白芍總苷對糖尿病所致心肌損傷的保護作用及機制研究

王振賢 王立哲

糖尿病心肌病是由長期高血糖所導致的心肌組織結構病變和功能損傷，是糖尿病患者最常見的并發癥，也是導致其心力衰竭、心源性休克甚至死亡的主要因素之一[1-2]，因此防治糖尿病心肌病對糖尿病患者具有積極意義。近年來研究發現，炎癥反應和心肌纖維化在糖尿病心肌病并發癥發生、發展過程中發揮著重要作用[3-4]。白芍總苷（total glucosides of paeony,TGP）是中藥白芍中提取的一類活性化合物，包括芍藥苷、羥基芍藥苷、芍藥內酯苷等成分，具有良好的抗炎活性并對腹膜、肝纖維化具有顯著的抑制作用[5-7]。本研究通過腹腔注射鏈尿佐菌素聯合高脂飼料喂養制備糖尿病心肌病大鼠模型，探討TGP對糖尿病所致心肌損傷的保護作用及機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 健康、清潔級雄性SD大鼠120只，體質量（220±20）g，均購自河北省實驗動物中心[SYXK（冀）2018-004]。

1.2 藥物與試劑 TGP膠囊購自寧波立華制藥有限公司（批號：20190517，規格：0.3 g/粒）；鹽酸二甲雙胍片（metformin，Met）購自天津亞寶藥業科技有限公司（批號：190731，規格：0.3 g/片）；HE、Masson染色試劑盒和ELC超敏發光試劑盒均購自南京建成生物工程研究所（批號：191219、191124、200107）；TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒均購自北京索萊寶生物科技有限公司（批號：SEKR-0009、SEKR-0002、SEKR-0005）；Toll樣受體 4（TLR4）、髓樣分化蛋白（MyD88）、NF-κB抗體和IgG二抗均購自北京博奧森生物科技有限公司（批號：bs-20594R、bs-1047R、bs-23217R、bs-0294P）；BCA試劑盒、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠試劑盒均購自北京康為世紀生物科技有限公司（批號：CW0014、CW0022M）。

1.3 主要儀器 Sure Step Plus型血糖儀購自美國強生公司；Vevo2100型動物超聲儀檢測購自加拿大Visual Sonics公司；HM340E石蠟切片機購自德國Thermo Scientific公司；Allegra 21R型低溫離心機購自美國Beckman公司；RT-6100型酶標儀購自美國Rayto公司；DYCZ-24DN型電泳儀、DYCZ-40D型轉膜儀均購自北京六一生物科技有限公司；Chem Doc XRS型凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組、模型制備與給藥 將120只大鼠按隨機數字表法分為 Met組（200 mg/kg）[8]、TGP 低、中、高劑量組（50、100、200 mg/kg）組[9]、模型組和正常對照組，每組20只。除正常對照組外，其余各組大鼠均采用一次性腹腔注射鏈尿佐菌素（65 mg/kg）聯合高脂飼料喂養8周的方法制備糖尿病心肌病大鼠模型，造模成功標準參照文獻[10]。自造模第1天開始，Met組1次/d 40 mg/ml的Met溶液灌胃（灌胃體積5 ml/kg），TGP 低、中、高劑量組分別 1次/d 10、20、40 mg/ml的TGP溶液灌胃（灌胃體積5 ml/kg），模型組和正常對照組同步予0.9%氯化鈉溶液灌胃（灌胃體積5 ml/kg），療程8周。

1.4.2 各組大鼠FPG水平和心功能指標檢測 給藥8周后，各組隨機取10只大鼠，于清晨空腹采集尾靜脈血，用血糖儀檢測FPG水平。用動物超聲儀檢測心功能指標：左心室舒張末期內徑（LVIDd）、左心室收縮末期內徑（LVIDs）、射血分數（EF）、每搏輸出量（SV），連續測量5個心動周期，取其平均值。

1.4.3 各組大鼠心肌組織病理學改變和纖維化程度觀察 上述大鼠麻醉后開胸取心臟，切取左心室置10%甲醛溶液中固定3 d，石蠟包埋后5 μm厚度連續切片，二甲苯透明和梯度乙醇脫蠟水化后：（1）行HE染色，梯度乙醇脫水和透明處理后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察心肌組織病理學改變；（2）參照Masson染色試制盒操作說明書處理，顯微鏡下觀察心肌纖維化程度（肌纖維呈紅色，膠原纖維呈藍色）。

1.4.4 各組大鼠血清炎癥因子含量檢測 取各組剩余的10只大鼠，麻醉后經腹主動脈取血，2 000 r/min離心10 min取血清，參照ELISA試劑盒操作方法檢測血清 TNF-α、IL-1β、IL-6 含量。

1.4.5 各組大鼠心肌組織蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。上述大鼠取血完成后開胸取心臟，切取左心室心肌組織剪碎后加入9倍量冷裂解液充分裂解，4℃、12 000 r/min離心20 min后取上清液，然后參照BCA試劑盒說明書檢測總蛋白濃度、95℃水浴使蛋白變性后，經SDS-PAGE膠電泳分離、轉膜、5%蛋白免疫印跡封閉液室溫封閉2 h，滴加目標蛋白、β-actin抗體4℃孵育12 h，PBS溶液洗膜后滴加二抗37℃孵育1 h，PBS溶液洗膜后滴加ELC發光試劑后，通過凝膠成像儀顯示蛋白條帶，以β-actin為內參、通過條帶灰度值半定量目標蛋白表達水平。

1.5 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠FPG水平比較 與正常對照組比較，模型組大鼠FPG水平明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，Met組和TGP中、高劑量組FPG水平均明顯降低，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。見表 1。

表1 各組大鼠FPG水平比較（mmol/L）

2.2 各組大鼠心功能指標比較 與正常對照組比較，模型組大鼠LVIDd、LVIDs均明顯升高，而EF、SV均明顯降低，差異均有統計學意義（均P＜0.01）；與模型組比較，Met組和TGP中、高劑量組LVIDd、LVIDs均明顯降低，而EF、SV均明顯升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與Met組比較，TGP高劑量組LVIDs明顯降低，EF、SV均明顯升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠心功能指標比較

2.3 各組大鼠心肌組織病理學改變 正常對照組大鼠心肌纖維排列整齊規則，細胞形態正常、結構完整，著色均勻；模型組可見心肌纖維斷裂、排列紊亂，細胞呈空泡變性，可見大量炎性細胞浸潤；與模型組比較，Met組和TGP低、中、高劑量組心肌纖維和細胞病變呈不同程度改善，其中TGP高劑量組未見心肌纖維斷裂，炎性細胞浸潤數量明顯減少。見圖1（插頁）。

圖1 各組大鼠心肌組織病理學改變[a：正常對照組；b：模型組；c：二甲雙胍（Met）組；d：白芍總苷（TGP）低劑量組；e：TGP 中劑量組；f：TGP高劑量組；HE染色，×200]

2.4 各組大鼠心肌纖維化程度改變 正常對照組大鼠心肌可見肌束平行方向的膠原纖維，含量適宜、分布均勻；與正常對照組比較，模型組藍染膠原纖維明顯增多，排列紊亂，分布不均、以血管周圍含量較多；與模型組比較，Met組和TGP低、中、高劑量組心肌纖維化呈不同程度減輕，其中以TGP高劑量改善最為明顯。見圖2（插頁）。

圖2 各組大鼠心肌纖維化程度改變[a：正常對照組；b：模型組；c：二甲雙胍（Met）組；d：白芍總苷（TGP）低劑量組；e：TGP中劑量組；f：TGP高劑量組；Masson染色，×200]

2.5 各組大鼠血清炎癥因子含量比較 與正常對照組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量均明顯升高，差異均有統計學意義（均P＜0.01）；與模型組比較，Met組和TGP中、高劑量組 TNF-α、IL-1β、IL-6含量均明顯降低，差異均有統計學意義（均P＜0.01）；與 Met組比較，TGP高劑量組TNF-α、IL-6含量均明顯降低，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠血清炎癥因子含量比較（pg/ml）

2.6 各組大鼠心肌組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達水平比較 與正常對照組比較，模型組大鼠TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達水平均明顯上調，差異均有統計學意義（均P＜0.01）；與模型組比較，Met組和TGP中、高劑量組TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達水平均明顯下調，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與Met組比較，TGP 高劑量組 TLR4、MyD88、NF-κB 蛋白表達水平均明顯下調，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見圖 3、表 4。

表4 各組大鼠心肌組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達水平比較

圖3 各組大鼠心肌組織Toll樣受體4（TLR4）、髓樣分化蛋白（MyD88）、NF-κB 蛋白表達的電泳圖[a：正常對照組；b：模型組；c：二甲雙胍（Met）組；d：白芍總苷（TGP）低劑量組；e：TGP 中劑量組；f：TGP 高劑量組]

3 討論

糖尿病心肌病是糖尿病最常見的并發癥，以心肌細胞肥大和心肌纖維化為主要病理特征，可導致心肌收縮功能障礙進而引發心力衰竭、心源性休克甚至致殘、致死，約占Ⅱ型糖尿病死亡數的80%[11]。Wu等[12]研究發現持續高血糖刺激炎癥細胞因子大量釋放是導致心肌纖維化發生、發展的重要機制。因此，以抑制炎癥反應及心肌纖維化為治療靶點對防治糖尿病心肌病至關重要。

近年來，隨著國家中醫藥發展戰略的實施與深入，中醫藥治療糖尿病逐漸得到醫生和患者的關注與認可。中藥白芍以毛茛科植物芍藥的干燥根入藥，味苦、性寒，具有養血調經、斂陰止汗、平抑肝陽之功效。TGP為白芍的主要活性成分，具有良好的抗炎活性和抗纖維化作用[5-7]；曹秋夏等[13]研究發現TGP能夠通過抑制炎癥反應和腎間質纖維化而對糖尿病大鼠腎臟起到保護作用。本實驗研究結果發現，糖尿病模型大鼠呈現心肌纖維斷裂、細胞空泡變性、炎性細胞浸潤等病理性改變以及血管周圍較多見的心肌纖維化，這與劉金巖等[14]研究報道一致；給予TGP治療8周能夠明顯降低糖尿病大鼠FPG水平，明顯改善心功能指標（降低LVIDd、LVIDs并提高EF、SV），改善心肌纖維和細胞形態結構病變并降低心肌纖維化程度，并且TGP高劑量組對心功能指標和心肌病變的改善作用優于Met組，提示TGP對糖尿病大鼠心肌結構和功能具有保護作用。

持續高血糖將刺激心肌細胞大量釋放炎癥細胞因子和趨化因子等，TNF-α、1L-6、IL-1β 不但能夠介導炎癥反應而導致心肌損傷，并且能夠刺激粒細胞等進一步合成與釋放炎癥因子引發炎癥級聯反應而逐漸加重心肌損傷[15]。TLR4在心肌組織中廣泛表達并參與心肌炎癥的調節[16]，TLR4被激活后能夠活化MyD88炎癥通路；另外，TLR4/MyD88通路能夠間接激活NF-κB，而 NF-κB 則能夠刺激 TNF-α、1L-6、IL-1β 轉錄表達，從而加重炎癥反應[17]。本研究結果發現，給予TGP治療8周能夠明顯降低糖尿病大鼠血清TNF-α、1L-6、IL-1β 水平，降低心肌組織 TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達水平，提示TGP具有抑制糖尿病大鼠心肌炎癥反應的作用，可能與抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路有關。

綜上所述，TGP對糖尿病大鼠心肌結構和功能具有保護作用，其機制可能與抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路進而抑制炎癥反應有關。