HPLC法與化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法測(cè)定癲癇患者血漿中卡馬西平濃度的一致性評(píng)價(jià)

白建海　牟紅云　鄭丹　龐苗菜　丁曉敏　張敏麗　王時(shí)力　王毅超

[關(guān)鍵詞] 高效液相色譜法; 化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法;卡馬西平;血藥濃度;一致性

[中圖分類號(hào)] R969.4? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2021）18-0109-05

Consistency evaluation of HPLC and chemiluminescence microparticle immunoassay in determination of plasma carbamazepine concentration in patients with epilepsy

BAI Jianhai1? MOU Hongyun1? ZHENG Dan1? PANG Miaocai1? DING Xiaomin2? ZHANG Minli2? WANG Shili1

WANG Yichao3

1.Department of Ophthalmology， Taizhou Central Hospital （Taizhou University Hospital） in Zhejiang Province， Taizhou 318000， China; 2.Operating room， Taizhou Central Hospital （Taizhou University Hospital） in Zhejiang Province， Taizhou 318000， China; 3.Department of Laboratory Medicine and Precision Laboratory， Taizhou Central Hospital （Taizhou University Hospital） in Zhejiang Province， Taizhou? ?318000， China

[Abstract] Objective To evaluate the consistency of the two methods （high performance liquid chromatography （HPLC method） and chemiluminescence microparticle immunoassay （CMIA method）） in the determination of plasma carbamazepine concentration in patients. Methods The Bland-Altman method and Passing-Bablok regression method were used to analyze the measured values of the two detection methods， and the consistency of the two methods was further analyzed. Results The Bland-Altman analysis showed that the two methods （HPLC method and CMIC method） had good consistency in the determination of plasma carbamazepine concentration in patients. The regression equation of the two methods was Y=0.9912X-0.1083（R2=0.970， n=117）， indicating a good correlation between the two methods. Conclusion The two methods （HPLC method and CMIA method） have good correlation and consistency in the determination of plasma carbamazepine concentration in patients. The two methods can substitute each other.

[Key words] High performance liquid chromatography; Chemiluminescence microparticle immunoassay; Carbamazepine; Plasma concentration; Consistency

卡馬西平通常用于治療癲癇或眼科神經(jīng)病理性疼痛，也被用于雙相情感障礙的二線治療藥物，特別是在治療全身強(qiáng)直痙攣性癲癇和混合型癲癇、視神經(jīng)痛、青光眼、躁狂等疾病療效明顯。同時(shí)，卡馬西平通過誘導(dǎo)藥物代謝酶可以影響藥物與藥物之間的臨床藥效相互作用。卡馬西平的大多數(shù)口服制劑都能夠很好的吸收，具有較高的生物利用度。但是其治療范圍較窄[癲癇：4～12 μg/mL;情感障礙（青光眼）：4～10 μg/mL]，在給藥劑量間隔期間血漿藥物濃度波動(dòng)明顯，藥物代謝動(dòng)力學(xué)個(gè)體差異大，且與情志因素相關(guān)疾病（癲癇、青光眼）副作用及病情變化密切相關(guān)，且毒副反應(yīng)不易于癥狀加重區(qū)分[1-2]，因此臨床使用過程中，須對(duì)其血藥濃度進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

測(cè)定卡馬西平血漿濃度的檢測(cè)方法較多，精密度及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參差不齊。高效液相色譜（High-performance liquid chromatographic，HPLC）[3-5]，熒光偏振免疫分析方法（Fluorescence polarization immunoassay，F(xiàn)PIA）[6-7]，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（Liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[8-10]等方法，其中有報(bào)道HPLC法不僅可以測(cè)定卡馬西平濃度，還可以用于評(píng)價(jià)其生產(chǎn)品的質(zhì)量，也可以用于檢測(cè)其穩(wěn)定性[3-5]。化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法（Chemiluminescence microparticle immune assay，CMIA）檢測(cè)技術(shù)以自動(dòng)、定量、隨機(jī)加載和寬線性范圍檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，逐步取代人工定性檢測(cè)方法[11-12]。上述各種檢測(cè)手段在技術(shù)原理，操作程序，性能參數(shù)，客觀評(píng)價(jià)等方面都有很大的區(qū)別。本研究選取發(fā)病較為常見的癲癇患者作為研究對(duì)象，通過對(duì)比分析CMIA法和HPLC法測(cè)定患者血漿中卡馬西平濃度，通過運(yùn)用Bland-Altman plot評(píng)價(jià)兩者相關(guān)性及一致性，為神經(jīng)科及眼科藥物應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

高效液相色譜（waters 600，美國），全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（ARCHITECT i2000SR，美國ABBOTT公司），超純水通過微孔凈水裝置（Bedford，美國）生成（電阻率大于18.2 MΩ×CM），化學(xué)品和實(shí)驗(yàn)試劑（Highest grades，sigma，美國），卡馬西平標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品（中國藥品檢驗(yàn)總所，批號(hào)：100142-201004），甲醇（Waltham，美國）為色譜純。

1.2 樣本收集

項(xiàng)目經(jīng)過臺(tái)州市中心醫(yī)院（臺(tái)州學(xué)院附屬醫(yī)院）醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2021L-03-06），收集2019年2月至2021年3月臺(tái)州市中心醫(yī)院（臺(tái)州學(xué)院附屬醫(yī)院）服用卡馬西平的117例癲癇患者（10～69歲）藥物濃度血樣（服藥前取空腹全血）3 mL，高速離心機(jī)（D-37520，美國ABBOTT公司）離心血樣5 min（1 min，6000 r/min）分離出血漿并取樣，標(biāo)本血漿分成2份，其中一份采用CMIA法檢測(cè)（當(dāng)天）;另外一份冰箱封存（-40℃），待采樣完畢后進(jìn)行HPLC檢測(cè)。

1.3 RP-HPLC法測(cè)定血漿中卡馬西平藥物濃度

1.3.1 樣品的處理? 用甲醇將精密稱定卡馬西平標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品（100142-201004）配成儲(chǔ)備液（520 μg/mL）備用，按照梯度濃度將標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液稀釋成為520、390、260、130、65、32.5、16.25 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品液。移液槍（Eppendorf公司）精密取甲醇標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液25 μL，精密加入空白血漿（450 μL）并用漩渦混合器（Votex Genius 3，德國IKA公司）漩渦混勻得對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品血漿系列樣品。上述同種方法配制質(zhì)量濃度（400.0 μg/mL）質(zhì)量控制儲(chǔ)備液（Quality control stock solution，QC），分別置于4℃條件下冷藏。取上述血漿系列標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品樣品100 μL，加入甲醇（300 μL），漩渦混合器（Votex Genius 3，德國 IKA公司）漩渦混勻120 s，高速離心機(jī)（D-37520，美國 ABBOTT 公司）離心5 min（15000 r/min，4℃），取上清液進(jìn)樣分析。

1.3.2 色譜條件? 色譜柱條件（4.6 mm×250 mm，5 μm，35℃）;流動(dòng)相條件：甲醇和水的混合物（50∶48 v/v），檢測(cè)波長為285 nm，流速：1.0 mL/min。

1.3.3 專屬性考察? 按照（1.3.1）方法分別制備血漿（空白），血漿（空白+標(biāo)準(zhǔn)品），患者血漿（服用卡馬西平）并進(jìn)樣，繪制色譜圖。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制? 制備系列標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，按上述方法處理分析。

1.3.5 回收率試驗(yàn)

1.3.5.1? 提取回收率? 用血漿（空白）和卡馬西平QC儲(chǔ)備液制成濃度分別為2.5、10.0、20.0 μg/mL的樣品各5份，按上述方法處理分析，卡馬西平平均峰面積為A1;另取空白血漿加3倍量甲醇，渦旋120 s，離心5 min（15 000 r/min，4℃），取上清液，與卡馬西平QC儲(chǔ)備液制成同濃度的樣品各5份，同法處理分析，卡馬西平平均峰面積為A2，按A1/ A2×100%計(jì)算提取回收率。

1.3.5.2 方法回收率? 用血漿（空白）和卡馬西平標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液精密配制成體積濃度分別為2.5、10.0、20.0 μg/mL的樣品各5份，同法操作后，進(jìn)樣分析，將所得的峰面積相應(yīng)的回歸方程計(jì)算濃度值，計(jì)算方法是測(cè)得值和實(shí)際值的比值。

1.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)? 用血漿（空白）和卡馬西平標(biāo)準(zhǔn)品溶液精密配制成體積濃度為2.5、10.0、20.0μg/mL的樣品，按上述方法處理。室溫穩(wěn)定性：溫度為25℃條件下放置樣品4 h后，按上述方法處理分析。凍融穩(wěn)定性：溫度為-40℃條件下放置樣品24 h，取出靜待樣品完全融化，反復(fù)3次（3 d），按上述方法處理計(jì)算。長期穩(wěn)定性：溫度-40℃條件下樣品于靜置7、14、21、28、35 d后，同法處理，計(jì)算。

1.3.7 精密度試驗(yàn)? 批內(nèi)精密度：用血漿（空白）與卡馬西平標(biāo)準(zhǔn)品溶液精密配制成體積濃度為2.5、10.0、20.0 μg/mL的同一批樣品各5份，按上述方法進(jìn)樣并計(jì)算。批間精密度：同法配制濃度分別為2.5、10.0、20.0 μg/mL的樣品，按上述方法測(cè)定處理不同批的樣品，連續(xù)測(cè)定5批，同法計(jì)算。

1.3.8 質(zhì)量控制? 待測(cè)血漿的樣品與按照上述方法處理所得高、中、低3種濃度空白血漿和卡馬西平QC儲(chǔ)備液配制成的樣品平行測(cè)定。

1.3.9 患者血漿測(cè)定? 按照上述方法分析待測(cè)血漿，按照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算患者樣品中卡馬西平含量。

1.4 CMIA法

1.4.1 CMAI法原理? 詳細(xì)內(nèi)容見ARCHITECT 卡馬西平測(cè)定試劑盒說明書[13]。為了控制分析質(zhì)量，校準(zhǔn)器和質(zhì)量控制樣品通常按照制造商的要求進(jìn)行。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備? 卡馬西平標(biāo)準(zhǔn)曲線制備按照Abbott ARCHITECT i2000SR系統(tǒng)操作手冊(cè)應(yīng)用原裝的標(biāo)準(zhǔn)定標(biāo)液進(jìn)行。自動(dòng)擬出標(biāo)準(zhǔn)曲線，系列校準(zhǔn)樣品濃度分別為2.0、4.0、8.0、12.0、24 μg/mL。

1.4.3 性能指標(biāo)的評(píng)估? 按照Abbott ARCHITECT i2000SR系統(tǒng)操作手冊(cè)進(jìn)行精密度、回收率、線性、專屬性等指標(biāo)驗(yàn)證。

1.4.4 CMIA法測(cè)定患者血漿中卡馬西平濃度? 按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范流程檢測(cè)血漿，定時(shí)平行測(cè)定質(zhì)控樣品。

1.5 兩種檢測(cè)方法比較

1.5.1 方法? 通過Passing-Bablok回歸和Pearson檢驗(yàn)，對(duì)CMIA法（檢測(cè)系統(tǒng)）和HPLC法（待評(píng)價(jià)系統(tǒng)）回歸方程和相關(guān)系數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)，應(yīng)用Bland-Altman偏差圖評(píng)價(jià)CMIA和HPLC一致性。兩種測(cè)量平均值根據(jù)數(shù)據(jù)分布采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)或者Wilcoxon檢驗(yàn)。

1.5.2 相關(guān)性分析? 按照Passing-Bablok回歸方法對(duì)上述測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.5.3? 一致性分析? 按照Bland-Altman方法對(duì)上述兩種方法的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行一致性分析。

1.6? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

前提條件是比較的檢測(cè)系統(tǒng)（CMIA法）和待評(píng)價(jià)系統(tǒng)（HPLC法）可重復(fù)性優(yōu)，測(cè)定結(jié)果相關(guān)性分析采用Passing-Bablok回歸法進(jìn)行分析;測(cè)定結(jié)果的一致性采用Bland-Altman偏差圖進(jìn)行分析;測(cè)定結(jié)果（CMIA法和HPLC法）進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，以檢驗(yàn)系統(tǒng)誤差，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理軟件為Med Calc醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件（第15.8版，比利時(shí)）。卡馬西平濃度以（x±s）表示。

2 結(jié)果

2.1 HPLC法測(cè)定血漿中卡馬西平藥物濃度

2.1.1 專屬性考察? 圖1示峰形及分離度良好，卡馬西平定量分析不被內(nèi)源性雜質(zhì)所干擾。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制? 峰面積和峰濃度線性關(guān)系良好，線性范圍0.8125～26.0 μg/mL（R2=0.9997，n=6），峰面積（Y）對(duì)濃度（X）回歸方程為Y=1.53×104X+4.9×103。

2.1.3 回收率考察

2.1.3.1? 提取回收率? 低、中、高三濃度的提取回收率分別為（100.86±8.69）%（RSD 8.61%）、（104.56±9.99）%（RSD 9.56%）、（97.93±3.46）%（RSD 3.54%），符合樣品分析的要求。

2.1.3.2方法回收率 低、中、高3濃度的方法回收率分別為（90.57±9.00）%（RSD 9.94%）、（84.30±5.21）%（RSD 6.19%）、（98.83±4.77）%（RSD 4.82%），符合樣品分析的要求。

2.1.4穩(wěn)定性及精密度考察? 結(jié)果表明，卡馬西平樣品穩(wěn)定性較好，精密度符合樣品分析的要求。

2.1.5 質(zhì)量控制? 結(jié)果表明，低濃度偏差均<20%，中、高濃度偏差<15%，因此樣品測(cè)定結(jié)果有效。

2.1.6? 患者血漿測(cè)定? HPLC法測(cè)定癲癇患者血漿中卡馬西平的平均濃度為（7.7±3.2）μg/mL。

2.2? CMIA法測(cè)定血漿中卡馬西平濃度

2.2.1 性能指標(biāo)的評(píng)估? 精密度、回收率、線性、專屬性等指標(biāo)均符合操作手冊(cè)要求。

2.2.2 患者血樣測(cè)定? CMAI法測(cè)定的癲癇患者血漿中卡馬西平的平均濃度為（8.0±3.1）μg/mL。

2.3? 兩種檢測(cè)方法比較

2.3.1 相關(guān)性分析? 對(duì)上述兩種測(cè)定方法測(cè)定的癲癇患者血漿中卡馬西平濃度結(jié)果按照Passing-Bablok回歸方法進(jìn)行分析（圖2），典型線性回歸方程得Y=0.9912X-0.1083（X，CMAI法測(cè)定的癲癇患者血漿中卡馬西平的濃度結(jié)果;Y，HPLC法測(cè)定癲癇患者血漿中卡馬西平的濃度結(jié)果;R2=0.970;n=117），方程的斜率為0.9912（95%CI：0.9548～1.0314，P<0.0001），截距為-0.1083（95%CI：-0.3975～0.1623，P=0.0003），線性有效性（Cusum）檢驗(yàn)可知無顯著性線性偏差（P=0.37）。結(jié)果示CMAI法測(cè)定癲癇患者血漿中卡馬西平的濃度結(jié)果和HPLC法測(cè)定癲癇患者血漿中卡馬西平的濃度結(jié)果存在線性相關(guān)性（R2>0.95），檢測(cè)方法可以相互替代。同時(shí)結(jié)果顯示回歸率和矩陣結(jié)果符合統(tǒng)計(jì)要求[14]。

2.3.2 兩種測(cè)定方法測(cè)定結(jié)果的一致性分析? 上述兩種測(cè)定癲癇患者血漿中卡馬西平濃度結(jié)果進(jìn)行Bland-Altman分析，圖3示對(duì)數(shù)變換測(cè)量的平均偏差和95%的一致性極限（95%LOA）分別為0.19和0.18～0.45，HPLC法為0.17，CMIA法為0.18～0.35。為得到一個(gè)可以接受的結(jié)果，進(jìn)行反向變換，以獲得這兩個(gè)測(cè)量值的比值。圖3示4.3%（5/117）的點(diǎn)在95%LOA以外，符合要求;在95%LOA以內(nèi)，HPLC法測(cè)定癲癇患者血漿中卡馬西平的濃度結(jié)果與CMAI法測(cè)定癲癇患者血漿中卡馬西平的濃度結(jié)果比較，絕對(duì)值（差值百分比）的最大值為14.5%（1.05 μg/mL）。因此上述兩種方法可以互換。

2.3.3 系統(tǒng)誤差分析[14]? 上述結(jié)果顯示，HPLC法和CMIA法測(cè)定血漿中卡馬西平濃度時(shí)可以互換，但還需考察他們之間測(cè)定卡馬西平時(shí)是否存在系統(tǒng)誤差。運(yùn)用回歸方程法進(jìn)行分析，其中因變量設(shè)為兩種檢測(cè)手段得出的每個(gè)樣本的每次測(cè)定值;自變量設(shè)為兩種檢測(cè)手段得出的每個(gè)樣本的平均值;公式為Y=0.1429X-0.0029（R2=0.053，n=117，P>0.05），其斜率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不存在比例誤差，說明不存在比例誤差。對(duì)HPLC法和CMIA法兩種方法測(cè)定的血漿中卡馬西平濃度結(jié)果進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果P=0.0044，提示兩種檢測(cè)方法存在固定誤差（P<0.05）。

3 討論

本研究建立了HPLC法測(cè)定癲癇患者血漿中卡馬西平的濃度，并收集臨床應(yīng)用卡馬西平治療的癲癇患者血液樣本（n=117），采用HPLC法及CMIA法測(cè)定血漿樣本中卡馬西平濃度，同時(shí)兩種方法均考察精密度、準(zhǔn)確度、線性及范圍等等方法學(xué)效能指標(biāo)，結(jié)果顯示兩種方法均符合重復(fù)性、準(zhǔn)確性等測(cè)定要求。

參考文獻(xiàn)運(yùn)用Passing-Bablok Regression對(duì)兩種測(cè)定結(jié)果的相關(guān)性進(jìn)行分析[7，15-16]，并進(jìn)行相應(yīng)差異的比較。結(jié)果表明HPLC法測(cè)定癲癇患者卡馬西平血漿藥物濃度和CMIA法測(cè)定癲癇患者卡馬西平血漿藥物濃度兩種方法相關(guān)性較好，具有可比性（圖2）。

Bland-Altman Plot是評(píng)價(jià)比較兩種臨床定量測(cè)量方法的金標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用近30年歷史[17-18]。本項(xiàng)研究中兩種測(cè)量方法一致性密切線性相關(guān)，如果以圖形作為參考，則獲得95%LOA將比小值所需的間距更寬，比兩者間距更窄的實(shí)為大值[15]。因此，在做Bland-Altman Plot分析前，兩種方法測(cè)量值均應(yīng)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，從而消除差值和波動(dòng)之間的關(guān)系，得到合適的95%LOA。經(jīng)過對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換以后，結(jié)果還需要再進(jìn)行反向轉(zhuǎn)換才比較容易理解。另外，本研究以圖形作為參考在分析結(jié)果時(shí)可以兼顧考慮系統(tǒng)誤差和比例誤差，使分析結(jié)果更加客觀和精確。

系統(tǒng)誤差分析可以使上述HPLC法測(cè)定癲癇患者卡馬西平血漿藥物濃度和CMIA法測(cè)定癲癇患者卡馬西平血漿藥物濃度對(duì)結(jié)果的一致性誤差減小[19-20]，所以實(shí)際操作過程中本項(xiàng)目以兩系統(tǒng)實(shí)測(cè)值之差為因變量，以兩系統(tǒng)實(shí)測(cè)值之平均值為自變量再次進(jìn)行回歸分析。如果分析結(jié)果存在比例誤差，則回歸分析圖示中有一條斜率不為零的趨勢(shì)線，那么固定誤差是回歸方程y=ax+b中的截距（b），比率誤差是回歸方程y=ax+b中的斜率（a）。如果回歸分析圖示中趨勢(shì)線為零，則兩種方法的偏差主要是固定誤差，可以用置信區(qū)間法或配對(duì)t檢驗(yàn)來檢測(cè)[14]。本研究綜合考慮上述各方面因素對(duì)結(jié)果分析的影響，運(yùn)用多種分析方法消除HPLC法測(cè)定癲癇患者卡馬西平血漿藥物濃度和CMIA法測(cè)定癲癇患者卡馬西平血漿藥物濃度結(jié)果分析過程中一致性的差異，結(jié)論客觀真實(shí)。

本研究采用Bland-Altman法評(píng)價(jià)兩種方法的一致性，結(jié)果顯示，區(qū)間內(nèi)差異百分比的最大值為14.5%（1.05 μg/mL），臨床上可接受。結(jié)果表明，HPLC法測(cè)定癲癇患者卡馬西平血漿藥物濃度和CMIA法測(cè)定癲癇患者卡馬西平血漿藥物濃度結(jié)果一致性較好，但HPLC法測(cè)定值比CMIA法低2.1%（圖3）。系統(tǒng)誤差分析的結(jié)果也表明這兩種方法都有一定的系統(tǒng)誤差（固定誤差）。這就決定了這兩種方法的區(qū)別。分析誤差來源最可能的原因是卡馬西平代謝產(chǎn)物10，11環(huán)氧卡馬西平與卡馬西平結(jié)構(gòu)相似，干擾卡馬西平的測(cè)定。雖然這兩種方法都不是金標(biāo)準(zhǔn)，但與CMIA法相比，HPLC法準(zhǔn)確、可靠、快速，技術(shù)要求較低，能更好地反映真實(shí)值。

本項(xiàng)研究尚存在如下缺陷：①兩種檢測(cè)方法重復(fù)性限制了納入研究患者數(shù)量，由于患者標(biāo)本通常只能測(cè)試一次，因此，在臨床應(yīng)用樣本中缺乏HPLC法和CMIA法重復(fù)性。②未評(píng)價(jià)藥物代謝對(duì)于兩種方法檢測(cè)患者血漿中卡馬西平含量的影響。③95%LOA是否能夠被臨床醫(yī)生接受尚不得而知。

綜上所述，本項(xiàng)研究建立一種準(zhǔn)確、可靠、快速、簡單的HPLC法測(cè)定癲癇患者血漿中卡馬西平濃度，并與CMIA進(jìn)行比較和驗(yàn)證，研究表明，HPLC法是測(cè)定卡馬西平濃度比較可靠的方法。該方法可以提供更大的特異性，預(yù)后價(jià)值和成本效率，可以為精神科或者眼科用藥監(jiān)測(cè)提供理論依據(jù)。

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（收稿日期：2020-12-05）