不同品種靈芝子實(shí)體揮發(fā)性成分分析*

王 娟，游金坤，鄧雅元，吳素蕊，楊璐敏，孫達(dá)鋒**

（1.中華全國(guó)供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221；2.云南省供銷合作社科學(xué)研究所，云南 昆明 650221）

靈芝（Ganoderma lucidum），又稱為神芝、仙草、萬(wàn)年蕈、赤芝、瓊珍等，是一種多孔菌科真菌靈芝的子實(shí)體。其外形呈傘狀，菌蓋腎形、半圓形或近圓形。我國(guó)普遍分布，但在長(zhǎng)江以南居多。作為一種珍貴的藥用菌，目前藥理研究主要在靈芝多糖、靈芝酸（三萜類）、腺苷、氨基酸、蛋白質(zhì)、有機(jī)鍺和微量元素等，已有醫(yī)學(xué)研究表明靈芝具有免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老及抗腫瘤等作用[1-9]。近年來(lái)，靈芝的揮發(fā)性成分也引起了人們的廣泛關(guān)注，資料報(bào)道采用有機(jī)溶劑及超臨界二氧化碳萃取方法，對(duì)靈芝揮發(fā)油成分進(jìn)行了研究[10-11]，而關(guān)于靈芝品種間香氣物質(zhì)及品質(zhì)區(qū)分方面的研究鮮有報(bào)道[12-15]。為此，采用頂空-固相微萃取氣相色譜-質(zhì)譜法（HS-SPME結(jié)合GC-MS） 分析不同品種靈芝子實(shí)體揮發(fā)性成分，為品種間的鑒別及特征性品質(zhì)評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)選用白肉靈芝、赤芝、紫芝、大紅芝子實(shí)體，均由中華全國(guó)供銷合作總社昆明食用菌研究所2021年馴化栽培，于同一栽培地點(diǎn)、同一管理栽培模式、同一時(shí)期采收樣品，經(jīng)過(guò)挑選、烘干，粉碎后密封待用。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B-5977B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，Agilent公司，美國(guó)；HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm） 彈性石英毛細(xì)管色譜柱，Agilent公司，美國(guó)；75 μm CAR/PDMS黑色萃取頭，Supelco公司，美國(guó)；AB204-S分析天平，感量0.000 1 g，賽多利斯公司，德國(guó)；20 mL頂空瓶，Agilent公司，美國(guó)；加熱攪拌器，上海理達(dá)儀器廠，中國(guó)。

1.3 方法

頂空-固相微萃取實(shí)驗(yàn)條件：采用黑色75 μm CAR/PDMS萃取頭；萃取溫度為80℃；萃取時(shí)間為60 min；解吸時(shí)溫度為250℃；解吸時(shí)間為2 min。

GC-MS儀器條件：載氣為氦氣，純度為99.999%，流速為1 mL·min-1；進(jìn)樣口溫度為250℃；進(jìn)樣口分流比為10∶1；MSD傳輸線溫度為280℃；MS四級(jí)桿溫度為150℃；離子源溫度為230℃；掃描范圍為35 amu?450 amu；離子源為EI，電子轟擊能量為70 eV；升溫程序：50℃起始溫度保留1 min，以 3℃·min-1升到 180℃，再以 15℃·min-1升到 250℃保留3 min。

所得圖譜經(jīng)計(jì)算機(jī)譜庫(kù)（NIST98） 檢索，并用內(nèi)標(biāo)校正歸一化法計(jì)算各峰的相對(duì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種靈芝子實(shí)體揮發(fā)性成分檢測(cè)結(jié)果

按前述實(shí)驗(yàn)方法，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分析，將確認(rèn)的靈芝子實(shí)體揮發(fā)性成分及求得的各揮發(fā)性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)見(jiàn)表1。

表1 不同品種靈芝子實(shí)體揮發(fā)性成分（相對(duì)含量在0.05%及以上）Tab.1 Volatile components in fruit bodies of different varieties of Ganoderma lucidum(relative content of 0.05%and above)

（續(xù)表 1）

（續(xù)表 1）

由表1可知，不同品種靈芝子實(shí)體中共檢出81種揮發(fā)性成分，其中白肉靈芝子實(shí)體檢出78種揮發(fā)性成分，總相對(duì)含量53.24%；赤芝子實(shí)體檢出81種揮發(fā)性成分，總相對(duì)含量56.17%；紫芝子實(shí)體檢出81種揮發(fā)性成分，總相對(duì)含量48%；大紅芝檢出80種揮發(fā)性成分，總相對(duì)含量52.47%。

2.2 不同品種靈芝子實(shí)體揮發(fā)性成分組成及含量

81種揮發(fā)性成分中醛類25種、酯類7種、酮類14種、萜類5種、醇類10種、烯烴類4種、酸類3種、未知物4種、烷烴及其他14種。化合物組成成分相對(duì)含量見(jiàn)表2。

表2 不同品種靈芝子實(shí)體揮發(fā)性成分組成及含量Tab.2 Composition and content of volatile components in fruit bodies of different varieties of Ganoderma lucidum

含8個(gè)碳的揮發(fā)性化合物是食用菌中最重要的一類風(fēng)味化合物[16]，其均是由亞油酸經(jīng)脂肪氧化酶催化轉(zhuǎn)變而成的，靈芝子實(shí)體中含有的C8化合物主要有苯乙醛、6-甲基-3，5-庚二烯-2-酮、（E） -2-辛烯醛、苯乙醇、N-辛醇、辛醛、苯乙酮、辛酸、3-辛烯-2-酮、2-乙基-1-己醇，這些成分作為食品添加劑和食品香料（增香劑）已經(jīng)廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。

醛類化合物是各品種靈芝子實(shí)體香氣的重要組成成分，由表2可知，赤芝子實(shí)體醛類揮發(fā)性成分相對(duì)含量最高（15.66%），其中苯甲醛（2.10%）、苯乙醛（1.73%）作為有機(jī)合成的中間體，廣泛應(yīng)用于多種精細(xì)化學(xué)品的工業(yè)生產(chǎn)中，如芳香劑、藥物、殺蟲(chóng)劑、殺菌劑以及除草劑等。3-甲基-丁醛（1.50%）又名異戊醛，是制造異戊酸的原料，合成香料的中間體，食品工業(yè)及制藥工業(yè)中的原料，尤其是做為維生素E的合成原料，用量極大。（E） -2-辛烯醛帶有尖刺的青葉香氣，外觀為微黃色液體，易氧化，是一種價(jià)格昂貴的合成香料，被廣泛應(yīng)用于日化香精和食品香精，主要用于調(diào)配蔬菜、水果型等香精。

2-烯醛類和2，4-二烯醛類化合物對(duì)食物的香氣起著非常重要的作用，呈脂肪和肉類香氣，并有清香（黃瓜）香味。在各品種靈芝子實(shí)體中均有檢出，包含3-甲基-2-丁烯醛、（E） -2-己烯醛、（E） -2-庚烯醛、（E） -2-辛烯醛、（E） -2-壬烯醛、2，4-壬二烯醛、（E） -2-癸烯醛、（E，E） -2，4-癸二烯醛和5-甲基-2-苯基-2-己烯醛。

萜烯類化合物因其相對(duì)飽和烴類閾值較小，也是重要的一類風(fēng)味貢獻(xiàn)物質(zhì)。雪松醇具有溫和的杉木芳香，橙花叔醇具有微弱的甜清柔美的橙花氣息，干甜而少清，微帶木香，對(duì)靈芝子實(shí)體的風(fēng)味呈現(xiàn)均有一定貢獻(xiàn)。另外，補(bǔ)身醇在四種靈芝子實(shí)體中均有檢出，研究表明具有廣譜抗真菌活性[17]，可以作為靈芝子實(shí)體的特征揮發(fā)性成分。

酯類化合物占的比重較大，其中2，2，4-三甲基-1，3-戊烷二醇二異丁酸酯含量最高（4.38%～7.95%），其次為2-甲基-丙酸，3-羥基-2，2，4-三甲基戊酯（3.36%～2.29%）、棕櫚酸甲酯（0.51%～0.72%）等。棕櫚酸甲酯是表面活性劑及其他精細(xì)化工產(chǎn)品的原料，用作乳化劑、潤(rùn)濕劑、穩(wěn)定劑及增塑劑的中間體，也用于生產(chǎn)香精香料等。

醇類和酮類物質(zhì)因其多數(shù)閾值較高，對(duì)風(fēng)味特征的貢獻(xiàn)不太大，但某些物質(zhì)卻是香氣的重要組成部分。其中香葉基丙酮具有木蘭香氣的名貴香料，用作醫(yī)藥中間體合成維生素。2-十一烷酮也作為香料、食品添加劑廣泛使用。

不同品種靈芝子實(shí)體中均檢出4種未知物，其含量為4.51%～8.42%。這幾種物質(zhì)在各品種間表現(xiàn)出較為顯著的差異性，是否可以作為靈芝子實(shí)體香氣的特征物質(zhì)還有待進(jìn)一步研究。

2.3 不同品種靈芝子實(shí)體揮發(fā)性成分比較

主成分分析（PCA）是一種通過(guò)特征抽取和降維技術(shù)，通過(guò)對(duì)大量數(shù)據(jù)的簡(jiǎn)化及優(yōu)化處理，快速實(shí)現(xiàn)模式或者關(guān)系的可視化識(shí)別[18]。依據(jù)4種靈芝子實(shí)體揮發(fā)性化合物種類和相對(duì)含量的信息數(shù)據(jù)（表1），采用SPSS Statistics 21.0軟件數(shù)據(jù)分析中的降維因子分析功能對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，將靈芝子實(shí)體揮發(fā)性成分種類的相對(duì)含量作為分類變量，對(duì)4個(gè)品種靈芝子實(shí)體揮發(fā)性成分進(jìn)行分類，并分析比較，詳見(jiàn)表3和表4。

表3 主成分的特征值和貢獻(xiàn)率Tab.3 Eigenvalues and contribution rate of principal components

表4 主成分載荷矩陣Tab.4 Principal component load matrix

由表3和表4可知，不同品種靈芝子實(shí)體揮發(fā)性成分相對(duì)含量有一定差異，但這些樣品多數(shù)含有2，2，4-三甲基-1，3-戊烷二醇二異丁酸酯、雪松醇、芴、橙花叔醇、二苯呋喃、2-甲基-丙酸，3-羥基-2，2，4-三甲基戊酯、2-苯丙烯醛、壬醛、苯甲醛、苯乙醛、己醛、1，1-二甲基-1-丁烯、2-甲基-1，1-二苯基-1-丙烯、3-甲基-丁醛、糠醛等成分，且這些成分在各樣品中含量均較高，為靈芝子實(shí)體的主要揮發(fā)性成分。PCA分析中主成分1（67.088%） 和主成分2（32.912%） 累計(jì)方差貢獻(xiàn)率100%，能夠較好反映樣本原始數(shù)據(jù)的大部分信息。PCA分析發(fā)現(xiàn)，（E） -2-庚烯醛、3，4-二（亞甲基） -環(huán)戊烷酮、（E） -2-辛烯醛、丁基乙二醇乙酸酯、（E） -2-壬烯醛、2，4-壬二烯醛、（E） -2-癸烯醛、（E，E） -2，4-癸二烯醛、庚醛、5，6-二氧-2H-吡喃-2-酮、2-壬烷酮、1，6，7-三甲基-萘、補(bǔ)身醇、雪松醇14種揮發(fā)性成分為靈芝的特征性風(fēng)味成分。

3 討論

揮發(fā)性成分的形成與積累是復(fù)雜的過(guò)程，所含揮發(fā)性成分的不同可能與物種的遺傳特性、環(huán)境因子、生長(zhǎng)發(fā)育階段和栽培方式等因素有關(guān)。在本色譜條件下，靈芝子實(shí)體的揮發(fā)性成分可以有效分離和鑒定，其中，最主要的是醛類、酯類、醇類和萜類。但鑒定得到的揮發(fā)性成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)沒(méi)有達(dá)到100%，分析原因可能是固相微萃取碰到揮發(fā)性不強(qiáng)或組分復(fù)雜時(shí)，其萃取頭難以吸附到足夠量的大分子揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)入GC-MS進(jìn)行分析檢測(cè)，因此，對(duì)大分子揮發(fā)性物質(zhì)的研究還需進(jìn)一步優(yōu)化固相微萃取條件。鑒于食用菌子實(shí)體揮發(fā)性成分是由許多化合物組成，后續(xù)研究中可采用氣相色譜-電子鼻聯(lián)用技術(shù)（GC-O） 進(jìn)行輔助鑒定，繪制特征性氣味指紋圖譜，進(jìn)一步確定影響食用菌風(fēng)味的因素。