淫羊藿苷介導MAPK信號通路防治骨質疏松的研究進展

王敬博 陳躍平 章曉云 廖建釗

1.廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530001 2.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院創傷骨科與手外科，廣西 南寧 530011

傳統醫學認為OP屬于骨痿的范疇，《素問》中提出：“腎主骨，腎精充足則骨堅，若腎氣不足則骨痿。”故認為腎氣虛是OP發生的主要原因。當前中醫藥治療OP常以淫羊藿等補腎藥物為主[1]。淫羊藿為毛莨目小蘗科多年生草本植物，又名仙靈脾、鐵打杵，《本草綱目》稱：“其可益精氣，強筋骨，利小便”，在臨床上主要治療陽痿遺精、筋骨痿軟、筋脈拘攣等癥。現代研究發現[2]，淫羊藿的主要藥效成分淫羊藿苷(Icariin，ICA)具有促進骨形成、改善骨代謝平衡、增加骨密度等作用，其中成骨細胞(osteoblast，OB)與破骨細胞(osteoclast，OC)是參與骨形成和骨代謝的關鍵，維持OB和OC的相對穩定可確保骨的完整性和功能。研究表明[3]，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)在骨細胞的形成、發育和凋亡過程中起著非常重要的作用，通常MAPK通路在ICA的激活作用下促進OB增殖、抑制OC分化及促進骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchyml stem cells，BMSCs)成骨分化，進而發揮抗OP的作用，見圖1。因此，本文就ICA介導MAPK信號通路防治OP的作用機制作一綜述。

圖1 ICA介導MAPK信號通路治療骨質疏松作用機制Fig.1 Mechanism of ICA mediated MAPK signaling pathway in the treatment of osteoporosis

1 MAPK通路

MAPK是信號由細胞外到細胞內的傳遞者，是一種具有磷酸化功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其活化受生長因子、氧化、激素等多種胞內和胞外信號刺激[4]。其中細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、p38和c-Jun 氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase，JNK)3種激酶是MAPK的主要組成部分[5]，在將細胞外刺激轉化為多種細胞反應的過程中起著關鍵作用[6]，其中JNK和p38 MAPK表達的變化在細胞受到各種物理、化學和生物應激刺激后最為顯著，而ERK1/2信號主要激活細胞生長因子的表達，并在骨細胞的形成過程中有著至關重要的地位。

2 MAPK與骨細胞

目前維持骨代謝平衡是治療OP的主要方法之一，其中維持OB骨形成和OC骨吸收水平穩定是確保骨代謝平衡的關鍵。在OP發生發展過程中，由于機體氧化應激水平不斷升高，OB出現異常凋亡的現象，導致機體內骨穩態平衡被打破，然而機體內OC的活性增高，骨吸收功能亢進，也可打破骨形成與骨吸收之間的動態平衡。因此，降低機體氧化應激水平，維持OB的骨形成穩定，降低OC活性，抑制其骨吸收功能，可有效發揮抗OP作用[7-8]。另外，BMSCs也與人類的骨骼代謝密切相關，在轉錄因子和細胞因子的共同刺激下，可以促進BMSCs成骨分化，從而促進骨形成[9]。近年來發現，MAPK通路通過調控相關轉錄因子和基因的表達，促進OB和OC增殖、分化，促進BMSCs成骨分化以及調節BMSCs成脂分化，在骨形成和骨吸收中發揮著重要作用。具體機制研究如下。

2.1 MAPK與成骨細胞

MAPK通路中的ERK1/2、p38 MAPK和JNK在成骨基因表達過程中起著非常關鍵的作用，激活MAPK通路，可有效提高OB的活性并促進骨基質的分泌與鈣化，利于機體骨形成。其中纖維細胞生長因子激活ERK1/2通路可顯著促進OB增殖，而抑制ERK1/2信號通路的活化可降低Bax和Bel-2的表達，從而抑制Caspase-3的活化，遏制細胞凋亡。當p38 MAPK通路被激活后，OB中堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的表達顯著提升，從而誘導OB分化。JNK通路的激活也是OB分化的關鍵，當前列腺素E2、脂聯素等激活JNK通路后，可顯著促進OB增殖，因此激活MAPK信號通路是促進OB增殖、分化方式之一。Pratsinis等[10]指出hBMSCs向OB增殖、分化主要受ERK的激活，其中血小板衍生生長因子等骨活性劑均通過激活ERK信號通路促進OB增殖、分化。Greenblatt等[11]研究發現p38 MAPK通路是小鼠正常骨骼形成的必要條件，敲除MAPK通路成員編碼基因Mkk3、Mkk6、p38a或p38b的小鼠則會出嚴重的骨量減少，通常表現為OB的分化缺陷，而在MAP3K家族中，p38上游的關鍵激活因子TGF-β活化激酶1往往也能促進OB的表達。Yang等[12]研究發現在OB分化過程中，由于JNK/MAPK磷酸化水平不斷提高，阻斷了成脂細胞轉錄因子表達，刺激了OB轉錄因子的表達，導致OB含量明顯增多，利于機體骨形成。綜上所述，OB的成骨基因表達與MAPK通路的激活作用密切相關，當MAPK通路激活后可促進OB增殖、分化(圖2)。此外，OB是參與骨形成的關鍵，更深層次了解MAPK信號通路對OB的影響有助于更好地研究OP。

圖2 MAPK信號通路與成骨細胞作用機制Fig.2 MAPK signaling pathway and the mechanism of osteoblasts

2.2 MAPK與破骨細胞

MAPK通路是OC形成的主要參與者，在OC分化過程中起主導作用。當ERK1/2通路受到激活作用后，可通過刺激c-Fos、c-Myc等下游轉錄因子調節OC分化。MKK3/MKK6磷酸化水平提高可激活p38 MAPK通路，并通過NFATc1促進OC分化。而JNK通路的活化常由細胞核因子-κB受體活化因子配體(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)與TRAF2和TRAF5相結合而引起，并可激活c-Jun/Fos活化蛋白1的表達，從而提高OC活性，促進OC增殖、分化。因此，尋找激活MAPK通路以刺激相關基因表達是促進OC增殖、分化的關鍵。研究表明[13]成熟OC存活周期受ERK通路調控，其中c-Fos基因蛋白的穩定表達可誘導骨髓巨噬細胞經過巨噬細胞刺激集落因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)促進NFATc1表達，并協同c-FMS在M-CSF刺激下通過ERK1/2和c-Fos信號通路介導OC分化。Tian等[14]認為酪氨酸磷酸化蛋白激酶p38 MAPK被激活后，可促進NFATc的表達，從而促進OC前體細胞分化為成熟OC。Huang等[15]研究發現唑來膦酸(zoledronic acid，ZOL)可降低RANKL誘導的JNK磷酸化，使OC的活性大大降低，從而抑制OC形成。這些結果提示，MAPK通路在激活作用下，OC的活性顯著提高，從而促進OC分化，增強骨吸收功能(圖3)。然而OP的發生與OC分化、骨吸收功能亢進有關，通常使用相關抑制劑，在MAPK信號通路的介導下抑制OC分化，降低其骨吸收功能，起到治療OP的作用。

圖3 MAPK信號通路與破骨細胞作用機制Fig.3 MAPK signaling pathway and the mechanism of osteoclasts

2.3 MAPK與骨髓間充質干細胞

BMSCs成骨受到激素、生長因子、培養環境等多種因素的影響，是骨再生的關鍵[16]。其中MAPK信號在BMSCs成骨及成脂分化中發揮關鍵作用，并以提高ERK和p38 MAPK的磷酸化水平來促進BMSCs成骨分化以及調節BMSCs成脂分化。梁軍等[17]在探究復方接骨中藥介導p38 MAPK信號通路對BMSCs成骨分化的影響中發現，中藥通過提高p38蛋白磷酸化水平，上調MAPK通路的表達，從而促進 BMSCs成骨分化。朱波等[18]通過研究p38 MAPK磷酸化水平在15Hz 1 mT的電磁場下的變化，在應用ERK和p38 MAPK阻斷劑之后，發現細胞內ERK和p38 MAPK磷酸化水平顯著升高，BMSCs的ALP活性增強，證明通過活化ERK和p38 MAPK信號通路可以促進BMSCs的成骨分化。Jiang等[19]研究發現BMSCs中p-p38和p-JNK蛋白水平在骨誘導劑的刺激下顯著提高，這提示p38和JNK通路活化對成骨分化具有積極作用。此外，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)與p38 MAPK信號通路密切相關，其中lncRNA DANCR通過激活p38 MAPK通路可誘導BMSCs向OB分化。而p38 MAPK和ERK信號通路也參與調節脂肪細胞的形成，劉革修等[20]實驗得出促紅細胞生成素能夠提高ERK42、ERK44、p38 MAPK磷酸化水平，降低過氧化物酶增殖體激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptor gamma，PPARγ)的表達，從而遏制BMSCs成脂分化。也有研究表明ERKl/2通路的活化能夠促進成脂細胞分化，在BMSCs成脂細胞分化的早期，ERKl/2通過提高C/EBPα和PPARγ的磷酸化水平，以促進脂肪細胞分化[21]。綜上所述，p38 MAPK和ERK通路不僅可以促進BMSCs成骨分化，還在BMSCs成脂分化中起到促進或抑制的作用(圖4)。

圖4 MAPK信號通路與骨髓間充質干細胞作用機制Fig.4 The mechanism of MAPK signaling pathway and bone marrow mesenchymal stem cells

3 淫羊藿苷與骨質疏松

3.1 淫羊藿苷介導MAPK通路促進成骨細胞增殖、分化

MAPK信號通路的激活是OB增殖、分化的主要促進因子，在骨形成中發揮著關鍵作用。因此尋找激活MAPK信號通路以促進OB增殖、分化的方法成為治療OP的主要方法之一。當前研究發現淫羊藿的主要藥效成分ICA能夠激活MAPK信號通路以促進OB增殖、分化，從而促進骨形成，抑制OP的發生、發展。劉尚全等[22]發現糖皮質激素對OB的活性具有抑制作用，而ICA能夠通過MAPK/ERK信號通路改變糖皮質激素對OB的抑制作用，通常情況下，由于受到ICA的刺激，p38 MAPK/ERK磷酸化水平提高，從而促進OB增殖、分化，促進骨形成。為了證實這一結論，龔一昕等[23]在實驗中應用ICA Ⅱ來刺激p38 MAPK信號，發現p-p38 MAPK磷酸化水平與ALP活性明顯提高，從而推測ICA Ⅱ能夠激活MAPK通路的表達，刺激OB分化達到治療OP的目的。因此，通過以上研究得出ICA介導MAPK信號通路可以促進OB增殖、分化，顯著提高骨含量和骨密度。由此得出，以OB為靶點是治療OP的主要方法之一，其具體作用機制仍需進一步研究。

3.2 淫羊藿苷介導MAPK通路抑制破骨細胞分化

淫羊藿的主要藥效成分ICA是類黃酮化合物的一種[24]，它通過多種通路促進OB增殖，遏制OC分化，從而減少骨質流失，提高機體的骨含量與骨密度。其中MAPK通路是OC生成的主要參與者，在OC分化過程中通過c-Fos和NFAT等MAPK下游調控因子激活OC活性而產生。因此，當MAPK通路與類黃酮化合物相結合時，通過調控c-fos等基因表達，能夠抑制OC分化，從而降低骨吸收作用。王想福等[25]應用體外培養OC的方法，探究類黃酮通過p38 MAPK/c-Fos信號通路對OC分化的影響，結果發現類黃酮能夠抑制OC分化，并可下調p38 MAPK通路中c-Fos蛋白水平表達，從而遏制OC的骨吸收作用。Ohyama等[26]發現類黃酮化合物能抑制OC前體細胞向OC分化，從而阻斷脂多糖誘導的骨性破壞。此外，ERK和JNK通路是OC分化的關鍵，而Sudachitin可阻斷骨細胞內ERK和JNK通路的激活，發揮抑制OC分化的作用。因此，通過實驗得出類黃酮可降低MAPK信號通路的活性來抑制OC分化，降低骨吸收功能，達到治療OP的目的。而ICA是類黃酮化合物的一種，因此ICA抗OP的作用可能是經由MAPK通路介導的。

3.3 淫羊藿苷介導MAPK通路促進BMSCs成骨分化

目前研究發現BMSCs具有多方位分化功能，通常被廣泛應用于組織工程中，但是BMSCs的遷移能力較差，限制了對骨細胞的修復效果，當ICA激活MAPK通路后可恢復BMSCs修復功能。同時，通過上調ELK1和c-Myc等MAPK下游轉錄因子，可促進BMSCs成骨分化，從而提高鈣沉積面積，發揮抗OP的作用[27]。Qin等[28]通過實驗證明ERK或p38 MAPK的特異性抑制劑能夠阻斷ICA誘導的蛋白激活，并顯著降低BMSCs成骨分化，證實了ICA介導ERK和p38 MAPK促進BMSCs成骨分化的作用。由此可知，ICA通過MAPK通路能夠促進BMSCs成骨分化，從而提高鈣沉積面積，達到預防OP的目的。但筆者認為目前仍缺乏相關機制的實驗研究，需進一步實驗驗證。

4 總結與展望

隨著我國老齡化程度日益加重，骨質疏松癥的患病人數呈現逐年上升趨勢，這給個人、家庭和社會帶來了嚴重的經濟負擔，為此深入研究OP的發生機制與抗OP的藥物變得尤為重要。目前補腎中藥淫羊藿在治療OP方面取得了良好的臨床效果，其主要藥效成分ICA介導MAPK信號通路防治OP的有效作用機制也通過上述實驗研究得到證實。因此，本綜述將ICA與MAPK信號通路相結合，通過刺激MAPK通路來促進OB增殖分化，提高骨的鈣化率；通過抑制OC分化，降低骨吸收；通過促進BMSCs成骨分化，加快鈣鹽沉積，從而達到防治OP的效果。然而BMSCs成脂分化增多也可誘導OP的發生，目前有研究表明ICA可通過Wnt信號通路促進BMSCs成骨分化、抑制成脂分化，進而發揮抗OP的作用。筆者研究發現ICA介導MAPK信號通路能夠促進BMSCs成骨分化，而ICA能否介導MAPK信號通路抑制BMSCs成脂分化有待進一步研究。除此之外，ICA激活cAMP-PKA、NF-κB、Wnt等信號通路也可在OB、OC、BMSCs的增殖、分化以及凋亡過程中產生相應的影響，但其相關分子機制的研究還需加強完善。綜上所述，盡管當前國內外仍缺乏ICA治療OP的大量動物或臨床樣本的實驗研究，但隨著對ICA治療OP機制研究的不斷深入，ICA有望成為臨床上防治OP疾病的關鍵藥物。