自然殺傷細胞相關的肺癌微環境及免疫治療

李萌，李世敏，于悅，劉海洋，關麗娜，孔英君

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院呼吸內科，哈爾濱 150001)

腫瘤的發生不僅與癌細胞本身的特性相關，癌細胞及腫瘤免疫微環境與免疫系統之間的相互作用也起著重要作用。自然殺傷細胞(natural killer cell，NK細胞)是機體重要的免疫細胞，與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調節有關，能夠識別靶細胞、殺傷介質。NK細胞的靶細胞主要有某些腫瘤細胞、病毒感染細胞、自身組織細胞、寄生蟲等，可有效殺傷腫瘤細胞，對抑制腫瘤的發生、發展和擴散起到重要作用，是腫瘤細胞免疫治療和抗體免疫治療的基礎。研究表明，有NK細胞浸潤的患者腫瘤擴散比率明顯低于無NK細胞浸潤者[1]。

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，每年新確診的肺癌患者達160萬，肺癌也是癌癥患者死亡的首要病因[2]。手術治療和放化療是既往肺癌治療的常用方法，由于大部分患者確診肺癌時已處于疾病中晚期，無法手術治療，且放化療的副作用較大，隨著研究的逐漸深入，關于肺癌免疫治療的研究取得了重大突破。腫瘤微環境中NK細胞的數量及其功能與患者的總生存率、無進展生存率以及復發風險等相關[3]；明確肺癌微環境中NK細胞發揮抗腫瘤作用的機制及其影響因素，對于肺癌未來的治療研究方向有一定的指導作用。現就NK細胞相關肺癌微環境及免疫治療予以綜述。

1 NK細胞的功能

NK細胞指能夠殺死腫瘤細胞和病毒感染細胞的先天免疫細胞，具有調節其他免疫細胞和促進組織生長的作用[4]，其抗腫瘤作用已在包括肺癌在內的多種腫瘤中得到證實[5-6]。人類NK細胞通常被定義為CD3-CD56+細胞，根據CD56和CD16的表達水平將人類NK細胞分為兩種功能不同的亞群[7]。大多數人NK細胞表達高水平的CD16和低水平的CD56，稱為CD56[dim]NK細胞，CD56[dim]NK細胞表達大量的穿孔素和顆粒酶等細胞毒性分子，主要作用是溶解靶細胞，CD56[dim]NK細胞也通過CD16接合發揮抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)；在人類NK細胞中，CD56[bright]NK細胞亞群的數量較少，CD16缺乏或低水平表達，其主要功能是分泌細胞因子，如γ干擾素和腫瘤壞死因子-α[8]，通過免疫調節以及殺傷腫瘤細胞抑制腫瘤生長。

2 肺癌微環境中NK細胞發揮作用的機制

腫瘤微環境由非造血基質細胞、細胞外基質、淋巴細胞和骨髓細胞亞群等組成[9]。在正常的生理條件下，組織間的動態平衡可以防止腫瘤的發生與發展。在病理條件下，腫瘤及其微環境的相互作用可以促進腫瘤的發生、生長和轉移。腫瘤微環境中的免疫細胞是惡性腫瘤免疫治療的新靶點，腫瘤微環境在免疫細胞的形成、生長和轉移中發揮重要作用。

肺癌患病率、死亡率均較高，已成為全球性的公共健康問題。肺癌分為非小細胞肺癌和小細胞肺癌，其中非小細胞肺癌是最常見的肺癌類型。在肺癌的免疫微環境中，NK細胞在人類和小鼠肺癌中的定位相似,主要位于腫瘤病灶周圍的侵襲邊緣，很少與癌細胞直接接觸[10-11]，主要通過表達Fc受體、釋放細胞外囊泡等方式發揮抗腫瘤特性。

2.1NK細胞表達Fc受體 Fc受體指細胞膜表面能與Ig的Fc片段結合的部位，結合免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)G、IgA、IgE的Fc片段的受體分別稱為FcγR、FcαR和FcεR。在腫瘤微環境中，表達Fc受體的主要細胞群體包括NK細胞、髓樣細胞、單核細胞、巨噬細胞和中性粒細胞[12-13]。人類NK細胞表達的主要Fc受體為FcγRⅢa，主要結合人IgG1和IgG3的Fc段(Cγ2、Cγ3功能區)[14]。除直接殺死腫瘤細胞外，NK細胞還可通過結合癌細胞IgG的Fc部分介導ADCC，從而誘導激活信號并殺死靶細胞。

目前，臨床與Fc受體相關的肺癌免疫治療的主要為免疫檢查點抑制劑，免疫檢查點抑制劑攜帶一個Fc，該部分通過單獨的生物學效應激活NK細胞表面Fc受體的表達[8,15]。免疫檢查點抑制劑程序性細胞死亡受體1(programmed cell death 1，PD-1)/程序性細胞死亡配體1(programmed cell death-ligand 1，PD-L1)單抗用于治療非小細胞肺癌已經獲得美國食品藥品管理局批準[16]。其中，PD-L1抗體Avelumab攜帶IgG1 Fc部分[16-17]，Avelumab能通過Fc受體觸發NK細胞的活化能力，誘導細胞因子產生，并通過ADCC殺死腫瘤細胞[18]。

2.2NK細胞釋放細胞外囊泡 包括NK細胞在內的所有細胞均可在自身周圍釋放大小不等的囊泡，稱為細胞外囊泡。根據細胞外囊泡的大小和表面標記物的不同，將細胞外囊泡分為4種類型，包括外泌體、微泡、凋亡小體和大型脂質體。所有類型的細胞外囊泡均可攜帶大分子物質，包括蛋白質和核酸(編碼和非編碼DNA和RNA)[19]。然而，不同種類的囊泡具有不同的功能。NK細胞衍生的細胞外囊泡對癌細胞具有細胞毒性，隨著細胞外囊泡濃度的增加，細胞毒性作用隨之增強。同時，NK細胞衍生的細胞外囊泡對正常細胞沒有毒性[20]。最近,越來越多的證據表明，即使在高度免疫抑制的腫瘤微環境中，NK細胞釋放的細胞外囊泡仍具有能夠發揮抗腫瘤作用的蛋白質和微RNA(microRNA，miRNA/miR)[21]。miRNA是一類由內源基因編碼的長度約22個核苷酸的單鏈RNA分子，參與了動植物轉錄后基因表達的調控；miRNA的其他作用機制包括直接結合蛋白質、阻止基因轉錄調控以及結合受體觸發下游信號傳導。Fabbri[21]研究表明，miRNA參與了由NK細胞衍生的細胞外囊泡介導的腫瘤細胞殺傷過程。

3 基于NK細胞的肺癌免疫治療

在現有肺癌手術治療、放化療、分子靶向治療的基礎上，NK細胞相關的肺癌免疫治療取得了重大突破。在腫瘤微環境中，NK細胞的功能受多種因素調節，一方面，腫瘤細胞、髓樣抑制細胞、巨噬細胞、調節性T細胞和血小板以接觸依賴性方式或通過分泌可溶性因子(如前列腺素E2和腺苷)引起NK細胞功能障礙[6]；另一方面，葡萄糖受限制、腫瘤衍生代謝產物、缺氧以及來源于腫瘤相關巨噬細胞和腫瘤相關成纖維細胞的轉化生長因子-β等也可通過不同方式影響NK細胞的功能及活性[22-23]。

由于肺癌中晚期腫瘤微環境中的NK細胞出現功能失調，主要表現為細胞毒性減弱、反應性降低和活力受損，因此，Kras驅動小鼠肺癌實驗中的NK細胞對腫瘤的強烈抑制作用僅限于肺癌的早期階段[24]。在非小細胞肺癌腫瘤組織中，NK細胞具有數量減少、γ干擾素產生受損和促血管生成表型表達增加等特點。與健康個體的外周血NK細胞相比，小細胞肺癌患者外周血NK細胞表現出較弱的細胞毒性，并且出現NK p46和穿孔素表達的下調[25]。因此，增加NK細胞數量以及上調NK細胞功能是基于NK細胞的肺癌免疫治療的關鍵。

3.1離體擴增NK細胞過繼轉移療法 在實體瘤中，離體擴增NK細胞過繼轉移療法已經成為一種新的治療方法。與同種異體NK細胞療法相比，自體NK細胞療法更安全，因為同種異體NK細胞會引起相對較多的不良反應，重復注射后有發生免疫排斥的可能。一項對12例難治性非小細胞肺癌患者的研究發現，接受與熱激蛋白70(heat-shock protein 70，HSP70)一起孵育的自體NK細胞輸注治療患者的疾病穩定期相對延長[26]。HSP70是一種腫瘤選擇性識別結構，可在包括肺癌在內的多種腫瘤細胞膜上選擇性表達[27]。將HSP70的14個氨基酸序列TKDNNLLGRFELSG(TKD)作為NK細胞的腫瘤選擇性識別結構，在體外和體內將小劑量白細胞介素(interleukin，IL)-2加入TKD孵育外周血淋巴細胞，可增強NK細胞對細胞膜HSP70陽性腫瘤的溶細胞活性。當HSP70激活的自體NK細胞治療聯合放療治療非小細胞肺癌時，患者總生存期延長，且診斷后33個月內未檢測到存活腫瘤細胞及腫瘤進展的跡象[28-29]。Ding等[30]發現，在高度侵襲性小細胞肺癌患者的維持治療中，基于NK細胞過繼轉移療法發揮了積極的功效，可延長患者的總生存期。綜上所述，將NK細胞過繼轉移療法與其他治療方法聯合應用，可能會在控制腫瘤生長和轉移方面取得積極的效果。

NK細胞過繼轉移療法的優勢主要體現在腫瘤早期的治療。在早期癌癥患者中，自體NK細胞可識別并選擇性殺死靜態癌癥干細胞，還可預防癌細胞的遷移和侵襲，有助于預防腫瘤的全身轉移[31-32]。隨著腫瘤進展，癌癥晚期出現免疫抑制性微環境，在嚴重的免疫抑制微環境中，過繼轉移的免疫細胞很容易脫離，并喪失其細胞毒活性以及滲入腫瘤組織的能力。

3.2聯合細胞因子療法 采用細胞因子刺激NK細胞治療癌癥的概念由來已久。早在1982年，Rosenberg等就已證明，IL-2刺激外周血淋巴細胞產生淋巴因子激活的殺傷細胞(主要是激活的NK細胞)，該細胞能夠裂解自體癌細胞[33-34]。IL-2還可以刺激NK細胞增殖和細胞毒性活性，且IL-2激活的NK細胞可以通過細胞膜HSP70特異性識別腫瘤細胞。有研究證明，用IL-2體外刺激自體NK細胞，然后過繼轉移同時結合皮下注射IL-2可以改善某些晚期癌癥患者的總生存率[35]。Zhang等[36]發現，在應用細胞因子刺激的NK細胞和T細胞聯合過繼轉移后，非小細胞肺癌患者的生存期延長。此外，在接受冷凍手術和離體細胞因子刺激的NK細胞過繼轉移治療后，晚期非小細胞肺癌患者免疫細胞功能和生活質量得到一定程度的改善[37]。基于IL-2的治療存在兩個主要障礙，劑量相關毒性(主要是血管滲漏)以及誘導調節性T細胞活化和擴增，導致NK細胞功能受到抑制，而IL-15在維持NK細胞功能的同時并不誘導調節性T細胞的擴增[38-39]，因此，在選擇刺激NK細胞的細胞因子時，IL-15可能是更好的選擇。

3.3針對Dickkopf相關蛋白2(dickkopf related protein 2，DKK2)抗體的NK細胞激活療法 DKK2是Wnt拮抗劑，而Wnt信號通路控制著廣泛的細胞分化過程，Wnt信號傳導的失調會引起包括腫瘤在內的許多疾病[40-41]。在非小細胞肺癌中，通常出現Kras基因和Apc基因突變。在Apc突變的肺癌中，DKK2表達顯著上調，DKK2增加在導致細胞分化失調的同時，還通過調節腫瘤免疫微環境促進肺癌進展。Shen等[42]使用抗DKK2抗體處理攜帶激活Kras突變和Apc缺失的小鼠肺癌模型發現，腫瘤明顯縮小，且腫瘤組織中NK細胞的活性增強，表明可以利用DKK2抗體通過調節腫瘤免疫微環境中NK細胞的活性抑制癌癥生長，可為具有Apc突變的非小細胞肺癌提供了一種新的治療方法，

3.4嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)轉導的NK細胞療法 NK細胞可介導抗腫瘤作用，但無誘發移植物抗宿主病的風險。CAR的基本結構包括胞外結構域、跨膜結構域和細胞內共刺激信號結構域[43-44]。為了提高NK細胞對耐藥癌細胞的細胞毒性，人們對CAR NK細胞進行了相應的研究。在CAR NK細胞中，屬于腫瘤壞死因子家族的CD137通常作為共刺激分子，借助逆轉錄病毒將腫瘤特異性靶抗原和共刺激分子轉導至NK細胞中，從而增強NK細胞的抗腫瘤活性[45]。與CAR T細胞相比，CAR NK細胞存在明顯的優勢，CAR NK細胞具有獨立的主要組織相容性復合體、較低的移植物抗宿主反應以及有限的壽命，從而避免了自殺基因插入CAR NK細胞結構中。臨床上已經在急性B淋巴細胞白血病的患者中測試了靶向CD19的CAR NK細胞[46]。目前，基于NK細胞治療肺癌的臨床試驗正在進行中。

4 小 結

免疫治療已經成為肺癌治療的新選擇。NK細胞作為免疫系統的重要組成部分，得到了越來越多的關注。NK細胞在直接殺死腫瘤細胞的基礎上，通過Fc受體表達以及釋放細胞外囊泡等方式發揮其獨特的抗腫瘤功效；但在腫瘤微環境中，仍有許多不可避免的因素通過減少NK細胞數量以及減弱NK細胞功能等方式促進肺癌的進展，因此，增加NK細胞數量以及上調NK細胞功能是基于NK細胞的肺癌免疫治療的關鍵。目前，在離體擴增NK細胞過繼轉移療法、針對DKK2抗體的NK細胞激活療法以及嵌合抗原受體轉導的NK細胞療法中，NK細胞療法已顯示出可增強惡性腫瘤患者臨床療效的巨大潛力，并可能在肺癌等多種實體瘤的治療中發揮作用，但仍有部分患者因缺乏腫瘤特異性NK細胞應答而無法從免疫治療中獲益。因此，NK細胞療法與其他療法聯合可使NK細胞重新活化，以獲得滿意的腫瘤治療效果。