BDNF轉染干細胞治療周圍神經損傷的研究進展

關茗巖，劉建宇

(哈爾濱醫科大學附屬第二醫院骨外科，哈爾濱 150081)

周圍神經損傷(peripheral nerve injury，PNI)的影響人群較廣泛，其中發展中國家患者的占比較高，且人數逐漸增多[1-3]，除可直接導致與傷害相關的功能和心理后果外，PNI還與全球社會經濟和成本相關[4]。PNI的原因主要包括事故、穿透傷、摔傷、缺血、感染、骨折后鄰近神經損傷、醫源性損傷等[5]。

目前PNI的治療方法多樣，如在外科手術中行神經外膜縫合，但術后神經功能恢復情況受到炎癥、感染、手術縫線、瘢痕等的影響，修復效果不能令人滿意[6]；自體不帶血管神經移植對于成段的神經缺損效果最好，但可導致供體神經功能缺失，故來源有限、無法滿足臨床需求；此外，中醫中藥起效慢，長期服用具有肝、腎毒性，缺少更多循證醫學證據。為了解決上述難題，依據不同類型干細胞的特征研究PNI與修復的機制發現，神經營養因子在PNI與其修復機制中發揮重要作用，特別是腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)[7]。現就BDNF轉染干細胞治療PNI的研究進展予以綜述。

1 PNI及修復機制

PNI后導致損傷平面軸突和髓鞘破壞，神經支配的靶器官與軸突之間發生斷裂，軸漿運輸中斷，受損神經短時間內自近端向遠端發生變性，神經元細胞形態發生改變，這一系列反應稱為沃勒變性(Wallerian degeneration)，可導致運動終板乙酰膽堿酯酶活性下降。沃勒變性會引起血液-神經屏障通透化[8]，并通過對組織損傷敏感的受體激活附近的施萬細胞和巨噬細胞，施萬細胞通過脫落髓鞘、增殖、吞噬碎屑、釋放募集血液中的單核細胞/巨噬細胞的細胞因子對損傷做出反應[9]。隨后，施萬細胞沿神經內膜鞘增生，通過與多種細胞外基質相互作用穩定髓鞘的正常狀態，并可分泌細胞因子(血管內皮生長因子、肝細胞生長因子、BDNF等)，其中BDNF可調節神經元發育和功能的幾乎所有方面，包括誘導、增殖及分化[7]，升高的BDNF水平通過促分裂原活化的蛋白激酶信號轉導通路修復退化的神經元、增強神經元活動、促進軸突生長[10]。此外，施萬細胞還通過Ca2+/鈣調神經磷酸酶、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白等信號通路參與PNI的早期修復[11-12]。

2 BDNF的應用研究

神經營養蛋白首次由Brade等[13]通過純化豬腦發現，該蛋白質具有營養作用，可促進神經元發育，且分布廣泛，對于調節神經增殖、分化、成熟和可塑性等過程至關重要，可影響細胞的生命和死亡途徑之間的轉換，其中BDNF在大腦特別是海馬組織中呈高表達，幾乎可調節神經元發育和功能的所有方面[14-15]。

在中樞神經系統中，BDNF在腦認知功能(如記憶、學習、行為和情緒控制)中起重要作用[16]，BDNF還可通過Ras-促分裂原活化的蛋白激酶、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B以及磷脂酶Cγ、Ca2+等[7]信號轉導通路發揮多種不可或缺的作用，如保護神經細胞、促進神經元的存活和發育繁殖、防止神經元受損死亡，維持海馬內突觸可塑性和促進突觸再生，同時上述信號轉導通路還影響患者認知功能，而認知功能是獲取和鞏固記憶的基礎，表明BDNF高水平表達與言語記憶和識別能力相關，并可能抵消慢性壓力和認知能力下降的影響。此外，BDNF還作用于阿爾茨海默病中耗竭的膽堿能神經元[17]、帕金森病中丟失的黑質多巴胺能神經元[18]，而高水平BDNF產生的抗抑郁藥能夠產生更好的神經塑性結果[19]，起到延緩疾病進展的作用。因此，老年人BDNF水平降低可能導致記憶力減退、神經退行性變以及其他認知障礙[20]。

在周圍神經系統中，微RNA-1與BDNF的3′非翻譯區靶向位點結合，抑制BDNF信使RNA的降解和翻譯，培養的施萬細胞中微RNA-1的過表達或沉默分別抑制或增強了細胞的BDNF分泌，并分別抑制或促進施萬細胞的增殖和遷移[21]。BDNF通過結合軸突上原肌球蛋白受體激酶B受體增強神經突伸長，若BDNF再生軸突的可用性減弱，則軸突再生將受到嚴重損害[22]。Fornaro等[23]使用兩個背根神經節外植體和背根神經節衍生的原代細胞制作分離培養物的體外模型，研究BDNF對神經突生長的影響，定量數據表明，BDNF可刺激感覺纖維的曲折生長和細胞簇的形成，促使軸突向周圍靶標分布，上述發現對于BDNF在周圍神經再生中的臨床應用具有重要意義。Scheper等[24]在人骨髓中分離人間充質干細胞，通過轉導和基因表達分析將人間充質干細胞分化為過量表達BDNF的軟骨細胞，從而增加體外神經元的存活率，證實BDNF過表達后人間充質干細胞可進一步對神經產生保護作用。綜上所述，BDNF在中樞及外周神經均可直接、間接(轉染、誘導等)促進軸突再生，是修復損傷神經的重要元素。

3 BDNF轉染干細胞后的治療

干細胞是一類具有自我更新能力和多向分化潛能的細胞，根據所處發育階段不同可分為胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)和成體干細胞。從胚胎分離的干細胞稱為ESCs，從成人分離的干細胞稱為成體干細胞[25]。根據干細胞發育能力的不同又可分為全能干細胞、多能干細胞和單能干細胞。誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)是經細胞核重新編程為胚胎樣多能狀態的成體細胞，可通過將體細胞核轉移到卵母細胞中[26]，或通過多能轉錄因子[27]誘導。

3.1ESCs ESCs來源于發育中的胚泡的內部細胞團，通過體外或體內形成胚狀體來評估，其可在體外維持較長的時間，且不會失去自我更新或發育潛能，產生代表內胚層、中胚層和外胚層的細胞類型，用于PNI修復的治療。Cui等[28]證實，經ESCs誘導施萬細胞移植入大鼠坐骨神經后會出現大量的軸突再生和神經修復。另有研究表明，基因修飾后的人ESCs過表達成纖維細胞生長因子-2，有助于強化脊髓損傷后神經元的保護作用，并促進BDNF等神經營養因子的分泌，表明ESCs可能通過過表達BDNF保護運動神經元，保持突觸覆蓋并降低星形膠質細胞反應性[29]。有實驗證明，BDNF和綠色熒光蛋白轉染后的ESCs可使神經元數量增加，且適用于各種神經病理學條件下BDNF細胞移植改善作用的研究[30]。但是，ESCs源自體外受精的人類胚胎，存在倫理問題，具有致畸胎瘤的潛在風險。目前已成功通過電穿孔法使ESCs過表達BDNF[31]，但后續對周圍神經的修復暫無相關報道。

3.2成體干細胞

3.2.1骨髓來源干細胞 間充質干細胞是中胚層來源的成體干細胞，具有高度的自我更新、多向分化潛能，且來源豐富，可從骨髓、脂肪組織、臍帶、羊水、肌腱、胚胎絨毛膜、乳牙和胎兒的肝臟等組織分離出來。

骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是具有可塑性的多能干細胞，可被誘導分化為多種細胞譜系，包括成骨細胞、軟骨細胞、肝細胞、神經細胞等，易于分離，移植排斥率低。實驗表明，用慢病毒轉染BDNF的BMSCs可在體外分化為神經樣細胞，這與原肌球蛋白受體激酶B受體結合的表達有關，促進未分化人間充質干細胞發育為成熟神經元，以治療神經元疾病[32-33]。Li等[34]通過腺病毒方法轉染BMSCs并聯合促紅細胞生成素促進軸突生長，修復脊髓損傷后大鼠神經，改善其后肢運動功能。同理，采用腺病毒方法使BMSCs過表達BDNF，并在功能化的自組裝肽水凝膠中誘導神經元樣細胞治療脊髓損傷后神經修復的效果較好[35]。將過表達BDNF和神經膠質細胞系神經營養因子的BMSCs作為種子細胞引入高度定向的聚(L-乳酸)/大豆分離蛋白納米纖維神經導管的方法，大幅度提高了神經修復的效率[36]。

3.2.2脂肪來源干細胞 近年來，脂肪組織已能夠作為分化為中胚層細胞譜系的基質細胞的替代來源，脂肪干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是具有類似于BMSCs的表型和基因表達譜的多能干細胞，具有神經營養特性，能夠分化為多種細胞譜系。國內研究已實現BDNF過表達慢病毒載體，并建立了穩定表達的ADSCs株[37]。也有研究表明，ADSCs和施萬細胞共培養后，ADSCs表現出典型的紡錘形S-100標記細胞——施萬細胞的特征，使用慢病毒轉染方法使ADSCs過表達BDNF，并通過對鼠損傷的坐骨神經的電生理、步態分析獲得坐骨神經恢復指數等證明ADSCs具有促進神經髓鞘再生、改善運動和神經的功能[38]。Schweizer等[39]將ADSCs移植到嚙齒動物坐骨神經損傷模型中，證實ADSCs對神經再生有良好的影響，另外，BDNF聯合神經營養蛋白-3通過慢病毒法共轉染大鼠ADSCs后可成功向施萬細胞方向誘導，對維持神經元存活和促進神經元分化有促進作用,也驗證了雙因子比單一營養因子更具有優越性，為組織工程技術治療脊髓損傷的未來實驗提供了堅實的理論基礎[40]。

3.2.3臍帶來源干細胞 臍帶是在母體和胎兒之間運輸營養物質的樞紐，含有大量的間充質干細胞即人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)，胎兒出生后的臍帶來源豐富，不會出現倫理問題，具有促血管生成、抗炎、神經修復、免疫調節功能及非致瘤性[41-44]。hUCMSCs可通過分泌各種神經營養因子并沉積細胞外基質蛋白來調節施萬細胞并促進神經軸突生長，其中旁分泌機制參與了hUCMSCs的細胞療法，在PNI治療中起重要作用。另有實驗表明，腺病毒載體介導的BDNF向hUCMSCs的離體基因轉移，修飾后的hUCMSCs存活時間較長，可維持神經分化，促進擠壓傷大鼠坐骨神經軸突再生和功能恢復，且效果優于未轉染組，可以用于缺氧缺血性腦損傷后神經功能的恢復，但需要進一步評估神經再生的根本機制及長期治療效果[45-46]。

3.2.4神經干細胞(neural stem cells，NSCs) NSCs是一種神經組織特異性的前體細胞，存在于腦和脊髓神經系統中，具有多向分化的潛能和自我更新能力，在不同微環境中可分化為神經元、神經膠質細胞、少突膠質細胞。國內研究表明，BDNF通過非脂質體法基因修飾大鼠胚胎NSCs后進行體外誘導分化，基因轉染48 h后顯示，NSCs形成了雙極神經元樣細胞，誘導7 d后獲得巢蛋白陽性、βⅢ-微管蛋白陽性的NSCs比例明顯高于單一NSCs組、外加BDNF誘導組，反轉錄聚合酶鏈反應檢測BDNF基因表達的增強，證明了NSCs具有體外分泌BDNF的能力，促進了NSCs定向分化為神經元及突觸的發生[47]。另有研究表明，大鼠全腦輻照4周后，將慢病毒載體基因修飾的神經干細胞移植入腦組織海馬中4周，高比例膠質纖維酸性蛋白陽性的星形膠質細胞廣泛分布于海馬內，說明移植海馬內過表達BDNF的NSCs在輻射所引起惡劣的海馬環境中具有整合優勢[48]。Kwon等[49]和Moro等[50]應用腺病毒、慢病毒載體介導BDNF修飾NSCs，能夠防止中樞神經系統損傷后神經元萎縮，并促進再生相關基因表達。此外，神經生長因子+BDNF+堿性成纖維細胞生長因子的聯合使用可顯著提高NSCs增殖和分化能力，大幅提高了NSCs治療效果[51]?？梢娡ㄟ^BDNF修飾NSCs用于修復神經效果佳，基因療法對于治療中樞和周圍神經系統疾病提供了臨床思路。

3.2.5肌源干細胞(muscle-derived stem cells，MDSCs) MDSCs是從骨骼肌中分離出的細胞群體，具有成肌、成脂肪、成軟骨和成骨等多向分化能力，并有很強的自我更新能力，在長時間連續傳代60代仍保持表型不變。MDSCs來源廣泛，代表衛星細胞的前身，具有更高的再生能力和細胞存活率，是近年理想的種子細胞。MDSCs在體外可被誘導分化成施萬細胞[52]，其與BDNF共培養誘導后[53]神經元數量明顯增加，相關分析表明，BDNF水平與神經元損傷之間存在顯著的相關性，有助于MDSCs發揮作用，體內植入MDSCs后，受損神經區域的軸突再生，神經元的凋亡減弱，抗氧化劑的表達以及B細胞淋巴瘤/白血病-2和B細胞淋巴瘤/白血病-2相關X蛋白的比例上調，BDNF還可促進MDSCs向神經元樣細胞的轉化，從而替代受損神經，治療PNI效果佳。此外，采用脂質體法將SMDF基因轉染小鼠MDSCs后與施萬細胞共培養誘導分化，被誘導成施萬樣細胞的陽性率約為89%，明顯高于直接誘導的陽性率63%，證實轉染可提高誘導效率[54]。目前，BDNF轉染MDSCs后誘導神經元樣細胞用于坐骨神經損傷修復的研究正在進行中。

3.3iPSC iPSC是指通過不同基因直接導入成體干細胞，并將分化后細胞的細胞核重新編程到未分化狀態，最終獲得類似ESCs的多能干細胞。iPSC誘導是一種利用轉錄因子重新編程體細胞的機制[55-56]。iPSC可分化為內胚層、中胚層和外胚層三個胚層型，NSCs[57]可誘導干細胞中的神經分化，并具有修復神經系統的潛力，BDNF通過激活Wnt/β聯蛋白和胞外信號調節激酶5信號通路，促進iPSC衍生的NSCs的生長，并分化成疾病特異性的細胞類型，有助于治療神經元疾病。研究顯示，選用腺病毒法將BDNF基因修飾的真皮多能干細胞移植入脊髓損傷局部，鏡下可見大量BDNF陽性細胞，3 d后過表達BDNF的iPSC組凋亡率低于單純BDNF組，根據BBB(Basso,Beattie,Bresnahan)運動量表神經行為學評分法，大鼠神經功能恢復效果明顯優于單純BDNF組，能夠更大程度地改善神經損傷修復[58]。但是，iPSC具有潛在的致瘤性，包括致畸胎瘤性和致癌性，因此有必要進行更加高效、穩定的重編程方案[59]。目前產生iPSc的源細胞、基因修飾方法及相關機制正在不斷更新，其在基因修飾層面能否對神經產生更好的效果暫無相關研究。

4 小 結

隨著組織工程技術蓬勃發展，從全能干細胞ESCs到重新編程的iPSC，經BDNF修飾的細胞大部分均已應用于周圍神經再生和修復，目前BDNF轉染肌源干細胞治療神經再生和修復的研究正在進行中。近年PNI修復的研究取得了很大進步，但基因修飾后干細胞修復神經的機制尚不明確，相關研究仍處于臨床前研究階段，且面臨一些熱點問題，如基因修飾后細胞的變異、應用安全性、基因表達的不穩定性、細胞致瘤性等，隨著對基因修飾干細胞研究及科研水平的提高，基因修飾后干細胞移植應用于PNI修復將有廣闊的前景。