細胞間隙連接蛋白43在骨質疏松領域研究進展

李昊天,邱濤,陳超綜述 王春慶審校

骨質疏松癥主要的臨床癥狀有軀體疼痛、駝背、身高短縮、脆性骨折等，尤其是股骨轉子間骨折、股骨頸骨折等。它是使老年人生活質量降低的重大慢性疾病之一，骨折尤其是髖部骨折后1年內病死率較高。我國已進入人口老齡化社會，骨質疏松癥發病人數每年增多，骨質疏松骨折發病人數也逐年升高，給家庭、國家帶來了沉重的負擔[1-5]。正常的骨重建是由成骨細胞群為主的骨形成與以破骨細胞群為主的骨吸收保持動態平衡實現的。目前對骨質疏松的基本病理認識是成骨和破骨系統失衡，破骨增加，成骨不足導致骨吸收，骨小梁破壞，脆性增加，骨折風險增加。骨骼發育和骨重建需要多種類型的細胞協調，包括成骨細胞、破骨細胞等。實際上，細胞內外的自分泌和旁分泌信號對骨骼發育和骨重建都是至關重要的。一種協調細胞功能的有效方法就是通過間隙連接進行細胞間信號傳導[6-7]。

1 細胞間隙鏈接

細胞間隙連接(GJIC)維持細胞之間的代謝連續性，并介導小分子的快速有效傳輸，包括相互連接細胞之間的第二信使。間隙連接通道是由并列存在于相鄰細胞上的兩個半通道并排形成的跨細胞通道組成的，在間隙連接處形成間隙連接板。間隙連接通道是一類膜通道，由跨膜通道形成的整合膜蛋白組成，這些蛋白稱為連接蛋白，內毒素或泛新蛋白，它們介導幾乎所有動物組織中直接的細胞間或細胞間的細胞外通訊。這些通道的活性受到嚴格調節，特別是通過分子內修飾(如蛋白質的磷酸化)及通過形成多蛋白復合物進行調節。支架蛋白將信號酶、底物和潛在的效應子(如通道)連接到可以錨定于細胞骨架的多蛋白信號復合物中。蛋白質間相互作用在通道定位和活性中起著至關重要的作用，并且除了在通道間形成功能外，間隙連接蛋白似乎還參與了不同的細胞功能(例如轉錄和細胞骨架調節)[8-9]。

細胞間隙連接允許相鄰細胞之間離子、核苷酸、小分子和第二信使的直接交換。此外，間隙連接通道并不是孤立地發揮作用，而是聚集成可以包含數千個通道的間隙連接板，其直徑范圍從<100 nm到幾微米。因此，GJIC可以為一個動態的、互連的單元網絡提供途徑。除了經典的GJIC外，在細胞膜上還存在間隙連接半通道，它們起著直接連接胞漿和細胞外環境的作用[10-11]。有研究證實，骨和骨細胞中觀察到3種細胞間隙連接蛋白(Connexin，Cx)的表達，分別為Cx45、Cx26、Cx43，其中Cx43表達最明顯[12]。在骨中GJIC允許不同細胞類型之間的細胞—細胞通信，包括成骨細胞—骨細胞、骨細胞—骨細胞等。就成骨細胞而言，成骨細胞體外分化需要間隙連接通訊，而缺乏Cx43小鼠原始顱骨成骨細胞合成礦化細胞外基質減少，表明Cx43在調控成骨細胞分化中起到作用。

2 細胞間隙連接蛋白43在骨重建中的作用

2.1 細胞間隙連接蛋白43 細胞間隙連接蛋白43(Cx43)直接調控細胞間的連接通訊,進行信息和能量的傳遞,進而調控細胞的新陳代謝和增殖分化等一系列生理過程,在脊椎動物早期的心血管發育/神經系統傳導、骨骼形成和礦化中發揮重要作用,同時與心血管系統、泌尿生殖系統、神經系統等多種系統疾病的發生發展密切相關[13-14]。Cx43在骨功能和發育中起重要作用，在成骨細胞或骨細胞中靶向缺失Cx43可導致骨細胞凋亡增加、破骨細胞募集和生物力學性能降低。Cx43同時形成間隙連接通道和半通道，分別介導相鄰細胞之間或細胞與細胞外環境之間的通訊。Cx43形成間隙連接、半通道分別介導相鄰細胞間以及細胞和細胞外環境的通訊[15]。成骨細胞或骨細胞中Cx43的缺失可造成骨折延遲愈合或不愈合。為研究在骨細胞中，兩個通道分別在骨重建中起到的作用，有研究分別建立了兩個由10kb-DMP1啟動子驅動的Cx43顯性陰性突變體的轉基因小鼠模型：R76W(間隙連接被阻斷，而半通道被促進)和Δ130-136(間隙連接和半通道都被阻斷)。實驗結果顯示，R76W小鼠(促進半通道)顯示新骨顯著增加，而在Δ130-136小鼠(間隙連接損傷)中觀察到破骨細胞生成和骨折延遲愈合。但在R76W小鼠實驗組并沒有觀察到促進半通道可使骨折延遲愈合恢復。研究結果證實，間隙連接和半通道在骨修復中起著相似的協同作用[16]。

2.2 Cx43與成骨細胞分化及骨形成 最近對老年骨質疏松的研究有了新的進展，Genetos等[17]用PTH分別刺激3組大鼠(分別為幼年、成年、老年)成骨細胞的Cx43進行功能對比，結果提示在幼年組大鼠成骨細胞中Cx43的mRNA和蛋白呈明顯過表達，但在成年和老年組大鼠中Cx43的mRNA和蛋白未發生明顯改變。根據結果推斷，在成骨細胞分化過程中及骨形成過程中，Cx43起著重要作用，由此可推測，Cx43與老年骨質疏松的發生發展有著不可分離的關系。在骨髓中，對于各細胞的分化，Cx43也起到了重要的調控作用。Cx43在骨穩態中起到重要作用，并且Cx43基因(GJA1)突變與眼牙指畸形(ODDD)有關，后者是一種以骨骼異常為特征的人類疾病，成骨細胞中的Cx43是骨骼重塑周期的關鍵調節劑，它的缺失會引起結構變化，提醒骨骼老化或廢棄。

有研究報道，在成骨細胞及骨細胞中缺乏Cx43或僅在骨細胞中缺乏Cx43的小鼠[Cx43(ΔOt)小鼠]中表現出骨細胞凋亡、皮質內吸收和骨膜骨形成增加，導致股骨中段骨髓腔和總組織面積增加。對凋亡骨細胞、骨細胞蛋白表達、再吸收和形成的解剖學研究表明，Cx43通過調節位于皮質特定區域的骨細胞中骨保護素和硬化素水平來控制破骨細胞和成骨細胞的活動。在Cx43(ΔOt)小鼠的皮質骨中，空骨陷窩和缺少骨保護素的活骨細胞分布在整個皮質骨中，凋亡的骨細胞首先發現位于含有破骨細胞的區域內，提示破骨細胞的募集需要來自死亡骨細胞的主動信號[18]。Cx43在體外成骨細胞分化中起重要作用。成骨細胞及骨細胞中靶向缺少Cx43的小鼠顯示骨密度和皮質厚度降低。這些研究詮釋了Cx43在骨折愈合過程中的新作用，這表明Cx43的缺失可減少骨形成和骨吸收。

2.3 Cx43與骨代謝信號傳導 Cx43介導的細胞間隙連接在調節骨細胞功能、骨細胞存活和凋亡、信號轉導、機械傳導等方面發揮著重要的作用。Cx43 不僅可以作為細胞間隙連接蛋白來發揮作用(Cx43 高表達可激活 MAPK/ErK及PKCδ，促進成骨細胞分化相關基因如 Runx2、Sp7的轉錄)，而且還可作為半通道從而起到效用(Cx43 半通道與其他蛋白如磷酸酶、整合素等相互作用，使其開放，釋放 PGE2，從而活化Wnt/β-catenin信號轉導通路，促進β-catenin 的累積，激活成骨分化，增加骨的礦化)[19-21]。Cx43在成骨細胞分化及骨礦化中起關鍵作用，但是通過Cx43傳導的第二信使及這些第二信使的目標，以及其如何調節成骨細胞功能的機制尚不十分清楚。

2.4 Cx43與miRNA靶向調節機制 miRNA通過相關信號通路，調控靶基因的表達，在成骨細胞、破骨細胞和軟骨細胞的增殖分化過程中發揮了重要的調控作用，最終影響骨的代謝，有希望成為骨質疏松癥臨床治療的下一步治療靶點[22-24]。最近研究發現，骨質疏松患者外周血液中多種miRNA表達水平較正常人體具有顯著差異。研究發現[25-27]，miR-21、miR-23a、miR-24、miR-25、miR-100和miR-125b這6種miRNA在骨質疏松患者的外周血清及骨組織表達顯著增高，特別是miR-122-5p、miR-125b-5p和miR-21-5p在骨質疏松骨折患者的外周血清中表達顯著增高。杜莉等[28]在探討miR-125b對人牙周膜干細胞(PDLSCs)成骨分化的影響實驗中，結果表明miR-125b能夠靶向降低Cx43基因水平。而在Cx43過表達的PDLSCs中,miR-125b模擬物對PDLSCs成骨分化的作用被反轉。得出miR-125b通過靶向下調Cx43而抑制PDLSCs的成骨分化的結論。

前期研究發現，miR-125b在骨質疏松患者外周血及骨組織中表達顯著增高[29]。通過BMSC細胞實驗驗證及雙熒光素酶報告實驗驗證miR-125b靶向調節Cx43抑制成骨細胞的增殖與分化，從而進一步影響骨的沉積，與骨質疏松的發生密切相關。研究miR-125b調控CX-43的分子機制，為骨質疏松發病機制研究提供理論依據。并將進一步研究miR-125b、外泌體與Cx43調節骨穩態的分子機制，為臨床治療骨質疏松提供新的潛在靶點[30]。

2.5 Cx43與機械應力傳導 Cx43在骨骼對機械負荷的反應中起著不可或缺的作用。最近研究中[31]，證明了通過后肢懸吊(HLS)進行機械卸載后，成骨細胞/成骨細胞特異性缺乏Cx43(cKO)的小鼠中小梁骨質量和皮質骨形成速率得以保留。最近的研究建立了Cx43的成骨細胞功能調節劑和骨橋反應機械刺激劑。實驗證明，靶向抑制Cx43基因條件下，長骨橫斷面的發育比正常情況大。因此，Cx43在穩態條件下可能通過抑制皮質內骨吸收和骨膜骨形成來響應機械負荷調節皮質骨模型[32-33]。Cx43可能代表了一種新的藥理學靶點，可通過調節機械反應性改善皮質骨強度。

骨骼適應機械負荷，促進骨形成和重建。長期以來，骨細胞被認為是靜止的旁觀者細胞。然而，最近的研究表明，骨細胞在調節骨的各種功能中起著關鍵作用。骨細胞是骨機械負荷的主要傳感器。它們產生調節骨形成和吸收的可溶性因子。骨細胞在骨基質水平上調節局部的礦物質沉積和化學反應，它們也作為內分泌細胞發揮作用，產生靶向腎臟等遠端器官來調節磷酸鹽的轉運[34]。機械負荷影響骨骼結構完整性和骨重建。對骨細胞施加流體剪切應力等機械刺激可激活由多個信號分子介導的級聯機械傳導。連接蛋白形成的半通道是一種候選的機械傳感器。雖然大多數骨細胞參與機械感覺，但骨細胞是主要的機械感覺細胞。骨細胞胞體和突起被充滿液體的空間包圍，形成一個廣泛的空腔小管網絡。間質流體的流動是將機械刺激傳遞給骨細胞的一個主要的應力相關因素。骨細胞的長樹突形成一個間隙連接通道網絡，不僅連接相鄰的骨細胞，而且連接骨表面的細胞，如成骨細胞和破骨細胞。機械敏感性骨細胞也形成半通道，介導細胞內外微環境之間的溝通。Cx43半通道是釋放前列腺素的入口，而前列腺素是介導機械負荷對骨形成和重塑生物反應的關鍵因子。有研究觀察到流體流動剪切應力(FFSS)會打開半通道；但是，持續的FFSS會導致半通道關閉，因為持續打開半通道對細胞活性和骨重建不利[35]。骨細胞被認為是骨重建的中心，富含骨細胞的連接蛋白通道可能是影響骨功能的主要因素。

2.6 Cx43與抗骨質疏松藥物 在過去幾年中，不少實驗研究工作已經證明了Cx43在骨細胞對各種刺激反應中的作用。這些半通道在藥物和機械刺激下開放。比如，抗骨質疏松藥物雙膦酸鹽對成骨細胞和骨細胞活性的保護依賴于Cx43在體內外的表達，并通過未連接的半通道介導；Cx43半通道也是骨細胞釋放前列腺素、ATP及體外機械刺激誘導細胞存活所必需的；此外，它們是甲狀旁腺激素抗成骨細胞凋亡作用所必需的[36]?？构琴|疏松藥物二膦酸鹽對成骨細胞和骨細胞活性的保護依賴于Cx43在體內外的表達。這種效應不需要細胞間的通訊，而是由非對抗性的半通道介導的。體外機械刺激誘導骨細胞釋放前列腺素和ATP也需要Cx43半通道。最近的證據顯示，Cx43介導的甲狀旁腺激素表達也促進更多的甲狀旁腺激素表達[37]。越來越多的研究證據表明，Cx43是細胞內機制的關鍵組成部分，負責在骨骼中對藥物、激素和機械刺激進行信號轉導。

基于大量研究，連接蛋白通道可能成為治療骨質疏松癥和骨丟失的一個潛在的新靶點。

3 小結及展望

盡管Cx43研究取得了重大進展，但仍有許多工作要做。Cx43傳導的骨分解代謝信號的性質、與生物學相關的第二信使仍需要確定。這些研究對于理解Cx43最終如何影響骨骼質量至關重要。從而能夠調節依賴Cx43的過程，增加成骨細胞分化及骨量積累，達到預防或治療骨代謝疾病如骨質疏松癥的目的。

了解Cx43是通過什么途徑來調節骨組織重塑的，這個機制對骨質疏松等治療存在指導意義。改變細胞間隙通訊信息或靶向調節間隙連接的信號機制可用于影響骨骼的穩態，從而驅動成骨分化或抑制骨吸收。近幾年，研究發現miRNA調節在骨重建中起到不可忽視的作用，而且不少研究證實了miRNA與Cx43之間存在著尚不清楚的分子調節機制。了解這部分調節機制可為骨代謝疾病發病機制研究提供新的思路。