細胞貼壁效應是評價胎牛血清質量的重要因素

劉雪莉 郭慶 王靜 王霄 肖捷 王斌 余巍

(1.大理大學藥學院，云南 大理 671003；2.解放軍聯勤保障部隊第920醫院，云南 昆明 650031；3.昆明學院農學與生命科學學院，云南 昆明 650214)

動物細胞培養技術的發展極大地推進了現代生物醫藥產業的發展，該技術被廣泛應用于單克隆抗體的制備、重組蛋白藥物的研發、人造器官移植等行業，成為生物制藥領域的關鍵技術之一[1]。由于血清具有終止胰蛋白酶消化，提供細胞生長所需的貼壁因子、免疫球蛋白、胰島素等其它營養成分及細胞因子，因此成為體外細胞培養液中的常用添加成分，其對細胞的培養意義重大[2,3]，其為細胞生長和維持提供了必要的活性成分[4]。胎牛血清(FBS)從母體內胎兒中獲取，含有多種生長因子和細胞因子，可模擬細胞增殖和維持[5]，含有大量的蛋白成分，最主要的蛋白成分有白蛋白、A1抗胰蛋白酶、轉鐵蛋白、Ig類抗體，還有含量不等的如A2巨球蛋白、A1和B1脂蛋白、膽固醇、纖維結合蛋白、膽紅素和類胡蘿卜素等成分[6]，是許多重組蛋白及藥物生產和研發用細胞培養基中的關鍵成分，對細胞生長的需要仍難以大規模的用其它物質所代替。另外，胎牛血清中胎球蛋白A(fetuin-A)等成分的差異在培養細胞粘附中已發揮重要作用[7]。研究表明，細胞通過其粘附蛋白包括纖維連接蛋白(Fibronectin，Fn)和體外連接蛋白(Vitronectin，Vn)吸附在人工材料的培養皿上。不同比例的白蛋白和胎牛血清混合溶液等復雜介質對Fn和Vn通過培養皿表面自組裝單分子膜對細胞粘附的作用有較大差異[8]。在日常的細胞培養過程中，發現使用不同來源生產廠家的胎牛血清配制培養液，對細胞的生長速率及狀態的影響存在明顯差異，尤其在更換培養裝置后，差異更為明顯。分析可能是不同胎牛血清的細胞粘附相關因子之間的差異所致，因此推測胎牛血清的細胞粘附效應可能是影響貼壁細胞生長、分化、繁殖及凋亡等生命活動的關鍵因素。

明膠是一種公認安全的水膠體，應用范圍廣泛，是膠原的部分水解產物，存在細胞結合位點，酶解產物無毒且易被吸收，具有生物相容性高和親細胞性強等優點，可增加細胞粘附力，促進細胞貼壁、增殖，可改變細胞生長微環境，為細胞生長環境提供力學支持[9-11]。本研究主要以0.1%明膠包被培養裝置，用重組藥物生產細胞——中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)細胞為培養物，將CHO細胞培養于不同的培養裝置并連續培養3代，通過對比1種常用的進口胎牛血清與2種國產胎牛血清在不同培養裝置培養細胞時，使用0.1%明膠包被培養裝置前后為對比，分析在改變貼壁效應后，3種胎牛血清在細胞生長密度、活力等指標的變化差異，以驗證血清的貼壁效應決定細胞生長狀態的推測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株

CHO-K1細胞株(ATCC 編號為CCL-61)。

1.1.2 胎牛血清

國產1號購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司，TBD優級胎牛血清，貨號：TBD25HY；國產2號購自上海源葉生物科技有限公司，貨號：MP20001胎牛血清；進口購自以色列BI Biological Industries，貨號：04-102-1ACS。

1.1.3 主要試劑

RPMI 1640，購自以色列BI Biological Industries，貨號：11-100-1N；碳酸氫鈉(NaHCO3)購自中國美侖生物，貨號：MB0115；青霉素-鏈霉素-兩性霉素B(100×)購自中國新賽美生物科技有限公司，貨號：C125C8；胰蛋白酶-EDTA消化液購自中國Solarbio公司，貨號：T1300；1%明膠購自中國Solarbio公司，貨號：G0040；培養皿購自美國CORNING公司；T25培養瓶購自中國Crystalgen公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養液的配制

具體見表1。

表1 1L細胞培養液的配制

1.2.2 細胞培養

試驗時培養細胞分為2組。將CHO細胞以相同的起始量接種于T25瓶和培養皿內，T25瓶和培養皿內的培養液總體積固定為10mL，每種血清、每種培養裝置分別設3個重復，在37℃、5%CO2的培養箱中密閉培養。以使用進口胎牛血清的細胞為對照，將使用國產胎牛血清的培養裝置，用0.1%的明膠包被，將細胞以相同的起始量接種于T25瓶和培養皿內，T25瓶和培養皿內的培養液總體積固定為10mL，每種血清、每種培養裝置分別設3個重復，在37℃、5%CO2的培養箱中密閉培養。待細胞匯合度達到90%以上時，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化細胞，分別進行計數，計算每組細胞密度、細胞均數、細胞活力。

1.2.3 明膠使用方法

使用無菌去離子水將1%的明膠稀釋成0.1%，取適量體積0.1%的明膠，加入待用的培養裝置中，均勻分布在培養裝置的底部，在5%CO2、37℃培養箱中放置1h后取出，吸棄多余明膠，無菌干凈操作臺吹干備用。

1.2.4 細胞計數及細胞活力計算

細胞匯合度達到80%～90%后，使用臺盼藍染色法，在生物顯微鏡下計數。細胞活力的計算公式：

細胞活力=(細胞總數-死細胞總數)/活細胞總數×100%

1.2.5 統計學分析

使用Origin Pro 8.5軟件對數據進行單因素方差統計分析，若P<0.05，說明數據之間有顯著性差異。

2 結果

2.1 胎牛血清在不同培養裝置對細胞密度及活力的影響

通過倒置光學顯微鏡觀察細胞，使用進口胎牛血清配制的培養基的細胞匯合度已經達到90%以上，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化細胞，使用臺盼藍染色法，在生物顯微鏡下進行計數，分別計每組細胞的死細胞與活細胞數量，根據計數結果，計算每毫升培養液中細胞的密度，見圖1a、圖1b。結果顯示，在T25瓶內進口胎牛血清對細胞密度的影響與國產1號胎牛血清之間呈極顯著差異，與國產2號胎牛血清之間無顯著差異；國產2號與國產1號胎牛血清之間也有顯著差異。在培養皿內，進口胎牛血清對細胞密度的影響與國產1號胎牛血清之間有顯著差異，與國產2號胎牛血清之間無顯著差異，而國產1號與國產2號胎牛血清無顯著差異。即無論在T25瓶內還是在培養皿內培養CHO細胞，國產2號胎牛血清與進口胎牛血清對細胞密度的影響均無顯著差異，但是國產1號與國產2號之間的差異在不同培養裝置中則表現不同。

根據不同培養裝置比較每組細胞的細胞活力，如圖1c、圖1d所示，T25瓶內3組數據中P>0.05，說明3組數據無顯著性差異；但在培養皿內3組數據中P<0.05，說明3組數據有顯著性差異，即進口胎牛血清與國產1號、國產2號胎牛血清對細胞活力的影響之間均呈顯著差異；但國產1號與國產2號之間無顯著差異。結果表明，使用培養皿與T25培養瓶培養細胞時，3種胎牛血清對細胞生長活力存在顯著性差異。

圖1 未使用明膠時不同胎牛血清于不同培養裝置對CHO細胞密度及細胞活力的比較注：**表示在P<0.01水平上的顯著關系；*表示在P<0.05水平上的顯著關系。

2.2 胎牛血清在明膠包被的培養裝置中對細胞密度及活力的影響

考慮到胎牛血清中粘附因子與不同培養裝置之間可能存在粘附效應的區別。用0.1%的明膠對不同的培養裝置進行包被，研究3種胎牛血清配制的培養液對細胞生長是否有差異。

細胞培養24h后，在倒置光學顯微鏡下觀察細胞，如圖2，顯示未使用明膠時，進口胎牛血清配制的培養液的細胞密度大于使用國產胎牛血清的細胞密度，國產2號的細胞密度大于國產1號。當使用明膠后，使用國產2號胎牛血清的細胞密度優于國產1號與進口胎牛血清，國產1號與進口胎牛血清無明顯差別。

圖2 使用明膠前后不同的胎牛血清之間細胞密度的比較(×10)

通過比較細胞密度和活力，結果如圖3所示，在T25瓶內，使用國產2號的細胞密度高于使用進口胎牛血清的細胞，并與其有極顯著性差異(P<0.01)；在培養皿內，使用進口胎牛血清的細胞產量略高于使用國產胎牛血清的細胞，但P>0.05，三者無顯著性差異。細胞活力方面，無論在T25瓶內還是在培養皿內，使用2種國產胎牛血清和進口胎牛血清配制的培養液對細胞活力影響均無顯著性差異。

圖3 使用明膠后不同胎牛血清于不同培養裝置對CHO細胞密度及細胞活力的比較注：**表示在P<0.01水平上的顯著關系；*表示在P<0.05水平上的顯著關系。

研究表明，當培養裝置使用0.1%明膠包被后，2種國產胎牛血清對細胞生長密度和活力的影響發生顯著變化。另外，用明膠提高培養裝置的粘附效應后，培養裝置之間的差異也消失了，表明不同胎牛血清中的粘附分子與培養裝置產生的粘附效應對細胞生長和活力的影響非常重要。

3 討論

胎牛血清由于生長因子含量豐富，已成為細胞培養基的標準補充劑[12]，其優勢包括細胞增殖和維持所需的大多數因子的混合物；幾乎是通用的生長補充劑，對大多數類型的人和動物細胞都有效(包括昆蟲)；使用補充血清的培養基減少了為每種細胞類型開發特定的、優化的培養基配方所需的時間和精力[13]。對胎牛血清質量的評價是發展國產高端胎牛血清的重要基礎。

根據本次實驗對比，以細胞密度變化為評估指標時，在T25瓶內國產1號與進口胎牛血清和國產2號胎牛血清對細胞密度的影響呈顯著差異，而在培養皿內國產1號與國產2號之間差異則不顯著。當以細胞活力為評價指標時，進口胎牛血清與2種國產胎牛血清于T25瓶內對細胞活力的影響均無顯著性差異(P>0.05)，但在培養皿內則呈有顯著性差異(P<0.05)。表明血清中粘附因子與培養裝置表面的粘附效應是影響細胞生長和活力的關鍵因素。使用0.1%明膠包被培養裝置后，改變培養皿表面的粘附效應后，國產1號胎牛血清無論在T25瓶內還是培養皿內，與進口胎牛血清對細胞的密度及細胞活力之間都無顯著性差異(P>0.05)；而國產2號胎牛血清在T25瓶內，對細胞密度的影響甚至優于進口胎牛血清(P<0.01)。進一步證明了胎牛血清中粘附分子產生的粘附效應對細胞生長和活力的關鍵影響。綜合來看，2種國產胎牛血清都可能因為粘附分子的優化組合導致細胞對不同培養裝置的粘附效應略遜于進口胎牛血清，進而導致了其對細胞生長速度和活力影響的下降。該結果表明胎牛血清的粘附效應對細胞生長非常重要，可作為評價胎牛血清質量的重要指標。

另外，細胞的培養除了對細胞條件培養基有較高要求外，生命科學的快速發展對高分子材料的培養裝置表面性能如浸潤性、黏附性、生物相容性、電學性能、阻燃性等提出了更高的要求[14]。不同廠商生產的T25瓶和培養皿表面對細胞的粘附能力存在區別。當培養裝置使用明膠包被后，可以通過增加其粘附性改變不同裝置對細胞粘附效應的影響，從而從不同的角度評價3種胎牛血清對細胞生長的影響。

Kyungsook Kim等[4]研究表明，在含FBS培養基中培養的間充質干細胞(MSC)，含有較高的穩定細胞粘附相關的β-肌動蛋白和整合素β-1(ITGβ1)的基因表達水平，并且隨著細胞密度的增加而增加。細胞微環境以多因子(趨化因子、細胞外基質)協同的方式對細胞粘附與遷移進行調控[15]。而胎牛血清以及高分子材料的細胞培養裝置，會對細胞的微環境產生一定的影響。當細胞粘附在基底上時，細胞骨架會通過整合素(Integrin)與基底進行連接，并通過粘著斑將肌動蛋白和肌球蛋白II產生的力學刺激傳遞給細胞外基質[16]。推測本文所選的3種胎牛血清在細胞粘附因子的成分上有所差異，可能由于不同細胞粘附因子的組成與細胞培養容器表面分子發生相互作用，導致細胞生長速度和活力的差異。

本研究發現胎牛血清中粘附因子成分與細胞培養容器表面分子相互作用對細胞活力產生的影響，同時證明胎牛血清的粘附效應是評價胎牛血清質量的重要指標。