循環游離DNA的生物特性及其在乳腺癌中的應用

樊麗壯，王 博，徐愛蘭，劉艷佳

（佳木斯大學附屬第一醫院腫瘤科，黑龍江 佳木斯 154003）

乳腺癌（breast cancer）是女性發病率最高的癌癥，也是癌癥死亡的主要原因[1]。目前，基因組測序已實現自動化，基因芯片技術變得更加成熟，分子生物學技術應用于乳腺癌已成為一種趨勢。循環游離DNA（circulating cell-free DNA，cf-DNA）是指血液或體液中游離于細胞之外的DNA。其檢測具有操作簡單、實時性、易于取樣（且可重復取樣）、靈敏度高、創傷性小等優點，在乳腺癌臨床中具有明顯優勢，可作為一種容易被人們接受的檢測手段進行大范圍推廣。本主要報道關于cf-DNA的研究及其乳腺癌中的應用進展，期望其能夠在臨床中大范圍應用，提高乳腺癌的診斷率。

1 循環游離DNA的生物學研究

1.1 cf-DNA的生物學行為 cf-DNA 以三種不同形式存在體液中：游離細胞DNA 片段、囊泡結合DNA和DNA 大分子復合物，可分為兩種主要類型：無細胞核（cf-nDNA）和線粒體DNA（cf-mtDNA）[2]。研究發現[3]，劇烈的體育鍛煉可提高循環細胞線粒體DNA（cf-mtDNA）的水平。慢性腎功能衰竭與低cf-DNA 攝取和低血漿cf-DNA 水平相關，表明腎臟參與了cf-DNA的清除[4]。由于癌癥患者cf-DNA 水平較高，確定其來源能夠幫助鑒定和定位疾病。cf-DNA的片段化譜可能揭示癌癥患者的組織起源[5]。然而，cf-DNA的水平在疾病的不同階段含量不同。在早期階段，它可能低至每5 ml 血漿中僅有一個基因組當量[6，7]。大部分cf-DNA 片段在80～200 bp[8]。cf-DNA 濃度及其鏈完整性可作為鑒定結核病與非小細胞肺癌的指標。此外，cf-DNA的完整性對區分非小細胞肺癌和結核病高于傳統的腫瘤標記[9]。另外，cf-DNA 分析作為一種新興技術在器官移植檢測、無創產前檢查（NIPT）和腫瘤液體活檢等方面應用廣泛[10-12]。

1.2 cf-DNA 中的特殊類型ct-DNA 腫瘤患者血漿內循環腫瘤細胞或原位腫瘤細胞釋放進入循環的cf-DNA 稱為循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ct-DNA）。ct-DNA 檢測是當前研究的熱點。ct-DNA 屬于cf-DNA的一種類型，反映了不同腫瘤部位轉移的大小和活性的動態變化[13]。其片段長度多小于160 bp[14，15]。ct-DNA 在循環中的半衰期短，一般為16 min～2.5 h，適用于腫瘤負荷的實時監測[16]。快速生長的腫瘤在自身壞死和腫瘤體積收縮時產生ct-DNA 峰值，表明持續的ct-DNA 釋放可能需要活的腫瘤細胞[17]。ct-DNA 在乳腺癌中的應用首先建立在轉移性疾病中，因為腫瘤負荷與其總量有關[18]。通過序列分析可以監測腫瘤內的異質性和克隆進化，從而改善疾病控制和指導治療決策[19]。在乳腺癌早期，腫瘤負荷有限，ct-DNA 在患者血液中的濃度可能很低，因此早期發現乳腺癌仍然具有挑戰性[20]。有研究檢測到Ⅰ期或Ⅱ期乳腺癌患者血漿中的癌癥突變，分析顯示ct-DNA 濃度與患者腫瘤的變化高度一致，表明ct-DNA 分析有助于乳腺癌的篩查和管理[21]。

1.3 cf-DNA 與腫瘤體積的相關性 隨著對cf-DNA的深入研究，cf-DNA 與腫瘤體積之間有相關性逐漸顯露。腫瘤體積大、肝轉移的患者的ct-DNA 檢測率較高[22]；總代謝腫瘤體積和cf-DNA 高的患者無進展存活期較短[23]。ct-DNA 可作為癌癥治療期間的監測工具[24]。同時，cf-DNA 顯示出在癌癥治療后成為反應評估的新生物標志物的潛力，可作為腫瘤體積的評估工具。

2 cf-DNA的檢測

2.1 血液樣本采集 血漿樣品分析前處理的變化會影響cf-DNA 分析的結果[25]。晝夜循環和膳食消耗不會顯著影響總cf-DNA，供體間血漿cf-DNA 濃度差異歸因于人身體差異[26]。Madsen AT 等[27]的研究證明，當間隔3 h 進行5 次抽檢時，血漿cf-DNA 濃度在最后抽檢時下降。變異等位基因頻率僅在96 h的EDTA 管中受cf-DNA 濃度波動的影響。BCT 和Cell Save 管均在96 h 時保持了最佳cf-DNA/ct-DNA 質量，且使用的防腐劑不影響dPCR的下游cf-DNA/ct-DNA 分析[28]。高容量等離子體收集裝置收集的等離子體中存在高質量的cf-DNA。能夠從單個個體收集大量的cf-DNA，將有助于臨床操作、最小疾病監測和癌癥的早期發現[29]。

2.2 血漿cf-DNA的提取 CANCER-ID 聯盟使用人工插入血漿對實驗流程進行了多中心評估，結果差異顯著，因此謹慎選擇cf-DNA 提取方法具有重要意義。Qiagen CNA 和MaxweⅡRSC 試劑盒相比，擴增的短尺寸片段和腫瘤特異性突變具有相似的完整性和水平。然而，Qiagen CNA 試劑盒始終顯示出最高的cf-DNA 和短片段，而MaxweⅡRSC 和QIAamp MinElute cf-DNA 試劑盒顯示出更高的變體等位基因頻率[30]。有研究[31]比較了11 種提取cf-DNA的方法、3 種定量方法和2 種建立DNA 完整性的測定方法，發現QIAamp CNA kit 和the Norgen Plasma/Serum Circulating DNA kit 可作為更好的選擇。另外研究[32]對七種市售的cf-DNA 提取試劑盒進行評估，發現QIAamp CNA kit 可提供最高的cf-DNA 產量和部分低分子量。

2.3 血漿cf-DNA的檢測方法 目前cf-DNA 檢測方法有甲基化特異性PCR 法、聚合酶鏈反應-單鏈構象多態性分析法（PCR）、TaqMan 探針法、DNA 序列測序法、微滴式數字（ddPCR)等。cf-DNA 分析的進展高度依賴于技術進步，因為需要用高度敏感的技術將樣品中突變或甲基化等位基因的檢測出來。在檢測cf-DNA 中EGFR 突變的ddPCR 似乎比ARMS-PCR 有更高的敏感性，特別是在早期[33]。ddPCR 技術檢測ct-DNA 具有高靈敏度和特異性，該檢測可用于準確的疾病監測，耐藥性突變的鑒定以及實體瘤患者前期治療的評估[34]。隨著ddPCR 技術的發展和優化，目前ct-DNA的檢出限可低至0.001%，準確度高，為ct-DNA的臨床應用開辟了廣闊的空間[35]。

3 cf-DNA 在乳腺癌中的應用

3.1 早期診斷和篩查 cf-DNA 檢測是一種快速、實時、低成本、非侵入性的腫瘤基因檢測方法，可以在乳腺癌基因水平進行早期診斷、篩查、鑒別診斷。腫瘤是由癌基因、腫瘤抑制基因和/或DNA 穩定性基因的遺傳和表觀遺傳變化的積累引起的，DNA 甲基化是早期癌變的表觀遺傳學標記物，可成為篩查和早期診斷癌癥的標志物[36]。DNA 甲基化是由DNA 甲基轉移酶（dnmts）催化，甲基（-CH3）共價轉移到CpG 二核苷酸中胞嘧啶環的第五個碳，形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）[37]。高甲基化的啟動子造成抑癌基因失活是腫瘤發生的共同特征，腫瘤中低甲基化發生在基因組中是一種常見現象[38]。在乳癌患者的血漿樣本中，可檢測到BRCA1、RASSF1A 和GSTP1 基因中至少有一個基因的啟動子甲基化[39]。DNA 甲基化特征、遺傳風險評分、環境風險評分的聯合應用可以準確地預測乳腺癌的發生率，可用于高風險人群的篩查[40]。乳腺組織中含有豐富的5-羥甲基胞嘧啶基因組位點，并提供了正常乳腺組織中核苷酸水平5-羥甲基胞嘧啶的全基因組圖譜[41]。RARB2、DAPK、hMLHI、p14 和p15的高甲基化均會增加乳腺癌的易感性[42，43]。在雌激素受體陽性乳腺癌的發展過程中，miR-190b的上調可能通過啟動子DNA 甲基化的缺失而發生，miR-190b的低甲基化導致LuminalA 亞型乳腺癌特異性生存率的增加[44，45]。BRCA1 和BRCA2 突變攜帶者cf-DNA 水平明顯高于非攜帶者，這一發現有助于高危婦女早期發現乳腺癌/卵巢癌[46]。乳腺導管癌組的FHIT 基因ct-DNA 甲基化水平非常高，有助于乳腺導管癌的早期診斷[47]。cfDNA的甲基化評估可以同時篩查乳腺癌、直腸癌和肺癌[48]。以上這些研究為乳腺癌的cf-DNA 檢測提供了靶點，未來的研究可以用這些靶點對乳腺癌進行早期診斷和篩查及鑒別診斷。但cf-DNA 在乳腺癌的早期診斷和篩查也存在不足。作為一種生物化學檢測方式，cf-DNA 在乳腺癌檢測中如何優化最佳靶點、提升特異度和敏感度、提高準確率等都是需要解決的問題。

3.2 療效和預后評估 病理檢查是診斷腫瘤“金標準”。但病理檢查是一種高侵襲性、昂貴且耗時的方法，不適用于少量的腫瘤組織或療效檢測以及腫瘤的預后評估。血清cf-DNA 水平及其完整性可作為乳腺癌的輔助診斷、腫瘤分級和預后評估的生物標志物[49，50]。測序技術對乳腺癌患者血清cf-DNA的檢測具有足夠的穩定性和特異性[51]。另外血清樣本可長期保存，在監測乳腺癌預后方面具有重要作用。檢測總cf-DNA 水平是評估轉移性乳腺癌患者總生存率和無進展生存率的良好預測指標[52]。在轉移性乳腺癌患者中，接受治療后患者的cf-DNA 濃度降低，cf-DNA 完整性增加。cf-DNA 變量組合可以作為轉移性乳腺癌患者在基線和第一個系統治療周期后的獨立預后標志物[53]。cf-DNA 腫瘤率閾值≥10%與三陰性乳腺癌轉移患者生存率顯著降低相關[54，55]。高cf-DNA 突變負荷與較低的無復發生存率相關，cf-DNA 中腫瘤特異性體細胞變體的存在與較差的無復發生存率相關[56，57]。總之，cf-DNA檢測可以反復進行，在監測乳腺癌分子進化、治療效果及預后評估方面有著獨特的優勢。

4 總結

乳腺癌是世界范圍內女性發病率最高的惡性腫瘤之一，早期無創診斷對降低癌癥相關死亡至關重要。cf-DNA 在乳腺癌早期診斷和篩查、療效檢測、預后評估等方面的應用還面臨著諸多問題，需要進一步深入研究。作為一個具有潛在價值的生物標志，相信隨著研究的不斷深入，cf-DNA 在乳腺癌中的作用會逐漸被揭示并最終應用到臨床。