星點設計-響應面法優選美洲大蠊抗肝纖維化顆粒的成型工藝*

謝靜靜，楊永壽，郝芳芳，肖培云

(1.大理大學藥學與化學學院，大理 671000；2.浙江省溫州市第七人民醫院藥劑科，溫州 325100)

美洲大蠊(PeriplanetaamericanaL.)俗稱蟑螂，其藥用最早記載于《神農本草經》中[1]，近年來，美洲大蠊的藥用價值受到越來越多關注。研究表明，美洲大蠊具有廣泛的藥理活性，包括促進組織修復、抗氧化、抗纖維化等作用[2-6]，美洲大蠊中含有多肽、黏糖氨酸、多元醇等[7]。課題組前期通過體內外試驗篩選得到美洲大蠊抗肝纖維化活性部位(命名為PA-B)，研究表明美洲大蠊提取物灌胃給藥對實驗性肝纖維化大鼠具有較好的治療作用[8-9]。因此，考慮以制劑工藝簡單、便于包裝、口服方便的顆粒劑作為制劑進行研究。由于該提取物成分復雜，其中的黏糖氨酸類物質易吸濕結塊，不利于藥物的保存，影響藥物的穩定性。近年來，響應面法多應用于制劑工藝的優化[10-11]，因此本研究利用單因素實驗對常用抗濕性輔料進行初步篩選，再利用星點設計-響應面法優化美洲大蠊抗肝纖維化活性部位顆粒的成型工藝，以改善藥物的吸濕性，獲得具有一定抗濕性能的顆粒，增強美洲大蠊活性部位的穩定性，為后續制劑的進一步研究開發提供依據。

1 材料

1.1儀器 TEMI880綜合藥品穩定性試驗箱(上海藍豹試驗設備有限公司)；DHG-9420A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海一恒科技有限公司)；AL204-IC分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司，感量：0.1 mg)；GB/6003.1-2012藥篩(紹興市上虞圣超儀器設備有限公司)。

1.2試劑及藥材 美洲大蠊藥材由云南京新生物科技有限公司大理巍山養殖場提供(批號：M190801)，經大理大學云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室楊自忠鑒定為：昆蟲綱蜚蠊科昆蟲美洲大蠊(PeriplanetaamericanaL.)；美洲大蠊抗肝纖維化活性部位凍干粉(課題組自制，采用課題組前期提取純化工藝進行制備[12-13]，每克凍干粉相當于生藥137 g，批號：20180824，20180911，20180918)；乳糖(批號：180924)、微晶纖維素(microcrystalline cellulose，MCC，批號：190114)、玉米淀粉(批號：190223)、糊精(批號：190108)均購自陜西盤龍醫藥股份有限公司(藥用級別)；乙醇(天津市福晨化學儀器廠，批號：20160712)；其余試劑均為分析純，水為雙蒸水。

2 方法與結果

2.1顆粒成型工藝單因素考察

2.1.1輔料初步篩選 乳糖、微晶纖維素、玉米淀粉、糊精4種輔料，以吸濕百分率為指標進行考察，初步篩選適宜輔料，方法參照《中華人民共和國藥典》2020版四部通則9103藥物引濕性指導原則測定，結果見表1，由表1可知，120 h各輔料吸濕平衡后，乳糖與微晶纖維素吸濕性較低，糊精吸濕性最強。微晶纖維素是常用的成球促進劑，具有較好的成型性，在中成藥制劑選用較多，而乳糖價格較高，實用性差，且增加使用成本。考慮生產成本及吸濕性，初步選用淀粉及微晶纖維素進行后續實驗研究。

將藥物與初步篩選的輔料按1：1混勻，加適量70%乙醇為潤濕劑，20目(孔徑為0.85 mm)篩制粒，烘箱干燥，以成型率為評價指標考察單一輔料及混合后與藥物配伍情況。研究發現微晶纖維素顆粒成粉性較強，單獨與藥物配伍使用時顆粒平均成型率43.84%；而單獨使用淀粉時平均成型率79.21%，但制得的軟材過篩時黏篩情況嚴重，過篩困難導致物料浪費嚴重。因此最終確定輔料混合使用，可改善黏篩情況且成型率較好。

顆粒成型率(%)=成型顆粒質量/總顆粒質量。

2.1.2藥輔比例考察 先將淀粉和MCC按1：1混勻，得混合輔料，再將藥物與混合輔料按1：1，1：2，1：3，1：4混勻，測定吸濕率及成型率，兩者綜合評分為評價指標，得出最終選用藥輔比例，吸濕率與成型率評分系數分別為60%和40%，見公式(1)。測定結果見表2，當藥輔比為1：1時，由于藥物比例較大，成團性較強，黏篩導致物料浪費嚴重，故綜合評分未列入比較。考慮適當增加輔料的比例，當藥輔比例為1：3時綜合評分最高，暫定藥輔比1：3進行后續實驗，后續通過響應面分析優化得到最優藥輔比例。

公式(1)

2.1.3輔料比例考察 在藥輔比例為1：3條件下，將藥物與不同比例的MCC與淀粉(MCC：淀粉分別為3：1，2：1，1：1，1：2，1：3)，以吸濕率及成型率為評價指標得出最終選用的藥輔比例，由考察結果見表3可知，綜合評分無顯著性差異，但淀粉比例升高，制粒時軟材粘性較大，而凍干粉本身具有一定粘性，二者混合后黏篩較嚴重，因此最終選用比例1：1進行后續實驗優化。

2.1.4潤濕劑濃度考察 在藥輔比例及輔料比例考察的基礎上，按表4加入適量乙醇為潤濕劑，濕顆粒于60 ℃干燥4 h后整粒，以綜合評分為考察指標篩選最優潤濕劑濃度。由表4可知，乙醇濃度在60%～90%范圍內，綜合評分無顯著差異，但70%與80%濃度時評分較高，醇的濃度升高，制軟材時不易誘發藥物本身的粘性而粘連在一起，同時醇的濃度會影響成型率。因此選用60%～90%濃度范圍進行響應面設計優化，優選最佳乙醇濃度。

表1 輔料吸濕率考察結果

表2 藥輔比例考察結果

表3 輔料比例考察結果

表4 潤濕劑濃度考察結果

2.2響應面法優化顆粒成型工藝

2.2.1試驗設計 以輔料-凍干粉用量比例(A)、MCC-淀粉用量比例(B)、潤濕劑濃度(C)為影響因素，顆粒吸濕率及成型率的總評“歸一值”為評價指標，采用中心組合(CCD)三因素五水平設計(+1、-α、0、+α、-1)進行實驗，因素水平表見表5。數據采用Hassan法轉化為對應的歸一值，吸濕率采用公式d1，成型率采用公式d2計算，總評OD=(d1×d2)0.5，測定結果見表6。

表5 因素水平表

2.2.2模型擬合 應用 Design Expert 8.0.6版軟件分析，多元線性回歸、二項式和三項式擬合，并以相關系數(r)和置信度(P)為模型判定標準，選擇有較大r值和較優P值對方程進行優化。多元線性回歸的復相關系數較低，三項式擬合方程失擬項顯著(P=0.009 3)，表示模型擬合度不高，存在失擬情況，所以不宜用線性和三次項模型。而多元二項式回歸各擬合方程復相關系數均較高，表明具體實驗因素對效應值的影響不是簡單的線性關系，最后選擇多元二項式擬合模型為成功模型。

二項式方程：Y=0.601 62-0.190 20A+0.058 319B+0.095 048C-0.072 250AB-0.0341 00AC-0.080 775BC-0.085 614A2-0.051 001B2-0.123 37C2(r=0.928 9，P=0.000 1)。

二項式方差分析結果見表7，模型中A、C、A2、C2極顯著(P<0.01)，B、AB、BC顯著(P<0.05)，其他不顯著。各因素對成型工藝的影響程度依次為A>C>B，相關系數r為0.928 9，二次項模型P<0.05，失擬項P>0.05，擬合性較好，結果具有統計學意義。

2.2.3響應面分析 通過響應面分析，考察因素對于響應值的殘差正態分布散點成較好的直線分布，殘差服從正態分布，說明對隨機誤差具有較好的擬合。殘差與方程預測值對應散點分布分析，殘差與方程預測值對應散點分布分散，無規律，說明殘差在-4～4之間可以解釋大部分預測值，證明回歸方程是有效的。圖1，2，3分別為不同的響應因素對于響應值的3D響應面圖。實驗因素所構成的三維空間曲面圖反映兩變量間交互作用的顯著程度，其中3D響應面的曲線陡峭程度反映了該因素下對響應值的影響大小。對于響應值總評歸一值來說，藥輔比(A)較輔料比(B)和乙醇濃度(C)的曲面陡峭，說明藥輔比對響應值影響最大。輔料比(B)乙醇濃度(C)交互作用時，等高線排列趨于橢圓形，對響應值影響較大，乙醇濃度等高線密集，比較輔料比例對響應值影響較大，因此，綜合各因素對成型工藝響應值的影響程度依次為藥輔比(A)>乙醇濃度(C)>輔料比(B)。

表6 實驗設計與結果

表7 二項式方差分析結果

圖1 輔料比例與藥輔比例對響應值的影響

圖2 藥輔比例與乙醇濃度對響應值的影響

2.2.4驗證實驗 軟件擬合最佳工藝條件為輔料-凍干粉質量比2.84：1，MCC-淀粉質量比1.37：1，乙醇體積分數77.4%，預測總評“歸一值”0.676 6。按最優條件制備3批抗濕性顆粒，批號為：20190302，20190313，20190324，測得的成型率為60.48%，吸濕率為5.84%，總評歸一值為0.683 5，偏差為1.02%，表明該模型具備較高的準確性和精密性。

2.3顆粒物理性能考察

2.3.1流動性考察 取顆粒適量，測定休止角，休止角<40°表明制得的顆粒流動性符合要求。休止角測定儀測定顆粒休止角，使漏斗最下端與坐標紙保持1 cm高度，沿著漏斗壁倒入適量藥粉，根據坐標紙上形成圓錐體的半徑r，計算休止角。一般認為休止角小于30°時，流動性好，小于40°時可以滿足生產對流動性的需求[10]。由表8可知，制備的3批顆粒休止角26.09°，流動性符合要求。

2.3.2堆密度測定 分別取適量顆粒，置10 mL量筒中，輕敲量筒壁直至體積不再改變，讀出顆粒的體積，共測定3次，計算堆密度，即顆粒質量與體積之比[14]。堆密度反應物料粉體學性質，可為后續顆粒的保存及裝填膠囊提供參考。測得3批顆粒堆密度均值為0.267 2 g·mL-1，結果見表9。

圖3 輔料比例與乙醇濃度對響應值的影響

表8 休止角考察結果

表9 堆密度考察結果

2.3.3顆粒水分測定 參照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則0104顆粒劑項下規定測定水分，根據減失的重量，計算供試品中含水量(%)，水分含量應小于8.0%。由表10可知，測定3批顆粒含水量為5.79%，符合相關規定。

表10 水分測定結果

3 討論

中藥制劑的吸濕問題直接影響中藥的后續開發，中藥吸濕后含水量較高，易發生霉變，不僅影響藥物的成型，而且影響藥物的穩定。美洲大蠊抗肝纖維化活性部位凍干粉具有較強的粘性和吸濕性[15]，無法保持良好的粉體性質。本研究通過加入抗濕性的輔料，輔料與藥物混勻結合形成致密的防水屏障，可改善藥物易吸濕的特性，以保證制劑的順利研制。本實驗初步對乳糖、MCC、玉米淀粉、糊精的吸濕性進行了考察，篩選出適宜輔料，再將藥物與篩選得到的微晶纖維素及淀粉單獨配伍及混合輔料配伍，可知混合輔料與藥物配伍時，過篩情況及成型率較好。響應面法相較于正交設計優化工藝，可對結果進行連續的預測分析，而后者僅對單一組合進行篩選，響應面分析是當前對結果進行模型預測分析的熱點。因此，本實驗通過單因素實驗結合星點設計-響應面法優化美洲大蠊抗肝纖維化活性部位的制粒工藝，工藝參數中藥輔質量比、輔料比例及乙醇質量分數影響所制軟材手捏成團輕壓即散的性狀，最終直接影響顆粒的成型率及吸濕率，將二者數值的歸一值作為最終響應指標進行擬合優化，得到最佳條件為輔料：凍干粉質量比2.84：1，MCC：淀粉質量比1.37：1，乙醇體積分數77.4%，各因素對響應值的影響大小為藥輔質量比(A)>乙醇體積分數(C)>輔料質量比(B)，通過響應面優化輔料與藥物配比工藝，可改善藥物吸濕易成團的性質。對優化所得的工藝進行了驗證，并對所得顆粒的物理性能考察，測得3批顆粒物理性能指標休止角為26.09°，堆密度為0.267 2 g·mL-1，水分含量5.79%，結果顯示顆粒流動性較好，含水量符合規定，明顯改善美洲大蠊活性部位易成團結塊的性質。同時對顆粒堆密度進行測定，可為后續顆粒裝填于膠囊，或與適宜輔料混勻壓片提供依據。