大鼠正畸牙移動過程中壞死性凋亡對牙周組織中IL-1β及IL-17的影響

陳思言,季開心,張敏杰,唐 林,張苗苗

正畸牙移動中牙周組織改建的分子生物學機制是正畸學者的研究方向，但正畸牙齒移動中壓力側牙周組織細胞死亡方式的具體機制尚不明確。在正畸力的作用下，壓力側牙周膜的間隙變窄，毛細血管管腔縮小，循環受阻，血流量減少，使牙槽骨組織細胞處于低氧環境，膠原纖維和基質降解吸收，大量破骨細胞分化，牙槽骨發生骨吸收，張力側牙周膜的牙周間隙增寬，膠原纖維和基質增生，成骨細胞分化，新骨沉積[1-2]。除此之外，在正畸力作用后，牙周組織發生無菌性炎癥，齦溝液(gingival crevicular fluid，GCF) 中產生大量炎性介質和酶類，其中炎癥因子在骨吸收中有多種影響，體內的炎癥反應是由復雜的細胞因子網絡所調控的，白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白介素-8(interleukin-8，IL-8)、白介素-17(interleukin-17，IL-17)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)以及轉化生長因子(transforming growth factor-β， TGF-β)可以促進破骨細胞的形成[3-5]，影響牙齒移動。壞死性凋亡是由受體相互作用蛋白(receptor-interacting protein 1，RIP1)、RIP3及其底物混合系列蛋白激酶樣結構域(mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL)所介導的一種新型細胞死亡方式，它可以由多種因素激活，包括TNF-α、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、DNA損傷、缺氧和營養缺乏[6]。當TNF-α激活RIP1后，招募RIP3形成壞死復合體，繼而促進RIP3靶向作用MLKL滲透質膜，釋放炎性因子。根據國外的相關研究結果發現阻斷壞死性凋亡的進一步發生可通過抑制RIP1的活性來實現。壞死性凋亡特異性抑制劑(Necrostatin-1，Nec-1)是一種經研究證實的通過抑制RIP1磷酸化與RIP3相互作用來抑制壞死性凋亡的抑制劑，它已經廣泛地應用于研究壞死性凋亡的體內、體外模型中[7-8]。近年來科學研究發現，多種細胞死亡方式均與機械力作用下壓力側牙周組織細胞數目減少有關，包括凋亡、焦亡、自噬等，這些不同的死亡類型之間存在相互關聯和轉化。已有研究證明，壞死性凋亡介入到牙周炎的病理生理過程中，但在正畸力作用下，牙周組織內營造的缺血缺氧環境是否會激發壞死性凋亡的發生需要進一步證實。本實驗建立大鼠正畸牙移動模型，通過抑制壞死性凋亡相關蛋白RIP1，觀察炎性因子IL-1β、IL-17表達情況，探討壞死性凋亡對正畸牙齒壓力側牙周組織中的炎性因子以及牙齒移動距離的影響，為臨床治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及正畸裝置

選用80 只6～8 周齡健康雄性SD大鼠(遼寧省長生生物技術有限公司)，體質量(220±20)g。隨機將大鼠分為空白對照組、抑制劑組(Nec-1)、加力組(加力50 g)、加力+抑制劑組(加力50 g+Nec-1)，再按加力時間1、3、5、7、14 d分為五個亞組，每組4 只。適應性飼養一周，術前禁食12 h，建立大鼠正畸牙移動模型，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(0.1 mL/100 g)，磨短大鼠下頜切牙，將上頜切牙近牙頸部打磨出一圈直徑約0.2 mm的槽溝，將鎳鈦拉簧(深圳市速航科技發展有限公司)放置于大鼠左側上頜切牙和第一磨牙之間，彈性結扎絲(0.2 mm)固定，上頜切牙酸蝕，涂粘接劑，流體樹脂包裹，光敏燈固化處理，防止脫落。使用50 g的正畸力牽引左側上頜第一磨牙向近中移動(圖1)。

圖1 大鼠第一磨牙正畸移動模型Fig.1 Orthodontic tooth movement model of rat's first molar

1.2 Nec-1注射

根據國外的相關研究發現Nec-1既不會直接影響細胞的正常生物學功能也不會直接抑制細胞的自噬與凋亡，已廣泛應用于研究壞死性凋亡的體內、體外模型中，其在大鼠腹腔注射使用濃度為1 mg/kg[9-11]。正畸剛開始加力后，對抑制劑組及加力+抑制劑組大鼠Nec-1腹腔注射(1 mg/kg)(MedChemExperss,美國)，注射頻率為2 d注射一次，注射時間保證在上午9∶00—11∶00，于1、3、5、7、14 d處死進行組織準備。

1.3 組織準備

在正畸牙移動1、3、5、7、14 d后使用2%戊巴比妥鈉進行腹腔注射，待大鼠停止呼吸后，4%多聚甲醛心臟灌注處理，將大鼠左側上頜第一磨牙及其周圍牙周組織置于4%多聚甲醛中固定24～48 h，然后置于0.5 mol/L的EDTA中脫鈣6 周后進行梯度乙醇脫水，石蠟包埋，連續矢狀切片，厚度為5 μm。

1.4 測量牙齒移動距離

固定一名實驗人員使用游標卡尺測量第一磨牙和第二磨牙近中頰尖與遠中頰尖之間的距離，每個組織測量3次，取平均值。

1.5 HE染色觀察

在光學顯微鏡下進行選片，置于二甲苯原液中進行脫蠟，在進行性梯度乙醇脫水，蒸餾水沖洗。每個切片中加入100 μL蘇木精染色液，染色的時間為10 min，蒸餾水清洗，1%的鹽酸乙醇進行分化，分化的時間為20 s，蒸餾水清洗，1%稀氨水反藍，時間為30 s，蒸餾水清洗，伊紅染色，染色時間為3 min，組織梯度乙醇脫水，再放入二甲苯浸泡2 次，中性樹膠封片，Olympus-SZX16光學顯微鏡觀察各組大鼠壓力側牙周組織形態，拍照記錄。

1.6 IL-1β, IL-17免疫組織化學染色及定量分析

切片常規脫蠟至水后3%過氧化氫避光浸泡20 min，使用蒸餾水沖洗3次，37 ℃胰酶消化法修復抗原20 min，然后使用蒸餾水、PBS溶液各沖洗3次。滴加IL-1β多克隆抗體(Santa，美國)，IL-17A多克隆抗體(Affinity，美國)，4 ℃孵育過夜 ，PBS溶液沖洗3次，37 ℃滴加生物素化二抗30 min，PBS溶液沖洗3次，DAB(北京中杉金橋生物技術有限公司)顯色，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。Olympus-SZX16光學顯微鏡鏡檢，圖像采集，以深棕黃色顆粒為陽性著色細胞，采用Adobe Photoshop CS6圖像分析系統軟件對免疫組化染色后細胞進行計數。

1.7 統計學分析

采用GraphPad Prism 8.0軟件包使用ANOVA檢驗進行統計學分析，P<0.05具有統計學意義。

2 結 果

2.1 正畸加力后大鼠牙周組織形態的病理變化

HE染色顯示空白對照組牙周膜纖維排列整齊，牙槽骨表面及牙根表面較光滑平整，隨著加力時間的延長，大鼠壓力側牙周膜間隙從3 d開始逐漸變窄，牙周膜纖維排列紊亂，骨吸收陷窩逐漸增多，14 d牙周膜間隙恢復趨于空白對照組，牙周膜纖維排列較為規則(圖2)。

a：空白對照組；b：加力1 d組；c：加力3 d組；d：加力5 d組；e：加力7 d組；f：加力14 d組；箭頭示骨吸收陷窩；PDL：牙周膜；R：牙根；MB：近中壓力側牙槽骨圖2 不同時間加力組的HE染色結果( ×100)Fig.2 Staining images of force group at different times( ×100)

2.2 大鼠正畸牙齒移動情況

加力組大鼠正畸牙齒移動距離隨加力時間增長而增加，加力+抑制劑組與加力組相比較明顯降低(P<0.05)，加力組牙齒移動速率1～3 d明顯增加，隨后下降，7～14 d趨于平緩，加力+抑制劑組牙齒移動1～3 d相對緩慢，5～7 d明顯加快，7～14 d趨于平緩(圖3)，空白對照組與抑制劑組大鼠均無移動。

圖3 各組大鼠牙齒移動距離時相變化曲線Fig.3 Phase change curve of tooth movement distance of rats in each group

2.3 IL-1β免疫組織化學染色結果

結果顯示IL-1β表達主要分布在牙周膜成纖維細胞、破骨細胞、牙髓細胞等中(圖4)。

a：空白對照組；b：3 d加力組；c：3 d加力+抑制劑組；AB：牙槽骨；PDL：牙周膜；R：牙根圖4 IL-1β表達情況( ×400)Fig.4 Expression of IL-1β( ×400)

加力組IL-1β表達3 d達到高峰，隨后逐漸下降，與空白對照組比較具有統計學意義(P<0.000 1)。1～7 d的加力+抑制劑組IL-1β的表達整體顯著低于加力組，但均高于空白對照組，3 d組下降至最低，5、7 d恢復到1 d水平，建模后1 d至7 d加力組與加力+抑制劑組相比較差異有統計學意義(P<0.05)，抑制劑組與空白對照組表達差異無統計學意義(圖5)。

***：P<0.001；****：P<0.000 1圖5 各組IL-1β陽性細胞個數Fig.5 Numbers of IL-1β positive macrophages in each group

加力組牙齒移動速度和IL-1β表達在1～3 d均迅速增長，3～7 d有所下降，7～14 d近于平緩(圖6)。

圖6 加力組牙齒移動距離和IL-1β隨時間變化Fig.6 Tooth movement distance and IL-1β changed with time in the force group

2.4 IL-17免疫組化染色結果

結果顯示IL-17表達于牙周膜成纖維細胞、血管內皮細胞中，呈棕黃色顆粒(圖7)。

a：空白對照組；b：5 d加力組；c：5 d加力+抑制劑組；AB：牙槽骨；PDL：牙周膜；R：牙根圖7 IL-17表達情況( ×400)Fig.7 Expression of IL-17( ×400)

空白對照組中IL-17呈弱陽性表達，正畸加力組中，IL-17表達隨時間延長而逐漸增加，7 d達到高峰，14 d下降到5 d組水平，3 d至14 d組與空白對照組相比較差異有統計學意義(P<0.000 1)。加力+抑制劑組IL-17表達與加力組比較均降低，5 d組降低到最低值，至14 d恢復到加力組1 d水平，具有統計學意義(P<0.05)。1 d組與空白對照組差異無統計學意義(P>0.05)，抑制劑組與加力+抑制劑組變化趨勢相似(圖8)。

*：P<0.05；****：P<0.000 1圖8 各組IL-17陽性細胞個數Fig.8 Numbers of IL-17 positive macrophages in each group

3 討 論

3.1 大鼠正畸牙移動模型的建立

據文獻統計57%正畸牙移動模型使用大鼠建立[12]，而50 g的正畸力對于促進正畸牙齒移動牙周組織改建最為明顯。本實驗建模后，大鼠牙周組織病理變化明顯，牙齒移動距離顯著增加，證明大鼠正畸牙移動模型建立成功。有文獻表明，隨著加力時間增加，牙齒移動速率可分為：初始快速移動期，滯緩期，滯緩后移動期[13]。大鼠牙齒加力后1 d至3 d移動距離迅速增加，7 d至14 d出現滯緩，有學者認為滯緩現象的出現與牙周組織壓力側成纖維細胞的玻璃樣變有關，清除玻璃樣變組織后進入滯緩后移動期[14]。本實驗在適宜正畸力作用下，隨著加力時間延長，大鼠牙移動有從初始快速移動期至滯緩期的過程，而對于滯緩后移動期出現的時間需要進一步觀察探究。

3.2 壞死性凋亡

壞死性凋亡是一種受調節的細胞死亡方式，由RIP1、RIP3及MLKL介導[15]，其在形態學上具有壞死的特征，細胞裂解死亡釋放大量細胞內容物引起周圍炎癥反應[16]。壞死性凋亡可以被多種刺激激活，包括TNF-α、LPS、DNA損傷、缺氧和營養缺乏[5]。RIP1在細胞存活、炎癥和細胞凋亡中發揮作用，并被確定為壞死性凋亡的主要參與者。有研究表明，Nec-1能抑制RIP1激酶的活性，阻斷RIP1、RIP3蛋白相互磷酸化，進而抑制復合物的形成，它是壞死性凋亡過程中的特異性抑制劑[17-19]。正畸力作用下，牙周膜細胞經受復雜的三維環境變化，使其處于缺血缺氧的環境中。近年來，有文獻報道力學刺激可誘導多種細胞發生程序性細胞死亡[20-21]。程序性細胞死亡包括凋亡、壞死凋亡、焦亡、自噬等。有實驗研究發現牽張加載可誘導人牙周膜細胞發生程序性細胞死亡，且不同牽張時段可能誘導不同階段的程序性細胞死亡發生[22]。加力+抑制劑組大鼠牙齒移動距離與加力組大鼠相比明顯減少(P<0.05)，說明注射壞死性凋亡抑制劑后可減少大鼠正畸牙移動距離，且抑制劑作用在3 d時最為明顯，由此推測，壞死性凋亡可能參與正畸力作用下大鼠牙齒移動的某一階段過程中。

3.3 IL-1β的表達變化

正畸牙齒移動是一個高度復雜的過程，施加機械力后牙周組織發生重建，牙齒運動過程中的骨重塑是一種涉及急性炎癥反應的生物學機制。IL-1β主要由單核細胞和局部的巨噬細胞、上皮細胞和成纖維細胞合成分泌，是一種強大的骨吸收刺激因子，它已被證明是能夠刺激破骨細胞活化并吸引白細胞和其他細胞介質來進行骨重塑最有效的細胞因子，IL-1β由牙周韌帶(periodontal ligament，PDL)產生，大量擴散到GCF中，被認為是正畸牙齒移動的生物標志物[23]。本實驗結果顯示在正畸力作用下IL-1β表達在早期迅速達到高峰，而后逐漸下降，與牙齒移動速率趨勢相適應，說明IL-1β可影響破骨細胞分化促進骨吸收，與牙齒移動變化周期有關，可為正畸患者復診時間提供依據。加力+抑制劑組大鼠IL-1β表達降低，推測壞死性凋亡抑制劑可通過抑制牙周膜細胞壞死性凋亡的發生，減少IL-1β的表達，從而抑制破骨細胞分化，影響骨吸收，減少牙齒移動距離。IL-1β在抑制劑組中的表達量與空白對照組接近且加力+抑制劑組與抑制劑組變化趨勢相似，表明抑制劑本身對IL-1β的分泌沒有影響。

3.4 IL-17的表達變化

IL-17是由CD4+的T細胞亞群Th17細胞產生的一種因子，免疫細胞 Th17 及其細胞因子 IL-17 同時參與破骨細胞的分化、成熟和激活[4]。有研究證實，IL-17通過促進局部炎性細胞因子的產生等間接方式，參與破骨細胞的分化、成熟、活化過程[24]，并與其他炎性因子協同作用影響骨改建。此外，IL-17在各種涉及骨喪失疾病(如牙周炎、風濕性關節炎、骨關節炎等)中發揮強大的促炎作用和骨吸收作用,范瑞賢等[25]發現IL-17參與了正畸牙齒移動牙周組織改建及牙根表面改建的過程。IL-17的分泌可促進破骨細胞分化，促進牙槽骨吸收，或直接抑制成骨細胞的分化從而阻礙骨修復再生影響牙齒移動[26]，加力+抑制劑組大鼠IL-17表達降低，推測壞死性凋亡抑制劑可通過抑制牙周膜細胞壞死性凋亡的發生，影響IL-17骨改建過程，減少大鼠正畸牙移動距離。IL-17在抑制劑組中的表達量在1、3、5、7 d組中與空白對照組接近，但在14 d組中出現明顯升高，加力+抑制組在14 d組中IL-17含量也有上升趨勢，此現象說明可能隨著Nec-1注射量的增多，當達到一定量時Nec-1的抑制作用減弱，或有促進IL-17表達的作用，也可能由于抑制劑組14 d組統計數據產生誤差所致。

根據本實驗研究可發現壞死性凋亡可能存在于正畸加力后的牙周組織中，抑制壞死性凋亡可降低炎性分子的水平，影響破骨細胞分化從而影響牙齒移動，然而影響炎性因子分泌的途徑及機制尚待進一步研究。