霉菌酵母快速檢測測試片的優化

賈倩倩，李宏鐸，白福軍，于宏雙，張 靜，周 琦，賈 晨*

（1.北京美正生物科技有限公司，北京，102200；2.西安市食品藥品檢驗所，陜西西安 710054；3.中儲糧承德糧油質監中心有限公司，河北承德 067000；4.雨潤集團馬鞍山百瑞食品有限公司，安徽馬鞍山 243100）

霉菌和酵母使用廣泛，與人們日常生活聯系十分密切。霉菌不僅應用于傳統的釀酒制醬和發酵食品中，在農業、紡織、食品、醫藥和皮革制造等領域都有極為重要的作用[1-3]。霉菌和酵母菌的污染會導致食品營養價值下降，甚至腐敗變質。若食用被霉菌、酵母菌污染的食品，會造成腸胃不適，引發疾病[4]。因此，人們愈來愈重視食品中霉菌和酵母菌污染對人體造成的危害[5-6]。

霉菌和酵母菌的數量表明食品被污染的程度，是評價食品衛生質量必不可少的指標[7]。在我國飲料、堅果制品、米面制品、糕點類等食品中，把霉菌和酵母菌作為食品污染的指示菌進行監測，被列入國標GB 4789系列食品安全微生物常規檢測項目之一[8]。目前，國內外對霉菌的檢查方法主要有平板計數法、顯色培養基計數法、WKJ-Ⅱ型微生物快速檢測系統、流式細胞儀計數法和測試片法［9-10］。其中，測試片法是一項微生物快速的檢測方法，該方法操作簡便，檢測時間短，極大地提高了檢測效率。而霉菌和酵母菌落在上呈不同形態，容易判斷觀察和直接計數。戴昌芳[11]、余淑冰[12]、王明[13]和趙紅陽[14]等將測試片與國標方法檢測效果進行了評價，研究結果表明兩種方法的檢出結果無顯著性差異。

測試片法雖然成本低、檢測性能好，但也存在霉菌菌絲的蔓延和顯色效果的不穩定影響計數準確性等問題。因此，本研究同過添加不同濃度的抑制劑，探究其對霉菌和酵母菌落形態和顏色的影響，以此優化霉酵測試片檢測效果。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

霉菌酵母測試片：北京美正生物科技有限公司；抑制劑與其他試劑均為國藥分析純試劑。實驗中選取不同品牌和口味的糕點、面包、堅果樣品共5種，均購自超市。標準菌株：1株酵母菌（10231）和11株霉菌（M-1 至 M-11）。

1.2 儀器與設備

SHP-80型生化培養箱，上海森信實驗儀器有限公司；YXQ-70A立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業有限公司醫療設廠；SW-CJ-2FD雙人單面垂直凈化臺，蘇州智凈凈化設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌液制備

從甘油管中活化酵母至馬鈴薯葡萄糖液體培養基，28 ℃培養2 d，平板計數備用。

1.3.2 測試片培養基單因素實驗

將3株霉菌與酵母分別用無菌水進行梯度稀釋，配置成一定濃度的菌懸液，振蕩器混勻，制成最終濃度為10～100 CFU/mL的稀釋液。分別添加霉菌抑制劑的濃度為 1 μL/L、2 μL/L、3 μL/L，每個稀釋梯度設置兩個平行，分別吸取菌液1.0 mL接種于霉酵測試片上，培養測定酵母菌和霉菌的菌落總數，考察抑制劑濃度對霉菌和酵母菌落總數的影響。

1.3.3 測試片培養基驗證實驗

（1）最佳計數范圍的測定。選用12株菌株，用無菌水稀釋成 1×10-7、2×10-7、4×10-7和 8×10-7CFU/mL的4個濃度梯度，進行試驗，分別吸取各個濃度梯度的菌懸液1.0 mL接種測試片，每個梯度設置2個平行，培養計數。

（2）食品樣品的檢測。從市場上采購不同品牌和口味的糕點、面包、堅果和蜂蜜樣品共5份。稱取25 g/mL樣品放入盛有225 mL無菌水的無菌均質袋內，均質器混勻，制成1∶10的樣品勻液。選取一株霉菌，做加標實驗。將霉菌進行梯度稀釋，配置成一定濃度的菌懸液，向樣品勻液中添加菌懸液，混勻，制成最終濃度為10～100 CFU/mL的加標樣品，吸取的樣品菌懸液1.0 mL接種測試片，每個梯度設置2個平行，培養計數。

1.3.4 霉菌和酵母計數

培養后，酵母菌落較小，邊界清晰，顏色均一，菌落顯示紫紅色。霉菌菌落較大，邊緣模糊，呈淺粉色到紫紅色，顏色不均一。

1.3.5 數據分析

本實驗用SPSS、excel對實驗進行設計及數據分析處理。

2 結果與分析

2.1 抑制劑對酵母與霉菌的生長率與形態的影響

由表1可知，隨著抑制劑濃度的升高，霉菌的菌落的生長率沒有顯著性差異，但霉菌菌落大小具有顯著差異，具體見圖1。與對照相比，添加抑制劑后霉菌菌落變小；當抑制劑的濃度≥3 μL/L時，霉菌菌落的大小沒有顯著變化。同時，添加抑制劑對酵母的生長率和形態沒有顯著影響。因此，測試片添加抑制劑的濃度在2 μL/L時效果最佳。

表1 不同濃度抑制劑對霉菌和酵母生長率的影響（單位：log10 CFU/mL）

圖1 3株霉菌和1株酵母在測試片上的形態

2.2 測試片培養基準確度測試結果

為了測定優化后測試片的最佳計數范圍，使用12株菌株，濃度依次遞增，設置了4個梯度。由表2可知，優化后的測試片，大部分霉菌的計數范圍在0～80 CFU，與對照霉菌計數范圍相比（計數范圍＜30 CFU），提高了50 CFU。當菌落數大于86 CFU時，測試片結果顯示均不可計數。

表2 不同濃度梯度霉菌的菌落數（單位：CFU/mL）

2.3 食品樣品檢測結果

表3為檢測6種食品樣品的測試結果。其中，所有樣品原樣中均未檢出霉菌。加標樣品檢測的結果表明，有5種食品樣品中檢出霉菌并計數，1個核桃樣品使測試片整體變色，不能計數。優化后測試片霉菌的計數范圍明顯大于對照組，不同食品樣品的基質會影響測試片霉酵的計數結果，但影響較小。因此，優化后的測試片可以用于部分食品中霉菌菌落計數。

表3 各個食品樣品的霉菌生長率（單位：CFU/mL）

3 結論

本實驗以霉菌酵母測試片為基礎，通過添加抑制劑探究對霉菌酵母生長率和形態的影響。實驗結果表明，抑制劑能夠抑制霉菌菌絲蔓延，減小霉菌菌落，從而提高了霉酵測試片的計數范圍。在檢測面包、蜜餞和堅果等食品樣品時，優化后的測試片霉菌計數范圍明顯大于對照組。因此，優化后的霉酵測試片能夠滿足食品樣品中的霉菌酵母計數的快速檢測需求。