白茅苷對去卵巢大鼠骨髓間充質干細胞功能和骨量的影響

趙王林 畢衡 孔俊博 馬菲 許劍 王清 李智奎

云南省中醫醫院骨科，云南 昆明 650021

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMO)是由雌激素缺乏引起的以絕經后婦女骨密度和骨質量受損為特征的代謝性骨質疏松癥[1-2]。骨質疏松癥的重要臨床特征是骨量、骨微結構和生物力學性能受損引起的慢性骨痛和骨折。這些癥狀會顯著降低PMO患者的生活質量和功能能力。PMO現在已經成為一個涉及醫學、社會和經濟的全球公共衛生問題。目前對PMO治療最有效的方案是使用抗骨質疏松藥物進行干預，但是臨床上常用二磷酸鹽、雌激素等。

藥物具有一些局限性和不良反應，包括血栓栓塞和胃腸道刺激[3]，因此需要開發新的藥物用于治療這類疾病。白茅苷(BMG)是一種線性的呋喃香豆素化合物，是從當歸和其他中藥成分中分離出來的。BMG是一種植物提取物，廣泛可得且便宜，并且具有抗氧化和抗凋亡作用[4-5]。有研究表明BMG能促進MC3T3-E1細胞增殖和分化[6]。鑒于BMG對成骨細胞的影響，因此其可用于治療骨質疏松；但是，BMG是否能發揮骨保護作用仍不確定。因此本研究通過BMG干預觀察骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)向成骨細胞誘導分化及觀察去卵巢大鼠骨量、骨密度以及骨強度影響，初步探索BMG預防和治療絕經后骨質疏松癥機制。

1 材料與方法

1.1 實驗模型建立和治療

本研究選用30只體重220～260 g，3月齡雌性SD大鼠，購自上海實驗動物中心(中國上海)。每組5只大鼠飼養在一只籠子里，光照時間為12 h/d，溫度為25 ℃，通風干燥；可以自由飲食。適應1周后，10只大鼠接受假手術(Sham)，其余大鼠行雙側卵巢切除術(OVX)。常規麻醉消毒后，腰3椎體周圍1.5 cm處切開一條縱向切口，露出腹腔，OVX組大鼠切除雙側卵巢，Sham組打開腹腔后縫合腹腔。

手術3 d后進一步將大鼠分為3組(n=10只/組)：Sham組、OVX組、BMG組：去卵巢大鼠術后給予白茅苷[20 mg/(kg·d)，Sigma-Aldrich]灌胃治療，而OVX組和Sham組的大鼠則給予相同體積的生理鹽水；12周治療結束時過量水合氯醛麻醉處死大鼠，獲取雙側股骨進行進一步檢測。

1.2 體外細胞研究

三組大鼠在手術12周后進行安樂死。通過用α-MEM沖洗從股骨中分離出BMSCs，并用紅細胞裂解緩沖液去除紅細胞。洗滌后，將細胞在標準培養液(含有10% FBS，100 U/mL青霉素和100 g/mL鏈霉素的α-MEM)中于75 cm培養瓶中于37 ℃，5% CO2。用0.25%胰蛋白酶-EDTA對大鼠原代BMSCs進行胰酶消化，然后重新鋪板。后續實驗中使用的所有細胞均為第2代。為了進行成骨分化，將各組大鼠的BMSCs在10個12孔板中以1×104細胞/cm2的密度培養。達到80%匯合后，將細胞在成骨培養基(含有10%FBS，10 mmol/Lβ-甘油磷酸酯，100 nmol/L地塞米松和50 g/mL L-抗壞血酸的DMEM)中培養21 d。每3 d更換成骨培養基；在成骨分化2周和3周后分別使用堿性磷酸酶(ALP)和茜素紅(ARS)染色。將BMSCs固定在4%多聚甲醛(pH=7.4)中，并在0.1%ARS或者ALP溶液(pH=4.2)中于室溫孵育15 min。使用Olympus IX51顯微鏡捕獲數字圖像。使用分光光度計在420 nm處測定吸光度。

1.3 蛋白質印跡(WB)檢測

收集BMSCs并在放射免疫沉淀測定緩沖液(RIPA，Beyotime，中國上海)中裂解。離心后，使用BCA蛋白質測定試劑盒測量上清液中的蛋白質水平。將蛋白質樣品上樣進行電泳，然后轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(Millipore，Billerica，MA，美國)。將膜在5%脫脂奶中封閉2 h，然后與BMP-2、Runx2、OPN、OCN、ALP、Col1和GAPDH一抗和二抗一起孵育。通過增強的化學發光(ECL)對條帶進行曝光，并通過Image Software(版本X；Media Cybernetics，Silver Springs，MD，美國)進行分析。

1.4 Micro-CT和骨生物力學檢測

使用Micro-CT系統(Skyscan 1176，Kontich，Belgium)檢查股骨遠端的微結構特性。骨掃描分辨率高(18 μm)，能量65 kV，385 A。采用NRecon v1.6和CTAn v1.13.8.1軟件進行三維重建。感興趣區(ROI)定義為股骨遠端的松質骨。計算骨密度(BMD，g/cm3)和骨微觀結構參數：骨體積比(BV/TV，%)、骨小梁數目(Tb.N，mm-1)、骨小梁厚度(Tb.Th，mm)和骨小梁間距(Tb.Sp，mm)。

Micro-CT檢測后對大鼠股骨進行三點彎曲實驗，將左側股骨放在Instron 萬能材料試驗機力學測試裝置上。將股骨放在支架的中間位置，以10 mm/min的持續測試速度加載直到股骨骨折。記錄數據，最后通過Instron軟件分析以獲得最大載荷(N)和彈性模量(mm2)。

1.5 統計學分析

使用SPSS 20.0進行數據分析。結果使用均數±標準差；組間差異通過t檢驗進行分析；P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 BMG對BMSCs誘導向成骨細胞分化的作用

ALP和ARS染色如圖1所示，OVX組大鼠BMSCs向成骨細胞分化后ALP和ARS染色陽性面積較Sham組明顯降低(P<0.05)；而經過BMG治療，BMG組大鼠BMSCs向成骨細胞分化后ALP和ARS染色陽性面積較OVX組明顯增加(P<0.05)。

2.2 BMG對各組細胞蛋白表達影響

和Sham組比較，OVX組BMP-2、Runx2、OPN、OCN、ALP和Col1表達水平明顯下調，比較差異有統計學意義(P<0.05)。和OVX組比較，BMG組BMP-2、Runx2、OPN、OCN、ALP和Col1表達水平上調，比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 使用WB檢測BMP-2、Runx2、OPN、OCN、ALP和Col1的相對表達Fig.2 Relative expression of BMP-2, Runx2, OPN, OCN, ALP, and Col1 using Western blotting注：和Sham組比較，*P<0.05；和OVX組比較，#P<0.05。

2.3 Micro-CT分析

股骨干骺端骨小梁三維重建圖像如圖3A所示。股骨干骺端的微觀參數如圖3B～3F所示。OVX組股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th較Sham組明顯降低，而Tb.Sp則明顯升高(P<0.05)。BMG組左側股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均明顯高于OVX組(P<0.05)，而Tb.Sp明顯低于OVX組(P<0.05)。

圖3 各組大鼠股骨干骺端Micro-CT檢測結果Fig.3 Results of Micro-CT in the femoral metaphysis of each groups of rats注：A：各組大鼠骨小梁三維重建結果；B：Tb.Th；C：Tb.Sp；D：Tb.N；E：BV/TV；F：BMD；a：Sham組，b：OVX組，c：BMG組。和Sham組比較，*P<0.05；和OVX組比較，#P<0.05。

2.4 生物力學分析

股骨三點彎曲試驗如圖 4所示，OVX組的最大載荷和彈性模量均顯著低于Sham組，兩組間差異有統計學意義(P<0.05)，BMG組的最大載荷和彈性模量較OVX組明顯升高(P<0.05)。

圖4 股骨的三點彎曲試驗結果Fig.4 Three-point bending test results of the femur of rats注：和Sham組比較，*P<0.05；和OVX組比較，#P<0.05。

3 討論

由于具有分化為多種組織的能力，因此將BMSCs視為理想的干細胞[7]。在不同環境的刺激下，骨髓間充質干細胞可以被誘導成不同的細胞類型，包括成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、肌細胞和成纖維細胞[8]。通常，BMSCs的成脂和成骨分化在正常的骨穩態下保持動態平衡。一旦打破平衡，將遭受一系列疾病的困擾，例如骨質疏松癥，這是由于成骨能力和骨質量的下降所致[9]。因此，研究成骨分化的潛在機制對預防骨丟失疾病具有重要意義。

在本研究中檢測了不同治療組大鼠BMSCs誘導分化為成骨細胞的能力，結果發現OVX組大鼠BMSCs成骨分化能顯著降低，表現為ALP和ARS染色陽性面積較Sham組明顯降低。而BMG組ALP和ARS染色陽性較OVX組明顯升高；這表明BMG治療能提高OVX大鼠BMSCs誘導分化為成骨細胞的能力。本研究還進一步測量了各組細胞中BMP-2、Runx2、OPN、OCN、ALP和Col1蛋白表達情況，這些蛋白是成骨相關的標記蛋白[10]。結果表明，這6個標志蛋白的表達均升高，表明由BMG組BMSCs的成骨分化較OVX組得到明顯促進。這些數據表明BMG與BMSCs的成骨分化密切相關。

本研究大部分集中在與雌激素流失相關的骨骼變化上。骨質疏松癥是一種代謝性疾病，其特征是骨骼質量和強度下降，導致脆性骨折[11]。尤其是骨小梁結構的破壞與骨強度降低和骨折患病率增加有關[12]。因此，本研究選擇了BMD、骨小梁結構和骨生物力學參數改變作為骨質疏松治療效果評價指標。本研究使用了一系列的研究方法來檢查骨骼對BMG治療的反應。骨密度測定數據證實，BMG在OVX大鼠模型中表現出骨保護作用。BMG治療可防治骨小梁丟失。骨小梁變化與生物力學特性的改善(包括最大載荷和彈性模量)相吻合。此類生物力學和結構方面的改進表明，BMG治療可增強骨骼質量。

在本研究中，通過BMG治療可預防由OVX引起的骨量損失。BMG治療顯著改善OVX引起的骨小梁微結構性退化，表現為BV/TV、Tb.N、Tb.Th和Tb.Sp改變。BMG對骨骼的保護作用包括促進成骨作用，增加骨小梁數量和厚度及骨小梁連接性。這些發現證實了先前在補充BMG在OVX大鼠骨骼有益作用[13]。骨骼的生物力學分析可以提供有關骨骼強度特性[14]。骨骼的機械特性是骨折風險的最重要預測指標，而骨骼的強度則取決于骨骼質量和骨骼材料的固有特性[15]。在本研究結果中，BMG治療有效增加股骨的最大載荷和彈性模量，表明BMG治療對生物力學性能有很大影響，并保持了骨強度以防止卵巢切除術的有害作用。總的來說，骨小梁微觀參數分析(Micro-CT)與骨密度和骨強度檢測結果相一致。

總之，本研究表明BMG治療可以阻止去卵巢大鼠骨密度、骨量及骨強度降低；同時可以促進去卵巢大鼠BMSCs成骨分化。但是沒有從破骨細胞角度和骨代謝方面探討BMG治療效果，后續會進一步研究這方面變化。