miR-135b靶向GSK3B抑制地塞米松誘導成骨細胞凋亡

肖建生 張鵬 趙洪洲 鐘俊青

1.天津醫科大學研究生院，天津 300070 2.天津醫院骨科，天津 361000

地塞米松(dexamethasone，Dex)是一種人工合成的糖皮質激素，具有很強的抗炎和免疫抑制作用，是治療發炎和自身免疫性疾病的常用藥物[1]，與其他糖皮質激素一樣，地塞米松對成骨細胞具有毒性作用，如低鈣飼料加上1 mg/kg地塞米松每3 d一次持續6周即足有構建骨質疏松的大鼠模型[2]。探索地塞米松誘導成骨細胞損傷的機制并制定干預策略是目前的研究重點[3]。糖原合成酶激酶3B(glycogen synthase kinase 3B，GSK3B)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與了細胞增殖、分化、存活和凋亡的調控[4]，是成骨細胞凋亡的重要調控蛋白[5]。miR-135b是一種參與了地塞米松誘導成骨細胞凋亡的小分子非編碼RNA，然而miR-135b對成骨細胞凋亡的調控是否與GSK3B有關還未見報道[6]。本研究探索miR-135b在地塞米松誘導的細胞凋亡中可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

地塞米松從美國Sigma公司購得，DMEM培養基從美國Hyclone公司購得，RIPA試劑、Trizol試劑、BCA蛋白定量試劑盒、CCK8細胞活力檢測試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒從上海碧云天生物技術有限公司購得，雙熒光素酶報告檢測試劑盒從美國Promega公司購得，反轉錄試劑盒SYBR Premix EX Taq Ⅱ從日本Takara公司購得，GSK3B一抗從英國Abcam公司購得，Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9一抗及二抗從美國Santa Cruz公司購得，β-actin抗體從美國Bosterbio公司購得，實驗所用引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 細胞實驗

MC3T3-E1細胞培養于含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素與100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基中，孵育箱溫度37 ℃，CO2體積分數為5%，每2 d更換一次完全培養基。對于CCK-8，細胞經過濃度梯度的地塞米松處理24 h，加入10 μL CCK8試劑反應4 h，酶標儀檢測450 nm吸光值。細胞分為對照組(Control)、地塞米松組(Dex)、陰性對照mimics組(mimics NC)、miR-135b組、miR-135b+pc-GSK3B組，按說明根據分組加藥和轉染，24 h后收集細胞用于后續實驗。

1.3 動物實驗

SD雄性SPF大鼠30只，體質量(200±20)g，由本院實驗動物中心提供，飼養于通風良好，恒溫恒濕的籠具中，籠具、墊料、食物和水均經過滅菌處理，大鼠適應性飼養1周，期間水和食料自由獲取。隨機數字表法隨機分為對照組(Control)、模型組(Model)、miR-135b組，每組10只。模型組臀肌注射10 mg/kg地塞米松注射液，每周1次；miR-135b組除注射地塞米松注射液以外，還通過尾靜脈注射給予miR-135b antagomir，每周一次；對照組注射等量生理鹽水，持續8周。處死大鼠取雙側股骨頭，通過X射線骨密度儀檢測股骨頭密度。對于HE染色，多聚甲醛固定后按常規方法染色和觀察。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡

使用Annexin V-FITC結合液懸浮細胞后，根據試劑盒提供的操作說明，加入Annexin V-FITC試劑和PI，使用流式細胞儀對細胞凋亡進行檢測。

1.5 RT-qPCR

使用Trizol試劑提取細胞或組織總RNA，反轉錄獲取cDNA，通過SYBR Premix EX Taq Ⅱ試劑盒PCR檢測基因表達，擴增條件按如下程序設置：95 ℃ 2 min，之后95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s 40個循環，2-ΔΔCt法進行計算基因表達水平。

1.6 蛋白印跡檢測蛋白表達

蛋白用RIPA裂解液提取，BCA液校準，10% SDS-PAGE電泳分離，半干轉法轉移至PVDF膜，并通過5%牛血清白蛋白進行封閉處理2 h，棄去液體，加入適量一抗于4 ℃孵育，次日通過TBST緩沖液浸洗膜，棄去液體后二抗孵育2 h，ECL顯色液顯影。通過凝膠成像儀對各條帶進行灰度分析。

1.7 雙熒光素酶報告基因檢測

構建GSK3B 3’-UTR pGL3 luciferase promoter野生型(WT)和突變型載體(MUT)，將載體同mimics NC或miR-135b mimics共轉染細胞，24 h后通過雙熒光素酶報告系統檢測熒光素酶活性。

1.8 統計學分析

數據采用Graphpad prism 5進行統計分析，計量資料采用均數±標準差表示，兩組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 地塞米松對MC3T3-E1細胞活力的影響

研究發現地塞米松濃度高于50 μmol/L時，MC3T3-E1細胞活力抑制明顯(P<0.05)，IC50約為500 μmol/L，因此后續實驗采用200 μmol/L作為實驗濃度。見圖1。

圖1 CCK8檢測地塞米松對成骨細胞MC3T3-E1細胞活力的抑制作用Fig.1 Viability of MC3T3-E1 cells treated with dexamethasone注：n=3，與0 μmol/L組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 地塞米松對MC3T3-E1細胞凋亡以及miR-135b和GSK3B表達的影響

與Control組比較，Dex組MC3T3-E1細胞凋亡率增加(P<0.01)，見圖2A；miR-135b表達水平降低(P<0.01)，見圖2B；GSK3B mRNA表達水平升高(P<0.01)，見圖2C。

圖2 地塞米松對MC3T3-E1細胞凋亡以及miR-135b和GSK3B表達的影響A：流式細胞術檢測細胞凋亡；B：RT-qPCR檢測miR-135b表達；C：RT-qPCR檢測GSK3B mRNA表達Fig.2 Apoptosis, and levels of miR-135b and GSK3B of MC3T3-E1 cells treated with dexamethasone. (A) Apoptosis tested with flow cytometry. RNA levels of miR-135b (B) and GSK3B (C) were tested with RT-qPCR.注：n=6，與Control組比較，**P<0.01。

2.3 miR-135b與GSK3B靶向作用關系

如圖3A所示，通過Targetscan數據庫預測miR-135b和GSK3B存在靶向作用關系。如圖3B所示，與GSK3B WT+mimics NC組比較，GSK3B WT+miR-135b組細胞中熒光素酶活性降低(P<0.01)，而GSK3B MUT+mimics NC組和GSK3B MUT+miR-135b組比較，細胞熒光素酶活性無顯著差異。

圖3 miR-135b與GSK3B靶向作用關系A：miR-135b和GSK3B靶向序列的Targetscan預測；B：熒光素酶報告實驗檢測miR-135b和GSK3B靶向作用Fig.3 Targeting of GSK3B with miR-135b. (A) The targeting relationship predicted with Targetscan. RNA levels of miR-135b (B) Targeting of GSK3B with miR-135b validated with luciferase reporter assay.注：n=6，與GSK3B WT+mimics NC組比較，**P<0.01。

2.4 miR-135b對地塞米松誘導GSK3B蛋白表達的影響

與Control組比較，Dex組MC3T3-E1細胞miR-135b表達水平降低(P<0.01)，miR-135b組miR-135b表達水平升高(P<0.01)，見圖4A；與Control組比較，Dex組GSK3B蛋白水平升高(P<0.01)，與Dex組比較， miR-135b組GSK3B蛋白水平降低(P<0.01)，與miR-135b組比較，miR-135b+pc-GSK3B組GSK3B蛋白水平升高(P<0.01)，見圖4B。

圖4 轉染miR-135b對MC3T3-E1細胞GSK3B蛋白表達的影響A：RT-qPCR檢測miR-135b轉染效率；B：蛋白印跡檢測GSK3B蛋白表達Fig.4 MC3T3-E1 cell expression of GSK3B protein when transfected with miR-135b. (A) Transfection validated with RT-qPCR. (B) GSK3B expression tested with western blotting.注：n=6，與Control組比較，**P<0.01；與Dex組比較，##P<0.01；與miR-135b組比較，&&P<0.01。

2.5 miR-135b對地塞米松誘導MC3T3-E1細胞凋亡的影響

與Control組比較，Dex組MC3T3-E1細胞凋亡率升高(P<0.01)；與Dex比較，miR-135b組MC3T3-E1細胞凋亡率降低(P<0.01)；與miR-135b組比較，miR-135b+pc-GSK3B組MC3T3-E1細胞凋亡率升高(P<0.01)。見圖5。

圖5 miR-135b對地塞米松誘導MC3T3-E1細胞凋亡的影響A：流式細胞術檢測凋亡；B：細胞凋亡率Fig.5 Apoptosis of dexamethasone (Dex) challenged MC3T3-E1 cells treated with miR-135b. (A) apoptosis tested with flow cytometry. (B) Apoptotic cell rates.注：n=6，與Control組比較，**P<0.01；與Dex組比較，##P<0.01；與miR-135b組比較，&&P<0.01。

2.6 miR-135b對地塞米松誘導MC3T3-E1細胞Bax和Bcl-2水平影響

與Control組比較，Dex組MC3T3-E1細胞Bax蛋白水平升高(P<0.01)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.01)；與Dex組比較，miR-135b組Bax蛋白水平降低(P<0.01)，Bcl-2蛋白水平升高(P<0.01)；與miR-135b組比較，miR-135b+pc-GSK3B組Bax蛋白水平升高(P<0.01)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.01)。見圖6。

圖6 蛋白印跡檢測Bax和Bcl-2蛋白表達Fig.6 Bax and Bcl-2 expression tested with Western blotting注：n=6，與Control組比較，**P<0.01；與Dex組比較，##P<0.01；與miR-135b組比較，&&P<0.01。

2.7 miR-135b對地塞米松誘導MC3T3-E1細胞cleaved caspase-3和cleaved caspase-9水平的影響

與Control組比較，Dex組MC3T3-E1細胞中cleaved caspase-3與cleaved caspase-9蛋白水平升高(P<0.01)；與Dex組比較，miR-135b組中cleaved caspase-3與cleaved caspase-9蛋白水平降低(P<0.01)；與miR-135b組比較，miR-135b+pc-GSK3B組中cleaved caspase-3與cleaved caspase-9蛋白水平升高(P<0.01)。見圖7。

圖7 蛋白印跡檢測CASP3和CASP9蛋白活化Fig.7 CASP3 and CASP9 expression tested with Western blotting注：n=6，與Control組比較，**P<0.01；與Dex組比較，##P<0.01；與miR-135b組比較，&&P<0.01。

2.8 miR-135b降低模型大鼠股骨頭組織中GSK3B蛋白表達

與Control組比較，Model組大鼠股骨頭組織中miR-135b表達水平降低(P<0.01)，同時GSK3B蛋白水平升高(P<0.01)；與Model組比較，miR-135b組大鼠股骨頭組織中miR-135b表達水平升高(P<0.01)，同時GSK3B蛋白水平降低(P<0.01)。見圖8。

圖8 轉染miR-135b對股骨頭組織GSK3B表達的影響Fig.8 Expression of GSK3B in the femoral head transfected with miR-135b注：n=10，與Control組比較，**P<0.01；與Model組比較，##P<0.01。

2.9 miR-135b恢復模型大鼠股骨頭骨密度

與Control組比較，Model組大鼠股骨頭骨密度降低(P<0.01)，經過miR-135b作用后，與Model組比較，miR-135b組大鼠股骨頭骨密度升高(P<0.01)。見圖9。

圖9 miR-135b對股骨頭骨密度的影響Fig.9 Effect of miR-135b on bone mineral density of the femoral head注：n=10，與Control組比較，**P<0.01；與Model組比較，##P<0.01。

2.10 miR-135b減輕股骨頭組織病變

對照組大鼠骨小梁結構完好；模型組可觀察到骨小梁纖細，排列紊亂，空骨陷窩增多，骨細胞萎縮，并出現脂肪滴和嗜酸性粒細胞的聚集；miR-135b組雖然也出現了上述病變，但程度明顯減輕。見圖10。

圖10 miR-135b對股骨頭組織病變的影響(×200)Fig.10 Effect of miR-135b on pathological changes of the femoral head (200×).

3 討論

糖皮質激素常被用于炎癥或自身免疫疾病的治療中[7-8]。過量的糖皮質激素常常會抑制成骨細胞增殖，誘導其凋亡，并最終導致非創傷性骨壞死[9]。地塞米松誘導成骨細胞凋亡的能力與GSK3B有關[5,10]。Fan等[6]研究表明，miR-135b具有保護成骨細胞免受地塞米松誘導損傷的功能，盡管Xiao等[11]在膠質細胞瘤的研究中發現miR-135b與GSK3B可能存在靶向作用關系，然而miR-135b對成骨細胞的保護作用是否與靶向作用于GSK3B還未見報道。本研發現經過地塞米松處理后，MC3T3-E1細胞凋亡水平增加，與此同時細胞中miR-135b表達水平下調而GSK3B表達水平上調，這一結果表明地塞米松誘導成骨細胞凋亡與miR-135b和GSK3B的表達可能存在聯系。進一步通過熒光素酶報告實驗，驗證miR-135b可靶向作用于GSK3B。

GSK3B激活與成骨細胞的凋亡有著緊密聯系，糖皮質激素可通過激活GSK3B誘導成骨細胞凋亡，siRNA敲低GSK3B表達可降低Bax和caspase-3表達并增加Bcl-2表達[12]，這類過程最終抑制細胞凋亡[13-14]。為了進一步探究miR-135b和GSK3B對地塞米松誘導成骨細胞凋亡的調控作用及其相關機制，本研究通過轉染miR-135b mimics和GSK3B過表達載體對地塞米松誘導的MC3T3-E1進行干預，發現miR-135b水平升高可減少細胞凋亡率，同時抑制GSK3B、Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白水平，并升高Bcl-2蛋白水平，而GSK3B過表達可扭轉miR-135b水平升高引起的上述變化。

綜上，本研究證實了miR-135b可通過靶向抑制GSK3B，抑制地塞米松誘導的成骨細胞凋亡。