生物學方法促進肩袖腱骨愈合研究進展

廖昊燃 余偉林 胡慶翔 趙華昆 何耀華

流行病學調查研究顯示，肩袖損傷在20 歲以上人群中的比例達20%，而在60 歲以上人群中的比例高達54%［1］。盡管關節鏡手術量逐年增加，手術技術也得到了顯著提高，但肩袖損傷術后再撕裂率仍在26.6% ～ 94%［2］。目前，大多數學者認為肩袖腱骨愈合不佳是影響手術效果最為關鍵的因素。

正常腱骨止點是一系列高度特異排序的組織，其主要作用為傳遞軟組織至骨的復雜機械應力，由四部分組織構成：肌腱組織、未鈣化纖維軟骨、鈣化纖維軟骨和骨組織［3-4］。研究發現，肩袖損傷術后，腱骨愈合多為瘢痕愈合，腱骨止點生物力學強度明顯降低［5］。因此，為了能更好地解決肩袖腱骨愈合這一難題，越來越多新的方法被發現并加以應用。本文擬對促進肩袖腱骨愈合的方法這一關鍵問題作一綜述，旨在從生物學方面為臨床治療提供參考。

一、生長因子

生長因子是一類細胞因子，前期研究顯示生長因子能夠促進肩袖腱骨愈合。主要包括：血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）、骨形態生成蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor,FGF）［6-7］。

VEGF 是一種高度特異性的促血管內皮細胞生長因子，在肩袖腱骨愈合的再血管化及塑形改建過程中起到重要作用。Huang 等［8］探討VEGF 參與肩袖損傷術后腱骨界面愈合的機制。已知VEGF 能通過Yes 相關蛋白（Yes-associated protein,YAP）通路發揮作用，Huang 等利用YAP 的抑制劑Verteporfin 對大鼠岡上肌腱損傷手術模型進行干預，并對術后腱骨界面失效載荷進行機械測試和分析。與對照組對比結果顯示，Verteporfin 顯著降低了岡上肌腱的失效載荷。因此，Huang 等認為Verteporfin 可以通過抑制YAP 通路來影響VEGF，間接證實了VEGF 可以幫助肩袖腱骨獲得更好的機械性能。已知microRNA-205-5p 能調控間充質干細胞的表達，Xu 等［9］通過雙熒光素酶報告基因檢測證實VEGF 能通過抑制microRNA-205-5p 的表達促進間充質干細胞的增殖與分化，從而促進肩袖腱骨愈合。VEGF 促進肩袖腱骨愈合的研究較少，只能間接證實VEGF 對肩袖腱骨愈合有促進作用，可針對血管形成與肩袖腱骨愈合作進一步研究。

TGF-β 可以促進間充質干細胞和成骨細胞的增殖、分化，加快骨和軟骨形成。 Han 等［10］研究發現，負調控TGF-β 會導致肩袖生物力學性能降低。Yamakado 等［11］的研究結果顯示，采用肝素／纖維蛋白將TGF-β 輸送到肩袖腱骨止點處修復岡上肌損傷，結果證實TGF-β 能促進肩袖腱骨愈合，改善力學性能。TGF-β 需要與載體結合才能被輸送到肩袖損傷處，不同載體的選擇對于肩袖腱骨愈合可能產生不同的影響，進行研究時必須將載體可能帶來的影響考慮在內。

BMP 源于骨與骨源性細胞，BMP 可參與機體信號通路表達，調節軟骨、骨、血管等的生成與腱骨愈合［12］。Rodeo［13］構建了羊肩袖損傷的動物模型，將具有成骨活性的生長因子BMP 植入肩袖腱骨止點處，MRI 及組織學研究顯示試驗組肩袖腱骨止點處比對照組形成更多的骨組織和結締組織，生物力學強度更優。雖然BMP 能促進肩袖腱骨愈合，但尚未達到恢復正常復合結構的程度，因此單一應用BMP 進行肩袖腱骨愈合的研究較少。

FGF 是一種多向性生長因子， 分為堿性FGF（basicFGF,bFGF）和酸性FGF（acidicFGF,aFGF），二者具有相同的生物學效應。研究顯示［14］，bFGF 可以促進成纖維細胞的分裂、增殖、分化，促進骨和軟骨組織的形成，還可協同VEGF 促進血管的生成和肌腱的生長。Ide等［15］在大鼠肩袖損傷的腱骨止點處植入纖維蛋白膠包裹的bFGF，并使用肌腱成熟分級系統對術后標本進行組織學評價。結果證實纖維蛋白膠包裹的bFGF 對肩袖腱骨止點處早期愈合具有一定的促進作用。FGF 在肩袖腱骨愈合領域的研究主要集中在bFGF,可以考慮將aFGF 應用于肩袖腱骨愈合進行一定的研究，并對兩者得出的結果進行對比研究。

雖然已有大量的研究證實生長因子能促進肩袖腱骨愈合，但相關載體的選擇標準以及如何將生長因子準確輸送到肩袖損傷處等問題仍需要更多的研究。

二、干細胞工程

干細胞既可以分化成其他類型細胞，也可以分裂產生更多相同類型的干細胞。目前可以促進肩袖腱骨愈合的干細胞主要有骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）、 脂肪源性干細胞（adipose derived stem cells,ADSCs）、 腱源干細胞（tendon derived stem cells,TDSCs）、臍帶血間充質干細胞（umbilical cord blood mesenchymal stem cells,UCB-MSCs）。

BMSCs 是一種多能干細胞，具有自我復制和分化的能力，在骨髓中含量豐富。Nourissat 等［16］在術中把BMSCs注射到大鼠腱骨止點處，在術后45 d 發現與無細胞注射的對照組相比，只有試驗組腱骨止點處出現了整齊排列的軟骨細胞，形成了類似于正常腱骨界面的典型四層結構。Hernigou 等［17］在關節鏡檢查時給45 例患者注射了BMSCs，并與45 例未注射BMSCs 的患者對照組進行對比，經超聲和核磁共振確定，BMSCs 注射提高了愈合率并改善了修復質量。10 年后，87%的BMSCs 治療組患者和44%對照組患者出現完整的肩袖。

ADSCs 是一種可以向多種間充質細胞增殖分化的干細胞。Chen 等［18］在試驗組術中把ADSCs 注射到大鼠肩袖腱骨止點處，在對照組術中注射等量生理鹽水，在術后發現試驗組纖維排列和肌腱組織得到改善，炎癥細胞數量顯著減少，生物力學強度得到明顯提高。Kosaka 等［19］在兔腱骨止點處分別注射ADSCs 和生理鹽水，較注射生理鹽水的對照組，試驗組兔腱骨區在術后12 周形成更多成熟細胞，生物力學強度更優。Jo 等［20-21］選取已隨訪6 個月的部分肩袖撕裂的患者進行不同劑量的ADSCs 注射治療，在注射后1、3、6、12 和24 個月對患者進行隨訪，隨訪發現患者病情得到不同程度改善。他們認為，在不進行手術的情況下，通過注射ADSCs 治療部分肩袖撕裂是有希望的。

TDSCs 來源于肌腱組織，可以分化為各種細胞。Cheng 等［22］把TDSCs 注射到大鼠肩袖腱骨止點處，術后4 周發現相較于對照組大鼠肩袖腱骨止點處生物力學性能得到改善。Lui 等［23］在大鼠試驗中發現，在術后第2 周和第 6 周TDSCs 組的骨密度和骨體積分數均明顯高于對照組，生物力學強度更優。

UCB-MSCs 可以通過微創方法獲得。在一項研究中，Park 等［24］選取10 例肩袖全層撕裂患者，在超聲引導下注射UCB-MSCs 進行治療，隨訪發現7 例患者肩關節功能得到明顯改善。

BMSCs、ADSCs、TDSCs 和UCB-MSCs 的來源不同，提取、加工以及應用的難度也不一樣。BMSCs 是干細胞主要來源，提取簡單且安全性高，但數量、分化潛力和最大壽命隨著年齡的增長而減少［25］。ADSCs 在標準組織培養條件下容易生長，并顯示出多譜系分化能力，但促進肩袖腱骨愈合效果有限［26］。目前，雖然利用TDSCs 促進肩袖腱骨愈合的相關研究很少， 但理論上，TDSCs 在促進腱骨愈合能力上相對于BMSCs 更具優勢，TDSCs 能保證腱骨止點處生成更多的肌腱與骨，且增殖能力更強［27-28］。在各種干細胞中，UCB-MSCs 具有最強大的治療潛力，因為其具有多種屬性，如能夠在損傷組織中定位、低免疫原性、多向分化［29］。干細胞治療肩袖損傷在未來需要更深入更廣泛的研究。

三、組織工程學材料

組織工程學材料不僅應該模仿肩袖止點處關鍵的微觀結構、成分和機械性能，而且還需能恢復正常的肩關節功能。目前促進肩袖腱骨愈合的組織工程學材料主要有天然聚合物、合成聚合物、骨傳導無機材料、混合生物材料。

天然聚合物主要有膠原蛋白和殼聚糖，它們包含特定的分子域，能夠在組織發育的不同階段支持和引導細胞［30］。膠原是結締組織細胞外基質的主要成分［31］。Van Kampen等［32］將ⅰ型膠原纖維支架縫合到成年綿羊岡下肌的表面，發現植入6 周后，支架通過誘導形成整合良好且致密、規則取向的肌腱樣組織。在植入26 周后，支架被完全吸收，僅在宿主肌腱上留下一層穩定的成熟組織，表明膠原蛋白有助于肩袖腱骨愈合。聚糖是一種生物可降解和生物相容的材料，能夠促進細胞增殖和遷移［33］。殼聚糖纖維支架已被用于促進兔肩袖再生。發現與未接受治療的對照組相比，肩袖的力學強度更優［34］。天然聚合物的生物活性可能導致強烈的免疫原性反應，臨床研究較少［35］。

合成聚合物可分為可降解和不可降解聚合物，以適應不同的組織再生目的。可降解聚合物主要包括聚乳酸（polylactic acid,PLA），聚乙醇酸（polyglycolide,PGA）,和聚乳酸-乙醇酸共聚物［poly（lactic-co-glycolic acid）, PLGA］。由聚乳酸制造的合成補片，植入到18 例患者肩袖撕裂處時表現良好，可用來修復巨大肩袖損傷［36］。接種有干細胞的聚乙醇酸補片已被用于促進腱骨愈合［37］。利用負載bFGF 的電紡纖維PLGA 膜促進腱骨愈合，與bFGF 對照組相比，bFGFPLGA 膜腱骨止點有更多的膠原組織生成，生物力學性能更強［38］。不可降解聚合物主要包括聚碳酸酯聚氨酯，聚四氟乙烯（poly tetra fluoroethylene,PTFE）。與傳統縫合錨修復相比，聚氨酯支架可以提供了更大的機械強度，有助于肩袖腱骨愈合［39］。在臨床應用中，發現PTFE 補片有助于修復巨大肩袖損傷。術后1 年，觀察到PTFE 補片和臨近骨組織之間緊密連接，患者肩關節功能得到有效改善［40］。合成聚合物由于成分與骨不同，在撕裂的肩袖中再生骨的能力有限。

骨傳導無機材料的主要種類是磷酸鈣生物材料。Tien等［41］用磷酸鈣（calcium phosphate,CaP）骨水泥填充腱骨止點。Mutsuzaki 等［42］在移植腱組織中填充CaP，組織學和力學檢查發現腱骨愈合加快。Kovacevic 等［43］在大鼠急性肩袖損傷模型中用CaP 基質和TGF-β 進行聯合治療，發現有助于肩袖腱骨愈合。在皇甫和趙對犬模型的研究中，發現一種磷酸三鈣（tribasic calcium phosphate,TCP）和羥基磷灰石（hydroxyapatite,HA）的混合物能使移植物更快地結合到隧道中，具有更高的生物學強度［44］。然而，骨傳導無機材料通常具有脆性、低機械可靠性以及缺乏彈性。

混合生物材料具有各種材料的優點，較其他組織工程學材料更加貼合肩袖的天然結構，因此治療效果更好。Wang 等［45］通過靜電紡絲制備雙層有機/無機復合的柔性纖維膜，模擬腱骨止點非礦化纖維軟骨和礦化纖維軟骨組成，用于腱骨愈合研究。組織結果顯示雙層有機/無機復合的柔性纖維膜促進腱骨止點過渡區的形成，改善膠原蛋白的組成與排列。在一項為期3 年的非隨機回顧性隨訪研究中，Ciampi 等［46］比較了對照組、膠原補片組和混合聚丙烯補片組對巨大肩袖撕裂修復的影響，混合聚丙烯補片組再撕裂率最低。Proctor 等［36］評估了18 例肩袖撕裂患者的肩關節功能，這些患者接受了可吸收聚左旋乳酸編織網治療。超聲和磁共振結果顯示，83%的患者在手術后12 個月肩關節功能基本恢復。Lenart 等［47］在16 例肩袖撕裂患者開放性手術中，使用了這種支架，在平均1.5 年的隨訪中，美國肩肘外科協會評分和Penn 肩部評分較術前顯著提高。

四、結語

目前促進肩袖腱骨愈合的方法很多，但大部分依然來源于動物試驗，距離臨床應用尚有一段距離，如何將研究的成果廣泛運用于臨床中，仍需進一步探索。同時，由于肩袖腱骨界面成分及結構的復雜性，將多種促進肩袖腱骨愈合的方法進行聯合應用必然會成為一種新的研究思路。隨著研究的深入與技術的革新，人們有望解決肩袖腱骨愈合這一難題。