天麻素與薯蕷皂苷元最佳配伍比例篩選及對HUVECs缺氧/復氧損傷的保護機制*

張明爍，葉田園，祝娜，黃秀蘭，李志勇

(1.中央民族大學藥學院，北京 100081；2 山東中醫藥大學實驗中心，濟南 250355)

土家族用天麻配伍延齡草防治“腦衰”病，本課題組前期實驗證明，天麻配伍延齡草可以增強雙側頸總動脈結扎所致的癡呆大鼠的學習記憶能力，促進神經遞質合成、保護腦細胞[1-2]。天麻素(gastrodin，Gas)是中藥天麻的主要活性成分，在抗氧化、抗炎、抗凋亡、改善缺血缺氧造成的腦損傷、保護神經元等方面具有良好的活性[3-4]。薯蕷皂苷元(diosgenin，Dio)是中藥延齡草的主要活性成分，具有保護血管、保護神經、抗炎、抗氧化應激等多種藥理作用[5]。有效組分配伍是近年來出現的配伍研究新模式，從復方中各層次(部位-組分-成分)藥效物質出發，具有作用明確、靶位清楚、對病證針對性更強等優點[6]。本研究通過基線等比增減設計確定Gas和Dio的配伍比例，并利用主成分分析方法在谷氨酸損傷的SH-SY5Y細胞模型和缺氧HUVECs上優選出最佳配伍比例，并在分子水平研究最佳配伍比例對缺氧HUVECs中HIF-1α、VEGF、iNOS、eNOS蛋白表達的影響，初步探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1受試細胞 SH-SY5Y細胞由中國中醫科學院醫學實驗中心惠贈。原代HUVECs購自中國醫學科學院基礎醫學研究所。

1.2藥物與試劑 天麻素標準品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110807-201407)、薯蕷皂苷元標準品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111539-200001)；谷氨酸(北京拜耳迪生物技術公司分裝)；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，批號：C1063)；內皮細胞培養基(endothelial cell medium，ECM)(Science cell，批號：1001)；活性氧檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，批號：S0033)；血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)(Angent，Ab46154)；低氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)(Abcam，批號：Ab2185)；誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)(Abcam，批號：Ab15323)；內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)(Immunoway，批號：YM3164)；山羊抗兔IgG(H+L)，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)(天德悅生物科技有限公司)；山羊抗小鼠IgG(H+L)，HRP(天德悅生物科技有限公司)。

1.3主要儀器 全自動流式細胞分析儀(美國Beckman Coulter，FC500)；倒置熒光顯微鏡(Olympus，IX-81)；三氣培養箱(Thermo，Hera cell 150)；低溫冷凍離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司，L535R-1)；多功能酶標儀(美國 Molecular Devices 公司，FlexStation3)；垂直板電泳槽(北京六一生物科技有限公司，DYCZ-24DN)；半干式轉移電泳槽(美國 Bio-Rad 公司，Trans-Blot SD)；電泳儀(美國Bio-Rad公司，PowerPac)；脫色搖床(美國Labnet公司，2030-RC-220)。

1.4方法

1.4.1基線等比增減法確定組分配比 依據天麻與延齡草的臨床配比(2：1)，結合天麻質控研究中的Gas含量(≥0.20%)[7]、延齡草質控研究中Dio含量(≥1.3 mg·g-1)[8]。臨床用藥中天麻為主藥，因此在配比設計時，除去一側終點單純為天麻素，其余配伍比例應保證天麻素的比例>1/2[9]。在此基礎上進行基線等比增減設計，得出7組配伍比例為Gas：Dio=10：0，9：1，8：2，7：3，6：4，5：5，0：10。

1.4.2不同組分配伍比例對谷氨酸損傷SH-SY5Y細胞的影響 ①細胞增殖毒性(cell counting kit-8，CCK-8)法檢測SH-SY5Y細胞存活率 取對數生長期的SH-SY5Y細胞，以每孔2×104個接種于96孔板，每孔加200 μL含10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的DMEM/F12的完全培養基于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)的培養箱中培養，培養12 h后，更換為無血清的DMEM/F12的培養基，每組6孔，正常對照組給予Locke’s buffer，模型對照組給予2 mmol·L-1谷氨酸(glutamate，Glu)，給藥組給予不同比例的Gas和Dio。藥物與細胞共培養12 h后，更換為含10% CCK-8的DMEM培養液，37 ℃孵育3 h，使用多功能微孔板檢測儀，于450 nm處測定吸光度(A值)。

②Annexin V /PI雙染法流式細胞術檢測SH-SY5Y細胞凋亡 取對數生長期的SH-SY5Y細胞，以每孔6×105個接種于6孔板，細胞分組及培養操作同“1.4.2 ①”項，于37 ℃細胞培養箱中培養12 h后，按Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒的說明書進行流式細胞儀檢測。

1.4.3不同組分配伍比例對缺氧HUVECs的影響 ①HUVECs的分離、培養及鑒定 參照文獻[10-11]的方法，對原代HUVECs進行體外分離、培養及鑒定，并加以改進。以10 mL ECM培養液重懸，制成單細胞懸液，接種于用2%明膠包被的細胞培養瓶內，于37 ℃、5% CO2培養箱培養。72 h后觀察細胞形態，每2～3天換液1次，第2—第5代生長狀態良好的HUVECs用于實驗。用免疫熒光鑒定血管內皮細胞Ⅷ因子相關抗原以鑒定細胞。

②不同組分配伍比例對缺氧HUVECs存活率的影響 取對數生長期HUVECs，以每孔1×104個接種于96孔板，其余細胞培養及分組操作同“1.4.2 ①”項。正常對照組在CO2培養箱中培養，缺氧模型組和藥物干預組于三氣培養箱(1% O2、5% CO2、94% N2)共培養，藥物與細胞共培養12 h后，更換為含10% CCK-8的DMEM/F12培養液，37 ℃孵育3 h，使用多功能微孔板檢測儀，于450 nm處測定吸光度(A值)。實驗重復3次。

③不同組分配伍比例對缺氧HUVECs中活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量的影響 將細胞以每孔6×105個接種于6孔板，其余細胞分組及培養操作同“1.4.2②”項下，用全自動流式細胞分析儀檢測細胞ROS含量。具體實驗操作參考ROS檢測試劑盒說明書。

1.4.4主成分分析法篩選最佳配伍比例 分別以“1.4.2”和“1.4.3”項下細胞存活率及凋亡率的結果分析SH-SY5Y主成分及HUVECs主成分。首先進行適用性檢驗，判斷能否進行主成分分析；確定主成分數目，當主成分累計貢獻率≥70%時，保留相應成分，得出不同配伍組得分順序。

1.4.5最佳配伍比例對缺氧HUVECs保護作用的機制研究 ①最佳配伍比例對缺氧HUVECs凋亡的保護作用 取對數生長期的HUVECs，以每孔3×105個接種于6孔板，細胞分組及培養操作同“1.4.2②”項下，按Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒的說明書進行操作：取重懸的細胞離心(1000 r·min-1，5 min)，棄上清液，加入Annexin V-FITC 195μL結合液重懸細胞。加入Annexin V-FITC 5μL，混勻。加入碘化丙啶染色液10 μL，混勻。室溫避光孵育10～20 min，隨后置于冰浴中，進行流式細胞儀檢測，生成散點圖，記錄數據。

②最佳配伍比例對缺氧HUVECs蛋白表達的影響 取對數生長期HUVECs，接種于25 cm2培養瓶，細胞培養操作同“1.4.3②”項下，正常對照組于CO2培養箱中培養，缺氧模型對照組和給藥組(Gas：Dio=8：2)于三氣培養箱中共培養12 h。收集細胞，以細胞數量1×107加入1 mL裂解液，重懸細胞，冰上裂解20 min，13 000 r·min-1離心20 min(r=7 cm)，收集上清液，即HUVECs全蛋白樣品，用二喹啉甲酸法(bicinchoninic acid，BCA)法蛋白定量，以RIPA裂解液調整蛋白濃度，以SDS-PAGE凝膠電泳分離。濕轉法轉移蛋白至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，含3%牛血清白蛋白TBST緩沖液(BSA-TBST)封閉，水平搖床孵育30 min。含3%牛血清蛋白的TBST緩沖液(3% BSA-TBST)稀釋一抗，iNOS(1：1000)，VEGF(1：2000)，β-actin(1：10 000)，4 ℃水平搖床孵育過夜。5% 脫脂奶粉-TBST稀釋二抗，山羊抗兔IgG(H+L)HRP 1：10 000，室溫孵育40 min。ECL化學發光法顯示結果，膠片曝光，顯影2 min，定影。圖片掃描后，用Gel Image ststem ver.4.00(tanon，China)軟件對圖像進行分析。

2 結果

2.1不同組分配伍比例對谷氨酸損傷SH-SY5Y細胞的影響

2.1.1SH-SY5Y細胞存活率 2 mmol·L-1谷氨酸可以使SH-SY5Y細胞的存活率降到63%。當Gas±Dio=10±0，即Gas的濃度為20 μmol·L-1時，可以明顯提高細胞的存活率(P<0.05)，隨著Dio比例升高，存活率隨之下降。見表1。

表1 不同組分配伍比例對谷氨酸損傷SH-SY5Y細胞存活率的影響

2.1.2SH-SY5Y細胞凋亡 與正常組比較，模型組的正常細胞顯著下降，早期凋亡細胞與晚期凋亡細胞顯著增加；與模型組比較，當Gas與Dio的比例分別為6：4，5：5，0：10時，正常細胞的比例均明顯提高，晚期凋亡和壞死的細胞顯著下降(P<0.05)，并且隨著Dio比例的增多，這種下降更為明顯。見表2。

2.2不同組分配伍比例對缺氧HUVECs的影響

2.2.1HUVECs 形態學觀察與免疫熒光法 細胞鑒定倒置顯微鏡下觀察顯示：6 h 后細胞開始貼壁，并逐漸伸展，呈單層的扁平三角形或者多角形；貼壁48 h后，細胞迅速生長、融合，多數細胞聚集成團，形成內皮細胞島，逐漸向外擴散。貼壁5 d后，細胞融合成片，嵌入排列，融合成典型的鋪路石狀。

表2 不同組分配伍比例對Glu損傷SH-SY5Y細胞凋亡的影響

免疫熒光法鑒定血管內皮細胞Ⅷ因子相關抗原，結果顯示未標記Ⅷ因子一抗的陰性對照組的細胞漿不顯示熒光(圖1A)，標記了Ⅷ因子一抗的HUVECs的細胞漿呈明亮的綠色熒光，細胞核陰染(圖1B)。

A.未標記Ⅷ因子；B.標記了Ⅷ因子。

2.2.2不同組分配伍比例對缺氧HUVECs存活率的影響 如表3所示，在Gas：Dio=10：0，9：1，8：2，7：3時，可以明顯提高缺氧損傷的HUVECs的存活率(P<0.05)。

2.2.3不同組分配伍組對缺氧HUVECs中活性氧(ROS)含量的影響 缺氧12 h后可刺激HUVECs產生大量ROS，與正常組比較差異有統計學意義(P<0.05)。給藥組的7種比例均可顯著減少缺氧細胞中ROS含量(P<0.01)。見表4。

2.3主成分分析結果

2.3.1用谷氨酸損傷SH-SY5Y細胞 確定最佳配伍比例以表1、表2結果分析SH-SY5Y主成分。進行適應性檢驗，KMO度量=0.370，Bartelett值=86.385，P=0.000，即相關矩陣不是一個單位矩陣，因此考慮進行因子分析(表5)。當主成分的累計貢獻率≥70%時，則保留相應成分。如表5所示，前兩個的累計貢獻率為90.580%，因此可以用前兩個主成分代替原來的檢測指標。經過主成分分析后計算得出，最終7個配伍組的得分由高到低為：Gas：Dio=10：0，9：1，8：2，7：3，6：4，5：5，0：10。

表3 不同組分配伍比例對缺氧損傷HUVECs存活率的影響

2.3.2用缺氧HUVECs確定最佳配伍比例 以表3，表4結果分析HUVECs主成分。進行適用性檢驗，KMO度量=0.500，Bartelett值=4.074，P=0.000，即相關矩陣不是一個單位矩陣，因此考慮進行因子分析。如表6所示，第一個成分的貢獻率為72.230%，因此可以用第一個主成分代替原來的檢測指標。經過主成分分析后計算得出，最終7個配伍組的得分由高到低為：Gas：Dio=8：2，10：0，9：1，7：3，6：4，5：5，0：10。

表4 不同組分配伍比例對缺氧HUVECs內ROS含量的影響

表5 SH-SY5Y主成分的特征值和貢獻率

2.3.3優選最佳配伍比例 綜合“2.3.1”項和“2.3.2”項的結果，當Gas和Dio的比例為10：0，8：2和9：1時，效果較好。當Dio存在時，可以抑制細胞的凋亡，增加正常細胞的比例，通過降低ROS的含量參與調控氧化應激，表明Dio具有一定的積極作用，因此，本研究中Gas和Dio最佳配伍比例可能為8：2[12]或9：1。

2.4最佳配伍組對缺氧HUVECs凋亡的影響 與正常組比較，模型對照組的正常細胞的比例顯著降低，早凋和晚凋、壞死細胞的比例顯著增加(P<0.05)。給藥后，正常細胞的比例由59.17%增加到68.80%(P<0.01)；早期凋亡細胞比例由17.97%降低到14.23%(P<0.05)，晚期凋亡和壞死的細胞比例由21.8%下降到16.3%(P<0.01)。見表7。

表6 HUVECs主成分的特征值和貢獻率

2.5最佳配伍組對缺氧誘導后HUVECs的VGEF、HIF-1α、iNOS、eNOS表達的影響 如表8、圖2所示，與正常對照組比較，模型對照組HUVECs的VEGF增加，無顯著性差異，HIF-1α、iNOS的表達顯著增加，eNOS的表達顯著減少(P<0.05)，給藥后，VEGF、HIF-1α、iNOS的表達顯著減少，eNOS的表達顯著增加(P<0.05)。

3 討論

當腦組織嚴重缺血缺氧時，Na+-K+-ATP酶功能減弱導致胞外Cl-和Na+內流，K+外流，細胞膜電位隨之下降，激活電壓依賴性的Ca2+通道，Ca2+內流，囊泡內的谷氨酸被釋放出來，谷氨酸濃度增加會激活其受體，導致神經細胞離子流動性改變，線粒體功能紊亂，進一步引發NO和自由基的氧化損傷、蛋白酶釋放，神經細胞發生凋亡、壞死和自噬[13]。本實驗結果顯示，隨著Dio比例增加，Glu損傷的SH-SY5Y細胞的存活率降低，猜測Dio可能通過以下兩點發揮對Glu損傷的SH-SY5Y細胞的保護作用：①可以抑制細胞內線粒體脫氫酶的活性，降低細胞內氧化還原能力，通過降低損耗對損傷細胞發揮保護作用；②影響Na+-K+-ATP酶功能，使細胞凋亡壞死。

血管內皮細胞沿血管壁呈單層分布于血管腔內表面，具有多種生理功能，可以參與營養物質的運輸，調控凝血、血栓等，對缺氧較為敏感，成為缺氧時的首要受累細胞。內皮細胞缺氧時，ROS的含量明顯增多，并且引起炎癥反應、氧化應激等，加速細胞的凋亡[14]。本實驗在研究Gas與Dio不同配伍比例對缺氧HUVECs內ROS含量的影響時發現，各配伍比例均可不同程度地降低缺氧細胞中ROS的含量，且均差異有統計學意義，隨著Dio比例增加，ROS的降低更為明顯。由以上結果推測，Dio可以通過降低細胞線粒體內的脫氫酶活性，減少氧化還原反應的發生，減少細胞內ROS的含量發揮對缺氧內皮細胞的保護作用。

表7 最佳配伍組對缺氧HUVECs凋亡的影響

表8 Western blotting掃描結果

A.VEGF；B.HIF-1α；C.iNOS；D.eNOS；①與正常對照組比較，P<0.05；②與模型對照組比較，P<0.05。

氧化應激在中樞神經系統退行性疾病的病理進程中發揮著重要的作用，缺氧導致的氧化還原失衡會誘導內源性ROS的產生，進而導致細胞毒性，誘導細胞凋亡或退化[15]。eNOS正常狀態下僅產生少量的NO，可調節神經系統的功能，當細胞處于缺氧狀態時，iNOS的表達增加，產生大量NO，誘導VEGF的表達，最終導致血管新生[16]。HIF-1α作為血管生成的刺激因子，在缺氧條件下表達顯著增加，血管生成增加，可部分恢復缺血部位的供血情況，在缺氧適應方面發揮重要作用，而HIF-1α一旦過度表達，會導致血管生成過度增加，對病理性部位造成進一步損傷。給藥后，HIF-1α和VEGF表達降低，表明最佳配伍組能夠有效控制血管新生，避免血管新生過度造成的不良影響；最佳配伍組可以降低缺氧HUVECs中iNOS的表達，增加eNOS的表達，使二者趨于正常水平，表明Gas和Dio配伍之后能夠通過調控氧化應激水平，降低細胞內ROS的含量，使細胞氧化還原處于平衡狀態。因此，最佳配伍組可以降低缺氧HUVECs的凋亡，控制缺氧造成的血管新生，并且通過調控氧化應激，使缺氧細胞的氧化還原恢復正常水平。

遵循本課題組前期提出的民族藥組方優化基本原則[17]，本實驗利用基線等比增減設計法確定了Gas和Dio的7種配伍比例，并利用主成分分析方法確定Gas和Dio可能的最佳配伍比例為8：2或9：1，Dio可能通過作用于線粒體內的脫氫酶和細胞的Na+-K+-ATP酶發揮其對Glu損傷的SH-SY5Y細胞的保護作用，將Gas和Dio的配伍比例8：2作用在缺氧HUVECs，可以通過抑制凋亡、氧化應激、血管新生途徑參與對缺氧HUVECs的保護作用。