑制腫瘤生長、延長生存期、改善生存質量等作用[12,13]。相關基礎研究也發現，華蟾素可將體外培養的HepG2細胞阻滯于G2/M期，促進細胞凋亡，其機制可能與調節凋亡相關因子Bcl-2、Bax及p53等的表達有關[14]；華蟾素及其有效成分可通過抑制細胞增殖，破壞細胞周期，抑制血管生成，逆轉多藥耐藥性，調節免疫應答等途徑來展現顯著的抗腫瘤活性[15]。本次實驗結果顯示，華蟾素對HBV相關HCC的生長具有明顯的抑制作用。

除此之外，腫瘤的發生也與抑癌基因有關，其中p53基因是迄今發現與人類腫瘤相關性最高的抑癌基因，實驗研究表明表達HBx的肝細胞和HBx/c-myc雙基因敲入的小鼠中都發生了染色質重塑復合物成分(ZNF198和SUZ12)的下調，這種下調最終導致p53介導的細胞凋亡的水平降低[16,17]；同時HBx蛋白可以與p53蛋白結合使其失活[18]。p53蛋白可通過與病毒增強子相互作用，抑制HBV基因轉錄和抗原表達[19]。本次實驗結果顯示華蟾素可能是通過p53通路抑制腫瘤細胞增殖、促進其凋亡，進而抑制腫瘤的生長，但具體的作用機制尚需進一步研究。

通過本次研究我們可以發現，華蟾素可以抑制HBV相關肝癌細胞增殖，促進細胞凋亡，從而抑制HCC生長，機制可能與促進p53基因表達有關。