新型冠狀病毒肺炎患者細胞免疫指標的動態演變及其對核酸轉陰時間的影響

孫峰 楊建中 劉雪梅 燕存子 周晨亮

新型冠狀病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)自2019年12月以來呈全球暴發流行趨勢，已成為危害全球人民健康的重大傳染性疾病。COVID-19是病毒性肺炎的一種，機體的免疫狀態對疾病的發生發展有重要影響，有研究報道發現，外周血CD4、CD8細胞計數水平越低，患COVID-19的風險性越大[1]，且與嚴重程度相關[2]。然而對于細胞免疫指標在整個病程中的動態演變過程及其對核酸轉陰時間的影響，尚未見報道。本研究回顧性收集確診COVID-19患者的臨床資料，分析從發病到核酸轉陰整個病程中細胞免疫學指標的變化過程，期望闡述新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染對機體免疫狀態的影響及與病毒核酸轉陰時間的關系，為加快病毒肅清、縮短病程尋找治療方向。

資料與方法

一、研究對象

通過電子病歷系統回顧性收集武漢大學人民醫院東院收治且于2020年2月20日至2020年3月15日好轉出院的確診COVID-19患者，根據病歷資料及實驗室檢查，評估臨床分型。診斷標準、出院標準及臨床嚴重程度分型參照《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》[3]。排除標準：①病歷資料不全或首發癥狀不典型，不能明確發病時間者；②未完成細胞免疫檢測者。

二、研究方法

回顧性收集的所有患者多次免疫學指標檢測時間點不均衡，故本研究以發病時間(即出現癥狀日期)為起點，按照發病0～4 d(P0)、5～7 d(P1)、8～10 d(P2)、11～14 d(P3)、15～21 d(P4)、22～28 d(P5)、29～35 d(P6)、36 d以上(P7)分為8個時間點，將所有免疫學檢測指標歸入各時間點進行分組比較。按照核酸轉陰距離發病時間分為兩組：A組，核酸轉陰距發病時間≤30d；B組，核酸轉陰距發病時間>30d。發病時間以電子病歷中記錄的首次出現COVID-19典型臨床表現(發熱或呼吸道癥狀)的日期為準。研究終點：連續兩次呼吸道分泌物檢測SARS-CoV-2核酸陰性(采樣時間間隔24h以上)。核酸轉陰時間，以連續兩次呼吸道分泌物檢測核酸陰性時的首次核酸陰性日期為準。同時記錄病程中是否有使用糖皮質激素的情況。

三、新型冠狀病毒核酸檢測及判讀

病毒核酸檢測由武漢大學人民醫院檢驗室完成，采用實時熒光RT-PCR檢測，2019nCov核殼蛋白基因和開放閱讀編碼框1ab同時陽性者判讀為陽性，同時陰性者判讀為陰性，某一項為陽性者判讀為可疑，需重新采樣復查。

四、統計學方法

結 果

一、一般資料

本研究共檢出COVID-19患者135例，其中12例因病史資料中缺乏COVID-19典型癥狀無法確定發病日期而剔除，另有7例因未完成細胞免疫檢測而剔除。最終本研究納入病歷116例，其中男性60例(50.9%)，女性56(49.1%)，年齡25～83歲，中位數年齡59.5歲。普通型38例，重型72例，危重型6例。主要的臨床首發癥狀包括：發熱102例(87.9%)，咳嗽77例(66.4%)，咯血7例(6%)，呼吸困難(包括胸悶、氣促、氣短)53例(45.7%)，腹瀉17例(14.7%)，惡心嘔吐7例(6%)，胸痛9例(7.8%)。有基礎疾病者共61例(52.9%)，其中較常見的有高血壓33例(28.4%)，糖尿病15例(12.9%)。發病日期從2020年1月6日到2月17日，核酸轉陰時間12～51d，平均30.79±8.48d，中位時間33d。A組與B組分別有患者37例、79例，兩組基線資料比較(見表1)，性別、年齡、嚴重程度分型、合并高血壓、合并糖尿病比例兩組間無顯著差異(P>0.05)。

表1 A、B兩組基線資料比較

用廣義線性混合模型分析細胞免疫指標的動態演變：共收集來自116例COVID-19患者在不同時間點的細胞免疫檢測結果238份，廣義線性混合模型分析結果(見表2)。CD3、CD4、CD8、CD19計數組間有顯著性差異(P<0.05)，動態變化(見圖1)所示，各指標P0點均在正常范圍，隨時間逐漸下降，CD3、CD4、CD8、CD19在P2降至最低，CD3、CD4、CD8平均值明顯低于正常值，P3時開始恢復。CD19、CD16+/56+的平均值在全程中均在正常范圍內。CD4/CD8各組無顯著性差異(P>0.05)。年齡對CD8和CD16+/56+變化有影響，隨年齡增高，CD8計數下降，CD16+/56+計數升高。合并糖尿病者CD3、CD4、CD16+/56+計數下降。疾病嚴重程度分型可以影響CD3、CD4變化。甲強龍使用僅影響CD16+/56+計數，使其計數下降。

表2 ROC曲線評估免疫指標對核酸轉陰時間的預測價值

圖1 細胞免疫的動態變化

表2 細胞免疫指標動態變化的廣義線性混合模型

細胞免疫指標與核酸轉陰時間的關系：A組、B組分別有細胞免疫樣本60份、178份，其中CD3、CD4、CD8在P3點組間有顯著性差異(P<0.05)，CD8在P0、P3兩點 B組CD8計數分別為165.25±120.39、179.23±143.61，顯著低于A組(463.50±119.50、426.68±286.47)，明顯低于正常范圍220～1129，(P<0.05)。發病初期B組CD19較A組更低，尤其在P3點，B組和A組CD19計數分別為141.94±60.24、244.89±183.21(P=0.136)，差異無統計學意義可能與病例數少有關(B組17例、A組9例)。細胞免疫在組間與組內差異(見圖2)。

圖2 AB組間細胞免疫指標的比較

甲強龍對核酸轉陰時間的影響 116例患者，使用糖皮質激素治療的有66例，未使用的有50例，所有使用糖皮質激素的病例均使用甲強龍，且每日劑量不超過160 mg，總療程不超過20d。兩組的核酸轉陰時間分別為33.42±8.509d、33.36±8.268d，兩組間無顯著性差異(P>0.05)。A組與B組甲強龍使用病例分別為21例(56.8%)、45例(57%)，兩組無顯著差異(P>0.05)(見表1)。

采用ROC曲線評估免疫指標對核酸轉陰時間的預測價值 P3點共納入26例病例，分別以CD3、CD4、CD8為檢驗變量，以核酸轉陰時間分組為狀態變量繪制ROC曲線，結果(見表3，圖3)。結果顯示P3點CD3、CD4、CD8下降可預測核酸轉陰時間延長(P<0.05)。

圖3 各指標預測核酸轉陰時間的ROC曲線

討 論

COVID-19正在全球范圍蔓延，傳染性比2003年的嚴重急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)和2013年的中東呼吸綜合征(Middle East respiratory syndrome, MERS)更強[4]，嚴重威脅全球各國人民的生命健康。SARS-CoV-2進入人體，與呼吸道、消化道黏膜上ACE2受體結合，不斷復制增殖[5]，肺泡巨噬細胞和上皮細胞會釋放大量促炎細胞因子和趨化因子，啟動機體免疫反應。免疫反應可有效抑制病毒的復制，也可導致細胞因子風暴，引起多臟器功能衰竭，這與機體免疫狀態有關。已有研究發現，免疫功能與COVID-19的發生及疾病嚴重程度的有關[1-2]，但之前的研究都只針對患者發病初期的一次檢驗結果進行分析，而本研究共納入116例確診COVID-19患者238份細胞免疫結果，是首次從出現癥狀到呼吸道分泌物病毒核酸轉陰，分8個時間點探究細胞免疫功能的演變過程，為闡明整個病程中機體的免疫狀態提供依據。本研究納入患者核酸轉陰時間平均值為30.79±8.48d，比同類研究更長，可能由于入組患者為2020年2月20日至2020年3月15日出院的武漢地區患者，屬于武漢疫情終末階段，大多病程較長。以平均值為截點，將核酸轉陰時間分為A組(≤30d)和B組(>30d)，分析影響核酸轉陰時間的因素。

本研究中細胞免疫主要檢測CD3計數、CD4計數、CD8計數、CD19計數及CD16+/56+計數，其中CD3是成熟T淋巴細胞表面的標志；CD4是輔助性T淋巴細胞的標志，可增強巨噬細胞介導的抗感染作用和B細胞介導的體液免疫應答，是SARS-CoV-2感染的肺泡中浸潤的主要淋巴細胞[6]；CD8是抑制/殺傷T淋巴細胞的標志，是特異性直接殺傷靶細胞的效應T細胞，在對SARS的研究中發現CD8T淋巴細胞可以清除被病毒感染的細胞，且CD8記憶T細胞在體內持續至少6年，遠遠超過病毒特異性抗體IgG的保護作用[7]；CD19是B淋巴細胞表面特有的，可通過調節B細胞的增殖活化介導體液免疫；CD16和CD56代表自然殺傷細胞(NK細胞)，是機體抗感染的重要免疫因素。本研究發現發病0～4d細胞免疫指標平均值均在正常范圍內，隨著疾病發展，CD3、CD4、CD8明顯下降，至發病8～10d降至最低點，隨后逐漸恢復，至發病22～28d恢復至較高水平。且CD3、CD4、CD8均與核酸轉陰時間有關，A組CD3、CD4、CD8最低點均在發病8～10d，而B組在發病8～10d后CD3、CD4、CD8細胞會繼續減少，直至發病11～14d后才逐漸恢復。ROC曲線結果顯示11～14d CD3、CD4、CD8可預測核酸轉陰時間延長，這說明T淋巴細胞的持續減少可能預示著核酸轉陰時間的延長。

本研究采用廣義線性混合模型分析各時間點細胞免疫指標發現，年齡、糖尿病和疾病嚴重程度是影響細胞免疫指標的變化的危險因素，尤其對T淋巴細胞影響顯著。年齡越高，CD8計數越低。糖尿病患者CD3、CD4計數下降。這可能是老年患者及合并糖尿病患者是新冠肺炎高危人群的原因之一。本研究A組和B組患者年齡及合并糖尿病比例無顯著差異，說明核酸轉陰時間延長與新冠病毒感染導致T淋巴細胞減少有關。

COVID-19患者治療中糖皮質激素的使用一直存在較大分歧，本研究發現甲強龍使用僅影響CD16+/56+計數，而對CD3、CD4、CD8、CD19無顯著影響，說明甲強龍的使用對T淋巴細胞影響較小。同時甲強龍的使用不會影響核酸轉陰時間。有學者[11]發現COVID-19并發ARDS的患者中甲強龍的使用可以降低死亡率。把握好適應癥、適量使用甲強龍可能改善COVID-19患者預后。

本研究認為SARS-CoV-2感染機體后會導致T淋巴細胞數量減少，動態監測CD3、CD4、CD8的變化可以預測核酸轉陰時間，發病14d后CD3、CD4、CD8計數減少可能預示核酸轉陰時間延長。但本研究各時間點納入樣本量不均衡，缺乏同一患者動態隨訪資料，尚需進一步研究SARS-CoV-2與T淋巴細胞的相互作用，闡明COIVD-19的免疫損傷機制，為尋找可能的干預手段，指導COVID-19的臨床治療提供思路。