N6-甲基腺苷修飾在心腦血管疾病中的研究進展

葉維貞，劉向榮

心腦血管疾病在全球的病死率長期位于前列。數(shù)據(jù)顯示，心腦血管疾病是中國非傳染性疾病死亡的首要原因[1]。N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）是RNA轉錄后一種重要的表觀遺傳學修飾。研究發(fā)現(xiàn)，m6A修飾與心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關[2]。因此，本文對m6A修飾及相關調(diào)控蛋白在心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展中的作用進行綜述。

1 m6A修飾概述

1.1 m6A修飾的特點及功能 迄今已發(fā)現(xiàn)170多種RNA表觀修飾，主要包括m6A、N1-甲基腺苷、5-甲基胞苷等，其中m6A是真核生物信使RNA（messenger RNA，mRNA）豐度最高的內(nèi)部修飾[3]。1974年，Desrosiers等[4]在Novikoff肝癌細胞mRNA的甲基化核苷中發(fā)現(xiàn)了m6A修飾。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，m6A不僅存在于酵母、植物、哺乳動物等真核生物中，還存在于病毒、細菌、支原體中[5]。m6A修飾的位置通常具有高度的序列保守性，更傾向在RRACH（R=A、G；H=A、C、U）基序上。對mRNA m6A修飾富集的位置進行分析，發(fā)現(xiàn)其在序列編碼區(qū)（coding sequence，CDS）和3’非翻譯區(qū)（3’ untranslated region，3’UTR）豐度較高，而且在兩者交界區(qū)域，終止密碼子附近有一個最高峰值，這種位置的分布特異性提示m6A修飾很可能具有特殊功能。

目前發(fā)現(xiàn)，若m6A修飾發(fā)生于5’非翻譯區(qū)，則能夠促進轉錄本5’帽端非依賴性的蛋白翻譯[6]。若m6A修飾僅發(fā)生于3’UTR，則能夠與YT521-B同源結構域家族蛋白（YT521-B homology domain family，YTHDF）1結合，進一步招募翻譯真核起始因子3（eukaryotic translation initiation factor 3，eIF3），促使5’帽端和3’poly尾端形成環(huán)狀結構，進而促進5’帽端依賴性的蛋白翻譯[6]。若m6A修飾發(fā)生于CDS或3’UTR，則能夠與YTHDF2結合，進一步縮短RNA 3’poly尾端，促進mRNA降解[6]。另外，發(fā)生于CDS或3’UTR的m6A修飾位點也能與胰島素樣生長因子2信使RNA結合蛋白（insulin-like growth factor 2 mRNA binding proteins，IGF2BPs）結合，招募RNA結合蛋白人抗原R或Matrin 3蛋白，提高mRNA穩(wěn)定性[6]。因此，m6A修飾調(diào)控mRNA的方式有多種，如調(diào)控mRNA前體的可變剪切、影響與微小RNA（microRNA，miRNA）結合效率、影響蛋白翻譯效率及mRNA穩(wěn)定性等[7]。

m6A不僅存在于mRNA，也存在于其他各種非編碼RNA上，包括長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）、環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）及miRNA等。與mRNA不同，m6A在lncRNA上更傾向于在整體轉錄本上平均分布，無特別的位置分布且功能上也存在差異，其功能包括降低lncRNA的穩(wěn)定性和調(diào)控lncRNA結合miRNA[8-9]。對于circRNA，m6A修飾可降低circRNA的穩(wěn)定性，促進circRNA出核及翻譯多肽、調(diào)控細胞固有免疫[10-11]。在miRNA中，m6A可促進miRNA前體的可變剪切，并可與miRNA聯(lián)合調(diào)控基因的表達[12]。

1.2 m6A修飾相關酶 m6A修飾是一個動態(tài)且可逆的過程[13]，主要由三種催化酶實現(xiàn)，分別為m6A甲基轉移酶、m6A去甲基化酶及m6A結合蛋白。

m6A甲基轉移酶也稱m6A編碼器，RNA可由甲基轉移酶復合體介導甲基化修飾。甲基轉移酶復合體由多種蛋白復合形成，包括甲基轉移酶3（methyltransferase-like 3，METTL3）、甲基轉移酶14（methyltransferase-like 14，METTL14）、Wilms腫瘤1-相關蛋白（Wilms’ tumor 1-associating protein，WTAP）、RNA結合蛋白15等。METTL3是最主要的m6A修飾蛋白，METTL14輔助其結合底物[14]。而WTAP定位于METTL3-METTL14異二聚體，可提高催化活性。RNA結合蛋白15可與富含U的序列結合，使該序列附近的RRACH基序更易發(fā)生m6A修飾[15]。

m6A去甲基化酶又稱“消碼器”，主要包括脂肪和肥胖相關蛋白（fat mass and obesity associated protein，F(xiàn)TO）和α-酮戊二酸酯依賴性雙加氧酶同系物5（α-ketoglutarate dependent dioxygenase alkB homolog 5，ALKBH5）。與甲基轉移酶的作用方式不同，去甲基化酶通常由一個蛋白即可發(fā)揮去除m6A修飾的作用。FTO是最早被發(fā)現(xiàn)的m6A去甲基化酶，可以在細胞核和細胞質(zhì)中去除m6A修飾，主要與肥胖和代謝有關；ALKBH5主要在細胞核中發(fā)揮作用[16]。

m6A結合蛋白又稱“讀碼器”，目前發(fā)現(xiàn)，m6A結合蛋白通過直接或間接結合RNA發(fā)揮作用，且一個m6A RNA轉錄本如果結合不同的“讀碼器”，后續(xù)會產(chǎn)生不同的反應。直接結合RNA的“讀碼器”一般有一個專門識別m6A修飾的特定結構域，如YT521-B同源（YT521-B homology，YTH）結構域家族識別蛋白，其包括YTHDF1、YTHDF2及YTHDF3。當m6A RNA轉錄本與YTHDF2和YTHDF3結合時，會促進其降解；當m6A RNA轉錄本與YTHDF1和YTHDF3結合時，能夠促進蛋白翻譯[17]。此外，有些m6A結合蛋白不含特定識別結構域，只含有普通RNA結合域，如IGF2BPs和eIF3。當m6A結合蛋白與IGF2BPs結合后，將維持RNA轉錄本的穩(wěn)定性[18]；與eIF3結合后，可以促進翻譯的啟動[19]。

2 m6A修飾與心腦血管危險因素

m6A可直接或間接地參與心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展。研究表明，m6A與心腦血管疾病的危險因素及其發(fā)生發(fā)展過程中的病理變化有關，如高血壓、高血脂、糖尿病、超重和肥胖等[20]。

2.1 高血壓 高血壓是心腦血管疾病的主要危險因素之一。Mo等[21]研究了m6A相關的單核苷酸多態(tài)性（m6A-associated single nucleotide polymorphism，m6A-SNP）與血壓在大規(guī)模全基因組研究中的關聯(lián)，發(fā)現(xiàn)較多m6A-SNP均與血壓相關，而且在甲基化位點附近的m6ASNP會導致m6A甲基化位點的增加或減少，推測可能因為單核苷酸多態(tài)性影響了m6A甲基化或轉錄的錯義突變及變異，但還有待驗證。總之，m6A-SNP在血壓調(diào)節(jié)中可能發(fā)揮一定作用，但具體機制尚未明確。

2.2 2型糖尿病 2型糖尿病約占糖尿病的90%，研究表明m6A修飾與2型糖尿病密切相關[22-23]。研究發(fā)現(xiàn)，m6A水平升高可刺激大鼠脂肪細胞的葡萄糖氧化，降低葡萄糖濃度，提示適當水平的m6A才能維持適當?shù)钠咸烟菨舛萚22]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，由于2型糖尿病患者m6A去甲基化酶FTO的表達增加，導致m6A水平降低，從而進一步增加了患者心腦血管疾病風險[23]。此外，Yang等[24]研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者METTL3和METTL14水平升高。同時高糖刺激FTO表達增加，從而誘導叉頭轉錄因子、葡萄糖-6-磷酸酶及二酯酰甘油轉移酶2表達增加，這與2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展關系密切。故推測在2型糖尿病患者中，血糖升高可刺激FTO表達增加，導致m6A水平降低，從而使甲基轉移酶METTL3和METTL14繼發(fā)性表達增加。

2.3 高脂血癥 研究表明m6A修飾在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用[25-28]。肝臟YTH結構域包含蛋白2（YT521-B homology domain containing 2，YTHDC2）通過識別m6A位點，抑制肝臟脂肪基因mRNA的穩(wěn)定性，從而阻止其翻譯和表達[25]。抑制YTHDC2表達可導致小鼠肝臟中三酰甘油的積累。此外，當敲除m6A甲基轉移酶Mettl3時，可使過氧化物酶體增殖物激活受體α mRNA穩(wěn)定性增強，從而提高其表達水平，減少脂質(zhì)積累[26]。

另外，研究發(fā)現(xiàn)METTL3通過脂肪酸合酶mRNA的m6A甲基化抑制肝臟對胰島素的敏感性，從而促進脂肪酸合成[27]。研究發(fā)現(xiàn)已有大量脂質(zhì)相關的m6A-SNP，并表明m6A-SNP可能發(fā)揮調(diào)控脂質(zhì)代謝的作用[28]。

2.4 肥胖 研究表明，m6A修飾與肥胖的發(fā)生發(fā)展關系密切[25，29-32]。Wang等[29]發(fā)現(xiàn)m6A去甲基化酶FTO通過靶向自噬相關蛋白5和自噬相關蛋白7調(diào)節(jié)自噬體和脂肪的形成；敲除小鼠Fto，可減少白色脂肪生成，并在體內(nèi)抑制靶向自噬相關蛋白5和自噬相關蛋白7依賴的自噬。在高脂飲食造成的小鼠肥胖模型中，發(fā)現(xiàn)m6A水平升高，肝臟中METTL3蛋白水平增加，F(xiàn)TO表達下降，故推測METTL3上調(diào)和FTO下調(diào)可能是導致肥胖患者m6A水平升高的原因[25]。此外，F(xiàn)TO通過抑制豬肌內(nèi)前體脂肪細胞中的Wnt/β-catenin信號轉導通路促進前體脂肪細胞的分化，從而促進脂肪形成。因此，抑制FTO的表達可抑制前體脂肪細胞的增殖和分化，從而抑制脂肪形成[30]。FTO也可通過調(diào)節(jié)有絲分裂促進脂肪細胞的增殖[31]。研究發(fā)現(xiàn)m6A甲基化轉移酶復合體中WTAP、METTL3、METTL14通過促進有絲分裂擴增過程的細胞周期轉變而促進脂肪細胞的分化和增殖，也可促進脂肪形成[32]。該結果推測可能因為m6A甲基轉移酶復合體和FTO調(diào)控的基因不同。

3 m6A修飾在心血管疾病中的作用

研究表明，心肌缺血后m6A修飾增加[2，33]。由于METTL3表達明顯上調(diào)，m6A甲基化水平升高，從而抑制缺氧-復氧處理的心肌細胞自噬，促進細胞凋亡。敲除Mettl3可降低經(jīng)過缺氧-復氧處理的心肌細胞或缺血-再灌注處理的小鼠心臟組織中m6A水平，誘導自噬的增強，并減少細胞的凋亡[33]。

m6A去甲基化酶A L K BH 5過表達也可以減輕M ET TL3對缺氧-復氧處理的心肌細胞的影響，減少細胞凋亡。轉錄因子EB（transcription factor EB，TFEB）是METTL3作用的下游元件，METTL3可通過甲基化TFEB促進RNA結合蛋白異構核糖核蛋白D（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D，HNRNPD）與TFEB mRNA前體的結合，降低TFEB的表達水平，同時也可以相反地影響ALKBH5和METTL3，即與ALKBH5啟動子結合并激活其轉錄，減少細胞凋亡。還可通過下調(diào)mRNA的穩(wěn)定性抑制METTL3，從而增強心肌細胞自噬，抑制細胞凋亡[33]。

4 m6A修飾在腦血管疾病中的作用

研究表明，在腦血管疾病中m6A甲基化水平升高[34]。與未缺血組相比，小鼠大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）1 h再灌注后3 h、6 h，F(xiàn)TO mRNA水平均降低；再灌注后12 h，F(xiàn)TO mRNA及其蛋白水平均降低，總去甲基化酶活性降低，使雄性小鼠總體m6A水平升高；再灌注后24 h，雌性小鼠總體m6A水平也升高，而且m6A結合蛋白YTHDF1、YTHDF3 mRNA表達水平升高[34]。整體過程中m6A甲基轉移酶表達并無明顯改變，但總去甲基化酶活性卻降低[34]。其中神經(jīng)元中FTO的mRNA及蛋白表達均下調(diào)，ALKBH5表達未發(fā)生改變，可推測腦缺血后由于FTO下調(diào)，使m6A去甲基化減少，造成m6A水平升高。由于FTO是一種氧依賴性酶，故腦缺血后細胞缺血缺氧使FTO表達及活性下降，m6A水平升高，可能是引起繼發(fā)性腦損傷的原因之一[35-36]。

此外，Xu等[37]研究還發(fā)現(xiàn)MCAO發(fā)生后ALKBH5蛋白水平也顯著增加，但因總m6A甲基化水平升高，可推測ALKBH5蛋白水平的增加是繼發(fā)性改變。研究發(fā)現(xiàn)，在氧葡萄糖剝奪/復氧治療后，敲除Alkbh5可加重缺氧造成的腦損傷，而FTO過表達可減輕氧葡萄糖剝奪/復氧引起的損傷[37]。進一步研究發(fā)現(xiàn)這是由于敲除Alkbh5，使凋亡相關蛋白B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl2）基因轉錄本m6A甲基化提高，Bcl2 mRNA降解，降低了Bcl2的表達，從而促進細胞凋亡。而FTO的過表達增加了Bcl2 mRNA及蛋白水平，并減輕了缺氧引起的細胞凋亡。

細胞焦亡是一種細胞程序性死亡方式，表現(xiàn)為細胞不斷脹大直至細胞膜破裂，導致細胞內(nèi)容物釋放，進而激活強烈的炎癥反應[38]。腦缺血/再灌注損傷常常會導致神經(jīng)元的不可逆損傷，常表現(xiàn)為細胞焦亡。研究表明低溫治療可以減輕缺血再灌注造成的細胞焦亡[39]。Diao等[39]發(fā)現(xiàn)低溫可以通過抑制抑癌基因磷酸酶與張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homologous protein，PTEN）的m6A甲基化，從而激活磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B信號轉導通路磷酸化，保護神經(jīng)元免受缺血缺氧引起的細胞焦亡。在缺氧/復氧的神經(jīng)元中，細胞活性下降，總RNA和PTEN mRNA的甲基化及表達水平升高，而低溫治療可保留細胞活力，使PTEN mRNA甲基化及表達水平降低，從而激活磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B信號轉導通路，抑制細胞焦亡[39]。研究發(fā)現(xiàn)MicroRNA-421-3p作用于m6A讀碼蛋白YTHDF1，使其抑制炎癥信號通路核因子κB中p65 mRNA翻譯，從而抑制腦缺血/再灌注損傷中的炎癥反應[40]。

目前，m6A的動態(tài)調(diào)控與心腦血管疾病的關系已經(jīng)成為心腦血管領域的研究熱點。m6A調(diào)控心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展機制大多從調(diào)控甲基轉移酶與去甲基化酶的平衡方面推測獲得，但具體機制尚未明確。此外，由于當前技術的限制，對單獨mRNA m6A位點的改變?nèi)杂幸欢y度。綜上所述，對m6A動態(tài)且可逆的進行調(diào)控，從而影響心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展，可為心腦血管疾病的預防和治療提供新的靶點和思路。

【點睛】本文綜述了m6A修飾及相關調(diào)控蛋白在心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展中的作用，為心腦血管疾病的預防和治療提供新的思路。