肝臟疾病類器官模型的研究進展

林允禎，王經琳，任昊楨，施曉雷

（南京大學醫學院附屬鼓樓醫院 普外科，江蘇 南京 210008）

將胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）、誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）或來源于組織的干、祖細胞通過三維培養技術進行體外培養獲得的細胞簇被稱為類器官[1]。類器官相較于傳統二維細胞培養及動物模型試驗有著獨到的優勢，隨著細胞外基質研究的加深以及新型支架材料的出現，體外三維培養能夠更加接近細胞在體內生活的環境。同時，類器官無需面臨傳統實驗動物研究中存在的物種差異問題。目前關于胃[2]、腦[3]、肝臟[4-5]等多種器官體外類器官構建已相繼有報道。除此之外，類器官還可應用于模擬腫瘤等疾病的發生發展[6-7]以及藥物敏感性的檢測等研究[6，8]。

肝臟是人體內最大的代謝器官，可以合成膽汁、蛋白質等物質，同時在免疫、代謝、凝血等多方面都發揮功能，研究肝臟的生理及病理狀態有重要意義。傳統的研究方式是通過肝細胞體外培養以及小鼠模型實現，隨著原代肝細胞獲取難度大、體外培養增值能力差且細胞極性不能長期維持等問題的暴露，傳統培養模式不能滿足肝臟實驗的需求，肝臟類器官的出現較好彌補了其不足。目前肝臟類器官可以應用于構建正常肝臟模型，并且具有形成肝臟內復雜管道結構的能力[5，8-9]，同時也可應用于乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染[7，10]、肝癌發生發展[6，11]等肝臟疾病相關的研究。本文主要闡述肝臟類器官構建的方式以及類器官在肝臟疾病中的應用。

1 類器官的構建

1.1 細胞的選擇

理想的構成類器官的細胞需要具備自我更新的能力，以及能夠被誘導分化成為其他不同類型的細胞。基于此，ESCs、iPSCs，來源于組織器官的干、祖細胞則常被選擇成為構建類器官較為常見的種子細胞。

ESCs多取自囊胚期的內細胞團，分化潛能較高，并且由于早期缺乏表觀遺傳，組織相容性抗原不表達，因此不存在排斥反應，可以進行異體移植，理論上是構建類器官較為理想的材料。日本科學家山中伸彌通過將四種轉錄因子導入已分化的體細胞，使其發生重編程，重新轉變為具有分化潛能的iPSCs[12]，而對重新獲得分化潛能的細胞可再次進行誘導分化，獲得滿足需求的細胞。由于誘導iPSCs來源不涉及胚胎，倫理爭議較小，目前在研究領域應用廣泛[13]。而來源于組織器官的干、祖細胞培養方式相對便捷，能誘導分化成為特定組織來源的細胞，針對性較強[14]。

盡管理論上存在著多種選擇，但是不同細胞仍有其局限性所在，ESCs不能排除可能存在的致畸風險，且需要面臨倫理爭議等問題[13，15]。體細胞在經歷重編程時有可能造成基因組穩定性發生變化，并且由于存在表觀遺傳修飾，iPSCs在針對肝癌等表觀遺傳機制發揮重要作用的疾病的應用仍需要進一步討論[1]。成體干、祖細胞面對的問題則是細胞分化面窄，僅能分化成為與來源組織較為接近的一種或幾種細胞。對于類器官種子細胞的選擇，仍需要考慮到實驗需求以及細胞限制等諸多問題。

1.2 培養結合載體

三維培養過程中，“細胞基質”與“細胞溝通”發揮重要作用[16]，支架能夠提供適合細胞生長的微觀結構。理想的細胞支架可以促進細胞生長與黏附，包含維持細胞活力的營養環境，并且生物降解速率與細胞在新環境中基質沉積速率相類似[13]。

根據支架來源不同可分為合成聚合物支架與生物聚合物支架，前者有較成熟的合成工藝，機械強度高，價格低廉；而生物聚合支架具有較好的生物活性，能夠更好促進細胞和組織之間的相互作用[17]。目前脫細胞支架，水凝膠等細胞支架已經應用于各類三維培養系統中。脫細胞支架是指利用洗滌劑或酶制劑將離體組織器官內細胞除去，同時保留器官基本外形、管道結構、胞外基質、細胞因子等[18]。由于細胞生活環境動態多變，目前模擬培養環境仍不能完全反映真實的人體內環境，脫細胞支架在這一方面具有天然優勢，能夠極大程度保留細胞生長環境中的各種組分，同時提供管道結構用于支撐以及物質的傳遞。天然的水凝膠可以從膠原蛋白、纖維蛋白、殼聚糖等聚合材料中獲得，含水量高，生物相容性和天然組織類似，毒性較低，種植在水凝膠中的細胞可均勻分布在水凝膠各處。在起到支撐作用的同時，可溶性的細胞因子還可通過水凝膠向細胞傳遞。目前，水凝膠支架材料已廣泛應用于骨、軟骨、血管等組織工程[13]。隨著材料學、3D打印技術等的發展，新型支架也不斷出現。聚乳酸、聚乙二醇、聚己內酯等材料已經應用于支架的合成，Ng SS 等[16]利用聚乙二醇丙烯酸酯用于膽管類器官構建。而另一種新型聚合材料支架，聚（3-羥基丁酸-3-羥基戊酸-3-羥基己酸）[Poly（3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate-co-3-hydroxyhexanoate），PHBVHHx]支架在電鏡下可觀察到不同孔徑的蜂窩狀結構，隨著溫度的調整可以改變孔徑的大小，基于此構建的肝臟類器官對于肝衰竭小鼠有較好的治療效果[15]。石墨烯具有疏松多孔的特性，便于氧氣的運輸，同時機械強度大，生物降解性良好，以石墨烯為材料的 支架已經在心臟、軟骨、神經元等組織工程中取得了一定成果[19]。單純的合成支架缺乏促進細胞粘附、生長的條件，往往需要在支架表面涂布細胞外基質蛋白，相較于層黏蛋白，纖連蛋白等其他常見細胞外基質蛋白，I型膠原能夠更好促進細胞粘附在支架上并且進行增殖，是合成支架中較為常見的表面涂布材料[16，20]。綜上，細胞支架的選擇依賴于類器官構建的功能需求。

1.3 細胞因子及共培養

類器官培養過程中需要根據實驗需求不斷改變培養基條件，可以引入不同的細胞因子誘導細胞進行增殖或者定向分化。類器官構建早期階段，需要誘導細胞增殖，獲得足夠的細胞量以進行下一步實驗，在細胞培養基中引入表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）、Wnt信號通路相關調節因子如Wnt3A、R-spondin 1（RSPO1）可有效促進細胞增殖。之后根據實驗需求誘導細胞進行定向分化，引入骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP），地塞米松等細胞因子可將增殖的細胞向肝細胞方向誘導分化[21-22]，HGF、EGF、FGF、RSPO1等因子的引入可以使細胞在體外擴增數個月，且細胞可同時表達肝和膽管相關的標志物，進一步在培養基中引入BMP與地塞米松之后，可以觀察到白蛋白（albumin，ALB）、α1-抗胰蛋白酶等肝細胞相關標志物表達的提升，提示加入的誘導因子促進增值的細胞向肝細胞進行轉化[22]。改變誘導條件，在分化培養基中加入一定量mTeSR培養基則可將增殖細胞向膽管細胞方向誘導[5]。

除了引入特定的細胞因子誘導細胞進行分化以外，還可以通過細胞共培養的方式誘導細胞分化，將間充質干細胞與肝細胞共培養4 周可獲得具有肝細胞功能的肝樣細胞，而肝細胞損傷后釋放的細胞因子也可促進間充質干細胞向肝細胞轉化[15]。共培養不僅提供了細胞生長分化所需的細胞因子，同時也促進類器官的形成與復雜結構的產生，星狀細胞與肝細胞共培養過程中，肝細胞聚集在星狀細胞周圍形成細胞團塊，而進行單細胞培養的肝細胞大多以散在形式存在[20]。iPSCs、內皮細胞、間充質干細胞的共培養能夠誘導肝芽組織形成并且能夠快速血管化，復雜管道結構能夠進行營養物質、細胞因子及代謝廢物的傳遞，對較大體積類器官的構建、研究發生于內皮層面的生理病理過程等方面有著重要意義[8，23-24]。

2 不同肝臟類器官的構建

2.1 正常肝臟類器官

肝臟有較強的再生能力，當肝臟發生損傷時，門靜脈周圍的肝細胞能夠及時修復肝臟，而在有毒物質作用于肝臟細胞時，膽管周圍細胞會擴增用于肝臟的修復，但損傷修復面臨著閾值以及時間的限制。急性肝衰竭發生時，肝移植是目前唯一有效的治療方法，但肝源短缺限制了肝移植療法的臨床應用價值。體外培養肝細胞則需要面臨獲取難度較高、原代肝細胞體外增值能力有限、長期培養過程中可能出現功能喪失等問題[20]。肝類器官由于體外培養過程中能夠維持干性以及表現出特定器官的功能，作為肝移植替代療法具有較大的應用前景。同時肝類器官能夠彌補經典模型在肝臟代謝研究方面的局限，用于研究肝臟損傷、藥物代謝及毒性反應。

肝臟類器官的構建通常需要擴增與分化兩步，通過改變培養基的條件實現細胞的擴增或者定向分化，通過引入細胞因子擴增細胞并誘導分化至內胚層階段，后根據需要進一步將其誘導成肝細胞[8-9，22]。除了引入特定的細胞因子以外，也可通過改變培養的條件誘導細胞分化，Mun SJ等[8]發現構建缺氧環境同樣可以促進內胚層細胞向肝類器官分化。

正常肝臟除了肝細胞外，膽道系統也是肝臟組成的重要部分，肝細胞由內胚層分化而來，而膽管上皮細胞由中胚層分化，通過引入FGF、激活素A（Activin A）等因子，將誘導至內胚層的細胞進一步誘導至中胚層，并在膽管細胞培養基中進一步培養成為膽管類器官[5]。Wang S等[21]擴增ESCs并通過流式細胞術分選出上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EPCAM）陽性的細胞，導入誘導因子培養兩周后，鏡下觀察發現細胞形成空心管樣結構，同時膽管細胞相關標志物細胞角蛋白19（cytokeratin 19，CK19）、EPCAM、γ-谷氨酰胺轉肽酶（gamma glutamyl transferase，GGT）等表達上調，肝細胞相關標志物如甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、TBox3（TBX3）等表達下調，羅丹明123（rhodamine 123，Rho123）代謝實驗檢測膽管標志物多耐藥相關蛋白1（multidrug resistance-associated protein 1，MRP1）提示陽性，表明類器官中具有較為成熟的膽管結構。

關于肝類器官或者膽管類器官的培養方法已有不同團隊相繼報道，但是如何在培養的組織器官中共同表達肝細胞與血管、膽管等復雜結構仍是目前需要解決的問題。有研究發現mTeSR培養基可能影響NOTCH和TGF-β信號通路影響肝類器官的分化過程，在將iPSCs誘導至內胚層階段后，向培養基中加入25% mTeSR培養基促進部分內胚層細胞向中胚層轉化，進一步促進細胞成熟可培養同時表達肝細胞與膽管結構的類器官[5]。

正常肝類器官獲取簡單，體外擴增便捷，能夠長期保持細胞極性及功能，在基礎實驗及臨床應用中有廣泛前景，目前，針對藥物代謝以及肝損傷后類器官治療已有部分研究報道[25-26]。在臨床前實驗中，對豬進行85%肝切除構建肝衰竭模型后，通過三維培養豬肝細胞進行治療，大部分治療組的豬存活時間超過90 h，且體內代謝廢物堆積水平明顯低于對照組，而對照組存活時間在30～50 h，肝切除48 h后檢測肝臟體積發現肝臟體積部分恢復，增殖相關標志物Ki-67表達上升[27]。而另一項關于靈長類動物實驗中也觀測到了類似的結果，利用α-鵝膏蕈堿及脂多糖處理30只恒河猴構建急性肝衰竭模型后，在豬肝類器官為基礎的生物人工肝治療下，恒河猴存活率明顯提升，且免疫排斥反應弱，腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、白細胞介素12（interleukin-12，IL-12）、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）等因子水平降低，炎性細胞在治療后逐漸下降到正常水平，增殖相關標志物表達上升，肝臟損傷狀況得到了明顯改善[28]。

2.2 脂肪肝類器官

脂肪肝是常見的代謝性疾病，根據發病因素的不同可以分為酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝，隨著肝細胞脂肪變程度的加深，肝臟結構及功能受損，可進一步導致肝臟結構改變，引發肝炎、肝纖維化甚至肝硬化。將胎兒間充質細胞和ESCs共培養，構建的類器官可表達乙醇代謝相關酶如乙醇脫氫酶以及細胞色素P450超家族（cytochrome P450 proteins，CYP）成員CYP2E1，進一步使用乙醇處理類器官后，肝損傷標志物表達上升，并出現肝脂肪變性、纖維化、線粒體膜電位去極化等與乙醇肝損傷相似表現[21]。非酒精性脂肪肝受到多種因素調控，目前仍未完全闡明其發病機制，研究疾病的發生及發展有較大意義。肝細胞和肝星狀細胞在肝纖維化過程中發揮著重要作用，將肝細胞與肝星狀細胞共培養形成的肝類器官置于含有脂肪酸、棕櫚酸、油酸的混合培養基中可以誘導脂質堆積以及膠原分泌，而抗脂肪變性和抗纖維化的藥物如奧貝膽酸可減輕癥狀[29-30]。除代謝環境的影響外，相關基因的表達異常也可導致肝脂肪變性。小干擾RNA 122（microRNA-122，miR-122）在抑制炎癥、壞死、脂肪變性方面有調控作用，在肝細胞和星狀細胞共同構建的類器官中，抑制miR-122 可導致趨化因子配體2（chemokine ligand 2，CCL2）、趨化因子配體3（chemokine ligand 3，CCL3）、TNF-α、IL-6等炎性因子表達的上升，同時細胞發生脂肪變性和纖維化[31]。肝脂肪變性及纖維化受到遺傳信號、代謝環境等多種因素的控制，類器官可為疾病研究提供一種便捷、可重復的實驗模型。目前脂肪肝類器官應用于藥物代謝模型較多，臨床前研究及臨床試驗尚無報道。

2.3 乙肝類器官

目前中國仍是乙肝大國，HBV感染導致的肝硬化乃至肝癌仍是影響國人生命安全的主要因素之一。HBV感染存在明顯異質性，部分人可表現為有限或者無癥狀的感染，而部分人則會發展成肝硬化甚至肝癌。經典二維細胞培養模式除了要面對細胞來源缺乏以及不能較好模擬體內環境的問題外，有限的增殖能力也導致病毒相關的遺傳修飾不能保存，為進一步研究增加了困難[10]。類器官在長期保存、體外增殖、模擬細胞與組織器官間相互作用等方面具有優勢，可以構建體外長期保存的HBV感染模型。

通過病毒感染類器官，感染相關蛋白的表達是關鍵，牛磺膽酸鈉轉運多肽（sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP）可能是HBV侵入細胞的關鍵受體之一，有研究表明，在肝癌細胞系中過表達NTCP容易導致HBV的感染，并且已有團隊通過HCV感染肝癌細胞系得到HCV感染模型[32]，但是相比于正常細胞系，肝癌細胞系中包括先天性免疫在內的多條引號通路缺失，這對病毒感染機制的研究造成一定影響[10]。合適的細胞則是成功構筑病毒感染模型的另一項要素，iPSCs具有較好的增值能力及分化潛能，是病毒感染類器官的良好細胞選擇。Ng SS等[16]利用反相聚乙二醇支架培養iPSCs構建類器官，可表達與病毒侵襲及包裝的相關蛋白，進一步利用病毒感染類器官構建病毒類器官模型。Kaneko S等[10]構建了由肝祖樣細胞（induced pluripotent stem cell-derived hepatic progenitor cells，iPSHPCs）和分化肝樣細胞（induced pluripotent stem-cellderived hepatocytes，iPS-Heps）兩種不同細胞來源的感染類器官，Nie YZ等[7]利用iPSCs、骨髓間充質細胞、人臍靜脈內皮細胞共同培養構建肝類器官，通過HBV感染成功構建乙肝類器官。由iPSCs構建的乙肝類器官能夠彌補傳統模型的不足，同時具備較完備的信號通路，能夠滿足對于HBV感染機體的研究，并可進一步針對其信號通路研究治療藥物及方法。

2.4 肝癌類器官

原發性肝癌是致死性惡性腫瘤之一，隨著生活水平質量的提高，糖尿病、肥胖等危險因素增加，肝癌的發病率也在逐年上升。全基因組測序發現了肝癌患者存在大量基因突變，這對于人類理解肝癌的發生起到了很大幫助。然而，肝癌具體發生機制仍未完全闡明，傳統二維培養模式下的腫瘤細胞無法實現細胞與細胞間、細胞與周圍環境間相互交流的過程，通過三維培養的腫瘤細胞可以更準確展現出腫瘤細胞對腫瘤微環境的構建，反映出腫瘤發生過程中的真實過程，對腫瘤治療靶點及藥物篩選可起到一定指導作用[33-34]。

有研究團隊篩選肝細胞肝癌及膽管細胞癌高突變基因并在構建的肝類器官中進行誘導表達，發現誘導肝癌高突變基因c-myc的表達導致組細胞形態更加無序，ALB表達下降，將類器官移植入實驗小鼠后發現小鼠形成肝癌，而誘導膽管細胞癌高突變基因RASG12V在類器官中的表達后發現細胞形成黏液空泡樣，SOX9、CK19 等膽管細胞相關標志物表達上調，提示該肝細胞向膽管細胞癌細胞轉化[11]。將來源于肝細胞肝癌、膽管細胞性肝癌、膽管細胞癌的腫瘤細胞進行三維擴增培養，觀察培養物形態，相比于健康肝類器官，腫瘤類器官表現出更加不規則的形態結構，肝癌標志物AFP和磷脂酰肌醇聚糖3（Gypican-3，GPC3）明顯上升，而ALB、轉甲狀腺素蛋白（transthyretin，TTR）、載脂蛋白A1（apolipoprotein A1，APOA1）、載脂蛋白E（apolipoprotein E，APOE）等肝臟標志物隨著腫瘤來源的不同表達也存在差異，而不同來源的肝癌類器官對不同腫瘤藥物的敏感性也有所不同，提示肝癌類器官在體外培養的條件下仍能保持和來源組織相同的性質[6]。體外培養的肝癌類器官能夠保持高增殖能力的同時保持原有腫瘤的性質，為腫瘤研究提供了一個簡便、穩定、可重復的實驗模型。

3 小結與展望

類器官可以在極大程度上彌補傳統研究方法上的不足，對于模擬肝臟的發生、損傷修復、疾病與機體相互作用、藥物篩選等方面可以發揮重要作用。目前肝臟類器官在基礎研究中已有一定研究基礎，但是類器官的臨床應用仍然面臨著諸多挑戰，距離完全成熟的人工肝臟仍有較長距離，對于復雜血管、膽管等的模擬仍然無法完美實現。目前類器官仍有較大的進步空間，在生命科學研究上有巨大的應用前景。隨著材料學等相關學科的發展，相信相關問題會逐步被攻克，類器官會廣泛應用于科研及臨床的各個方面。