細(xì)胞間隙連接蛋白43在骨質(zhì)疏松領(lǐng)域研究進(jìn)展

李昊天,邱濤,陳超綜述 王春慶審校

骨質(zhì)疏松癥主要的臨床癥狀有軀體疼痛、駝背、身高短縮、脆性骨折等，尤其是股骨轉(zhuǎn)子間骨折、股骨頸骨折等。它是使老年人生活質(zhì)量降低的重大慢性疾病之一，骨折尤其是髖部骨折后1年內(nèi)病死率較高。我國(guó)已進(jìn)入人口老齡化社會(huì)，骨質(zhì)疏松癥發(fā)病人數(shù)每年增多，骨質(zhì)疏松骨折發(fā)病人數(shù)也逐年升高，給家庭、國(guó)家?guī)?lái)了沉重的負(fù)擔(dān)[1-5]。正常的骨重建是由成骨細(xì)胞群為主的骨形成與以破骨細(xì)胞群為主的骨吸收保持動(dòng)態(tài)平衡實(shí)現(xiàn)的。目前對(duì)骨質(zhì)疏松的基本病理認(rèn)識(shí)是成骨和破骨系統(tǒng)失衡，破骨增加，成骨不足導(dǎo)致骨吸收，骨小梁破壞，脆性增加，骨折風(fēng)險(xiǎn)增加。骨骼發(fā)育和骨重建需要多種類型的細(xì)胞協(xié)調(diào)，包括成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞等。實(shí)際上，細(xì)胞內(nèi)外的自分泌和旁分泌信號(hào)對(duì)骨骼發(fā)育和骨重建都是至關(guān)重要的。一種協(xié)調(diào)細(xì)胞功能的有效方法就是通過(guò)間隙連接進(jìn)行細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)[6-7]。

1 細(xì)胞間隙鏈接

細(xì)胞間隙連接(GJIC)維持細(xì)胞之間的代謝連續(xù)性，并介導(dǎo)小分子的快速有效傳輸，包括相互連接細(xì)胞之間的第二信使。間隙連接通道是由并列存在于相鄰細(xì)胞上的兩個(gè)半通道并排形成的跨細(xì)胞通道組成的，在間隙連接處形成間隙連接板。間隙連接通道是一類膜通道，由跨膜通道形成的整合膜蛋白組成，這些蛋白稱為連接蛋白，內(nèi)毒素或泛新蛋白，它們介導(dǎo)幾乎所有動(dòng)物組織中直接的細(xì)胞間或細(xì)胞間的細(xì)胞外通訊。這些通道的活性受到嚴(yán)格調(diào)節(jié)，特別是通過(guò)分子內(nèi)修飾(如蛋白質(zhì)的磷酸化)及通過(guò)形成多蛋白復(fù)合物進(jìn)行調(diào)節(jié)。支架蛋白將信號(hào)酶、底物和潛在的效應(yīng)子(如通道)連接到可以錨定于細(xì)胞骨架的多蛋白信號(hào)復(fù)合物中。蛋白質(zhì)間相互作用在通道定位和活性中起著至關(guān)重要的作用，并且除了在通道間形成功能外，間隙連接蛋白似乎還參與了不同的細(xì)胞功能(例如轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞骨架調(diào)節(jié))[8-9]。

細(xì)胞間隙連接允許相鄰細(xì)胞之間離子、核苷酸、小分子和第二信使的直接交換。此外，間隙連接通道并不是孤立地發(fā)揮作用，而是聚集成可以包含數(shù)千個(gè)通道的間隙連接板，其直徑范圍從<100 nm到幾微米。因此，GJIC可以為一個(gè)動(dòng)態(tài)的、互連的單元網(wǎng)絡(luò)提供途徑。除了經(jīng)典的GJIC外，在細(xì)胞膜上還存在間隙連接半通道，它們起著直接連接胞漿和細(xì)胞外環(huán)境的作用[10-11]。有研究證實(shí)，骨和骨細(xì)胞中觀察到3種細(xì)胞間隙連接蛋白(Connexin，Cx)的表達(dá)，分別為Cx45、Cx26、Cx43，其中Cx43表達(dá)最明顯[12]。在骨中GJIC允許不同細(xì)胞類型之間的細(xì)胞—細(xì)胞通信，包括成骨細(xì)胞—骨細(xì)胞、骨細(xì)胞—骨細(xì)胞等。就成骨細(xì)胞而言，成骨細(xì)胞體外分化需要間隙連接通訊，而缺乏Cx43小鼠原始顱骨成骨細(xì)胞合成礦化細(xì)胞外基質(zhì)減少，表明Cx43在調(diào)控成骨細(xì)胞分化中起到作用。

2 細(xì)胞間隙連接蛋白43在骨重建中的作用

2.1 細(xì)胞間隙連接蛋白43 細(xì)胞間隙連接蛋白43(Cx43)直接調(diào)控細(xì)胞間的連接通訊,進(jìn)行信息和能量的傳遞,進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的新陳代謝和增殖分化等一系列生理過(guò)程,在脊椎動(dòng)物早期的心血管發(fā)育/神經(jīng)系統(tǒng)傳導(dǎo)、骨骼形成和礦化中發(fā)揮重要作用,同時(shí)與心血管系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等多種系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[13-14]。Cx43在骨功能和發(fā)育中起重要作用，在成骨細(xì)胞或骨細(xì)胞中靶向缺失Cx43可導(dǎo)致骨細(xì)胞凋亡增加、破骨細(xì)胞募集和生物力學(xué)性能降低。Cx43同時(shí)形成間隙連接通道和半通道，分別介導(dǎo)相鄰細(xì)胞之間或細(xì)胞與細(xì)胞外環(huán)境之間的通訊。Cx43形成間隙連接、半通道分別介導(dǎo)相鄰細(xì)胞間以及細(xì)胞和細(xì)胞外環(huán)境的通訊[15]。成骨細(xì)胞或骨細(xì)胞中Cx43的缺失可造成骨折延遲愈合或不愈合。為研究在骨細(xì)胞中，兩個(gè)通道分別在骨重建中起到的作用，有研究分別建立了兩個(gè)由10kb-DMP1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Cx43顯性陰性突變體的轉(zhuǎn)基因小鼠模型：R76W(間隙連接被阻斷，而半通道被促進(jìn))和Δ130-136(間隙連接和半通道都被阻斷)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，R76W小鼠(促進(jìn)半通道)顯示新骨顯著增加，而在Δ130-136小鼠(間隙連接損傷)中觀察到破骨細(xì)胞生成和骨折延遲愈合。但在R76W小鼠實(shí)驗(yàn)組并沒(méi)有觀察到促進(jìn)半通道可使骨折延遲愈合恢復(fù)。研究結(jié)果證實(shí)，間隙連接和半通道在骨修復(fù)中起著相似的協(xié)同作用[16]。

2.2 Cx43與成骨細(xì)胞分化及骨形成 最近對(duì)老年骨質(zhì)疏松的研究有了新的進(jìn)展，Genetos等[17]用PTH分別刺激3組大鼠(分別為幼年、成年、老年)成骨細(xì)胞的Cx43進(jìn)行功能對(duì)比，結(jié)果提示在幼年組大鼠成骨細(xì)胞中Cx43的mRNA和蛋白呈明顯過(guò)表達(dá)，但在成年和老年組大鼠中Cx43的mRNA和蛋白未發(fā)生明顯改變。根據(jù)結(jié)果推斷，在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中及骨形成過(guò)程中，Cx43起著重要作用，由此可推測(cè)，Cx43與老年骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展有著不可分離的關(guān)系。在骨髓中，對(duì)于各細(xì)胞的分化，Cx43也起到了重要的調(diào)控作用。Cx43在骨穩(wěn)態(tài)中起到重要作用，并且Cx43基因(GJA1)突變與眼牙指畸形(ODDD)有關(guān)，后者是一種以骨骼異常為特征的人類疾病，成骨細(xì)胞中的Cx43是骨骼重塑周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，它的缺失會(huì)引起結(jié)構(gòu)變化，提醒骨骼老化或廢棄。

有研究報(bào)道，在成骨細(xì)胞及骨細(xì)胞中缺乏Cx43或僅在骨細(xì)胞中缺乏Cx43的小鼠[Cx43(ΔOt)小鼠]中表現(xiàn)出骨細(xì)胞凋亡、皮質(zhì)內(nèi)吸收和骨膜骨形成增加，導(dǎo)致股骨中段骨髓腔和總組織面積增加。對(duì)凋亡骨細(xì)胞、骨細(xì)胞蛋白表達(dá)、再吸收和形成的解剖學(xué)研究表明，Cx43通過(guò)調(diào)節(jié)位于皮質(zhì)特定區(qū)域的骨細(xì)胞中骨保護(hù)素和硬化素水平來(lái)控制破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的活動(dòng)。在Cx43(ΔOt)小鼠的皮質(zhì)骨中，空骨陷窩和缺少骨保護(hù)素的活骨細(xì)胞分布在整個(gè)皮質(zhì)骨中，凋亡的骨細(xì)胞首先發(fā)現(xiàn)位于含有破骨細(xì)胞的區(qū)域內(nèi)，提示破骨細(xì)胞的募集需要來(lái)自死亡骨細(xì)胞的主動(dòng)信號(hào)[18]。Cx43在體外成骨細(xì)胞分化中起重要作用。成骨細(xì)胞及骨細(xì)胞中靶向缺少Cx43的小鼠顯示骨密度和皮質(zhì)厚度降低。這些研究詮釋了Cx43在骨折愈合過(guò)程中的新作用，這表明Cx43的缺失可減少骨形成和骨吸收。

2.3 Cx43與骨代謝信號(hào)傳導(dǎo) Cx43介導(dǎo)的細(xì)胞間隙連接在調(diào)節(jié)骨細(xì)胞功能、骨細(xì)胞存活和凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、機(jī)械傳導(dǎo)等方面發(fā)揮著重要的作用。Cx43 不僅可以作為細(xì)胞間隙連接蛋白來(lái)發(fā)揮作用(Cx43 高表達(dá)可激活 MAPK/ErK及PKCδ，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因如 Runx2、Sp7的轉(zhuǎn)錄)，而且還可作為半通道從而起到效用(Cx43 半通道與其他蛋白如磷酸酶、整合素等相互作用，使其開(kāi)放，釋放 PGE2，從而活化Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)β-catenin 的累積，激活成骨分化，增加骨的礦化)[19-21]。Cx43在成骨細(xì)胞分化及骨礦化中起關(guān)鍵作用，但是通過(guò)Cx43傳導(dǎo)的第二信使及這些第二信使的目標(biāo)，以及其如何調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞功能的機(jī)制尚不十分清楚。

2.4 Cx43與miRNA靶向調(diào)節(jié)機(jī)制 miRNA通過(guò)相關(guān)信號(hào)通路，調(diào)控靶基因的表達(dá)，在成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的增殖分化過(guò)程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，最終影響骨的代謝，有希望成為骨質(zhì)疏松癥臨床治療的下一步治療靶點(diǎn)[22-24]。最近研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松患者外周血液中多種miRNA表達(dá)水平較正常人體具有顯著差異。研究發(fā)現(xiàn)[25-27]，miR-21、miR-23a、miR-24、miR-25、miR-100和miR-125b這6種miRNA在骨質(zhì)疏松患者的外周血清及骨組織表達(dá)顯著增高，特別是miR-122-5p、miR-125b-5p和miR-21-5p在骨質(zhì)疏松骨折患者的外周血清中表達(dá)顯著增高。杜莉等[28]在探討miR-125b對(duì)人牙周膜干細(xì)胞(PDLSCs)成骨分化的影響實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果表明miR-125b能夠靶向降低Cx43基因水平。而在Cx43過(guò)表達(dá)的PDLSCs中,miR-125b模擬物對(duì)PDLSCs成骨分化的作用被反轉(zhuǎn)。得出miR-125b通過(guò)靶向下調(diào)Cx43而抑制PDLSCs的成骨分化的結(jié)論。

前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b在骨質(zhì)疏松患者外周血及骨組織中表達(dá)顯著增高[29]。通過(guò)BMSC細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證及雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-125b靶向調(diào)節(jié)Cx43抑制成骨細(xì)胞的增殖與分化，從而進(jìn)一步影響骨的沉積，與骨質(zhì)疏松的發(fā)生密切相關(guān)。研究miR-125b調(diào)控CX-43的分子機(jī)制，為骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制研究提供理論依據(jù)。并將進(jìn)一步研究miR-125b、外泌體與Cx43調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)的分子機(jī)制，為臨床治療骨質(zhì)疏松提供新的潛在靶點(diǎn)[30]。

2.5 Cx43與機(jī)械應(yīng)力傳導(dǎo) Cx43在骨骼對(duì)機(jī)械負(fù)荷的反應(yīng)中起著不可或缺的作用。最近研究中[31]，證明了通過(guò)后肢懸吊(HLS)進(jìn)行機(jī)械卸載后，成骨細(xì)胞/成骨細(xì)胞特異性缺乏Cx43(cKO)的小鼠中小梁骨質(zhì)量和皮質(zhì)骨形成速率得以保留。最近的研究建立了Cx43的成骨細(xì)胞功能調(diào)節(jié)劑和骨橋反應(yīng)機(jī)械刺激劑。實(shí)驗(yàn)證明，靶向抑制Cx43基因條件下，長(zhǎng)骨橫斷面的發(fā)育比正常情況大。因此，Cx43在穩(wěn)態(tài)條件下可能通過(guò)抑制皮質(zhì)內(nèi)骨吸收和骨膜骨形成來(lái)響應(yīng)機(jī)械負(fù)荷調(diào)節(jié)皮質(zhì)骨模型[32-33]。Cx43可能代表了一種新的藥理學(xué)靶點(diǎn)，可通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)械反應(yīng)性改善皮質(zhì)骨強(qiáng)度。

骨骼適應(yīng)機(jī)械負(fù)荷，促進(jìn)骨形成和重建。長(zhǎng)期以來(lái)，骨細(xì)胞被認(rèn)為是靜止的旁觀者細(xì)胞。然而，最近的研究表明，骨細(xì)胞在調(diào)節(jié)骨的各種功能中起著關(guān)鍵作用。骨細(xì)胞是骨機(jī)械負(fù)荷的主要傳感器。它們產(chǎn)生調(diào)節(jié)骨形成和吸收的可溶性因子。骨細(xì)胞在骨基質(zhì)水平上調(diào)節(jié)局部的礦物質(zhì)沉積和化學(xué)反應(yīng)，它們也作為內(nèi)分泌細(xì)胞發(fā)揮作用，產(chǎn)生靶向腎臟等遠(yuǎn)端器官來(lái)調(diào)節(jié)磷酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)[34]。機(jī)械負(fù)荷影響骨骼結(jié)構(gòu)完整性和骨重建。對(duì)骨細(xì)胞施加流體剪切應(yīng)力等機(jī)械刺激可激活由多個(gè)信號(hào)分子介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)機(jī)械傳導(dǎo)。連接蛋白形成的半通道是一種候選的機(jī)械傳感器。雖然大多數(shù)骨細(xì)胞參與機(jī)械感覺(jué)，但骨細(xì)胞是主要的機(jī)械感覺(jué)細(xì)胞。骨細(xì)胞胞體和突起被充滿液體的空間包圍，形成一個(gè)廣泛的空腔小管網(wǎng)絡(luò)。間質(zhì)流體的流動(dòng)是將機(jī)械刺激傳遞給骨細(xì)胞的一個(gè)主要的應(yīng)力相關(guān)因素。骨細(xì)胞的長(zhǎng)樹(shù)突形成一個(gè)間隙連接通道網(wǎng)絡(luò)，不僅連接相鄰的骨細(xì)胞，而且連接骨表面的細(xì)胞，如成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞。機(jī)械敏感性骨細(xì)胞也形成半通道，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外微環(huán)境之間的溝通。Cx43半通道是釋放前列腺素的入口，而前列腺素是介導(dǎo)機(jī)械負(fù)荷對(duì)骨形成和重塑生物反應(yīng)的關(guān)鍵因子。有研究觀察到流體流動(dòng)剪切應(yīng)力(FFSS)會(huì)打開(kāi)半通道；但是，持續(xù)的FFSS會(huì)導(dǎo)致半通道關(guān)閉，因?yàn)槌掷m(xù)打開(kāi)半通道對(duì)細(xì)胞活性和骨重建不利[35]。骨細(xì)胞被認(rèn)為是骨重建的中心，富含骨細(xì)胞的連接蛋白通道可能是影響骨功能的主要因素。

2.6 Cx43與抗骨質(zhì)疏松藥物 在過(guò)去幾年中，不少實(shí)驗(yàn)研究工作已經(jīng)證明了Cx43在骨細(xì)胞對(duì)各種刺激反應(yīng)中的作用。這些半通道在藥物和機(jī)械刺激下開(kāi)放。比如，抗骨質(zhì)疏松藥物雙膦酸鹽對(duì)成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞活性的保護(hù)依賴于Cx43在體內(nèi)外的表達(dá)，并通過(guò)未連接的半通道介導(dǎo)；Cx43半通道也是骨細(xì)胞釋放前列腺素、ATP及體外機(jī)械刺激誘導(dǎo)細(xì)胞存活所必需的；此外，它們是甲狀旁腺激素抗成骨細(xì)胞凋亡作用所必需的[36]。抗骨質(zhì)疏松藥物二膦酸鹽對(duì)成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞活性的保護(hù)依賴于Cx43在體內(nèi)外的表達(dá)。這種效應(yīng)不需要細(xì)胞間的通訊，而是由非對(duì)抗性的半通道介導(dǎo)的。體外機(jī)械刺激誘導(dǎo)骨細(xì)胞釋放前列腺素和ATP也需要Cx43半通道。最近的證據(jù)顯示，Cx43介導(dǎo)的甲狀旁腺激素表達(dá)也促進(jìn)更多的甲狀旁腺激素表達(dá)[37]。越來(lái)越多的研究證據(jù)表明，Cx43是細(xì)胞內(nèi)機(jī)制的關(guān)鍵組成部分，負(fù)責(zé)在骨骼中對(duì)藥物、激素和機(jī)械刺激進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

基于大量研究，連接蛋白通道可能成為治療骨質(zhì)疏松癥和骨丟失的一個(gè)潛在的新靶點(diǎn)。

3 小結(jié)及展望

盡管Cx43研究取得了重大進(jìn)展，但仍有許多工作要做。Cx43傳導(dǎo)的骨分解代謝信號(hào)的性質(zhì)、與生物學(xué)相關(guān)的第二信使仍需要確定。這些研究對(duì)于理解Cx43最終如何影響骨骼質(zhì)量至關(guān)重要。從而能夠調(diào)節(jié)依賴Cx43的過(guò)程，增加成骨細(xì)胞分化及骨量積累，達(dá)到預(yù)防或治療骨代謝疾病如骨質(zhì)疏松癥的目的。

了解Cx43是通過(guò)什么途徑來(lái)調(diào)節(jié)骨組織重塑的，這個(gè)機(jī)制對(duì)骨質(zhì)疏松等治療存在指導(dǎo)意義。改變細(xì)胞間隙通訊信息或靶向調(diào)節(jié)間隙連接的信號(hào)機(jī)制可用于影響骨骼的穩(wěn)態(tài)，從而驅(qū)動(dòng)成骨分化或抑制骨吸收。近幾年，研究發(fā)現(xiàn)miRNA調(diào)節(jié)在骨重建中起到不可忽視的作用，而且不少研究證實(shí)了miRNA與Cx43之間存在著尚不清楚的分子調(diào)節(jié)機(jī)制。了解這部分調(diào)節(jié)機(jī)制可為骨代謝疾病發(fā)病機(jī)制研究提供新的思路。