新生兒呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎氣管導(dǎo)管尖端生物膜菌群分析及其臨床意義

黨曉平 胡小劍 鄭玲芳

呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎(Ventilator associated pneumonia，VAP)為呼吸內(nèi)科常見疾病，系指以往無肺部感染而在機(jī)械通氣>48h后出現(xiàn)的肺部感染，文獻(xiàn)報(bào)道VAP發(fā)病率約為43.1%，病死率約為51.6%[1]。近年來隨著我國新生兒急救醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，呼吸機(jī)在新生兒中的應(yīng)用較為廣泛，文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)達(dá)國家新生兒VAP發(fā)病率約為3.0%～8.1%，發(fā)展中國家約為30.6%[2]，新生兒VAP早期癥狀缺乏典型性，早期識(shí)別難度較大，而診治不及時(shí)易引起脫機(jī)困難和治療時(shí)間延長，對(duì)新生兒生命造成嚴(yán)重威脅[3]。近年來由于新生兒VAP的致病菌和臨床診治不同于一般的肺炎，且其病死率較高，國內(nèi)外對(duì)新生兒VAP的研究日益重視[4-5]。鑒于此，本文通過臨床回顧性分析，探討新生兒VAP患兒氣管導(dǎo)管尖端生物膜菌群變化及其臨床意義，旨在為新生兒VAP的早期防治提供有價(jià)值的參考。

資料與方法

一、一般資料

回顧性分析，收集2016年6月～2020年6月在本院行呼吸機(jī)治療的新生兒65例臨床資料。其中男嬰41例(63.08%)，女嬰24例(36.92%)，日齡3～27d，平均日齡(11.06±1.28)d，早產(chǎn)兒47例(72.31%)、足月出生兒18例(27.69%)，出生體重：<2.5 kg 49例(75.38%)、≥2.6 kg 16例(24.62%)。

二、入選標(biāo)準(zhǔn)

1.診斷標(biāo)準(zhǔn)：符合《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》(第7版)[6]有關(guān)新生兒VAP的診斷標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)機(jī)械通氣治療48h后新生兒發(fā)生肺部炎癥；體溫高于37.5℃，并且經(jīng)呼吸道吸取的分泌物呈膿性，肺部能夠聞及濕啰音，而外周血象白細(xì)胞增多高于10×109/L；胸部X線片檢查，提示肺部存在浸潤性的陰影；支氣管分泌物能夠查及培養(yǎng)出的病原菌。

2.納入標(biāo)準(zhǔn)：住院時(shí)間>48h；機(jī)械通氣時(shí)間>48h；病例資料完整。

3.排除標(biāo)準(zhǔn)：合并嚴(yán)重先心病；存在彌漫性血管內(nèi)凝血功能障礙；多器官功能衰竭；合并血液系統(tǒng)疾病；合并嚴(yán)重外科疾病；出生即存在嚴(yán)重感染性疾病。

三、研究方法

1.資料收集：收集病例VAP患兒一般資料，包含性別、胎齡、日齡、出生體重和機(jī)械通氣時(shí)間、分娩方式、呼吸機(jī)類型等。

2.標(biāo)本采集：所有病例患兒在機(jī)械通氣治療后準(zhǔn)備撤離呼吸機(jī)時(shí)，立刻收集其呼吸機(jī)氣管導(dǎo)管，采用75%酒精擦拭氣道導(dǎo)管外表面以排除導(dǎo)管外表面的細(xì)菌污染，應(yīng)用無菌生理鹽水仔細(xì)沖洗導(dǎo)管以排除浮游菌和其他非生物膜部分。剪下導(dǎo)管末端約2cm，放置于PBS緩沖液5 mL中，渦旋振蕩2min后在100Hz的超聲處理20min后，再次應(yīng)用旋渦振蕩2min以稀釋氣管導(dǎo)管表面的生物膜，對(duì)處理后的樣本，平均分為2份(分別用于生物膜細(xì)菌 DNA 提取和細(xì)菌培養(yǎng))。

3.生物膜細(xì)菌 DNA 提取：應(yīng)用Takapa細(xì)菌DNA提取試劑盒對(duì)生物膜細(xì)菌中DNA進(jìn)行提取，操作步驟：將保存好的生物膜處理液在高速離心(12000rpm/2min)后丟棄上清液，而后加500μl的Buffer BS重懸細(xì)菌胞體，加入50μl的20mg/mL Lysozyme并充分混勻，37℃水浴1h(每隔15min混勻一次)，在上述液體中加200μl的Buffer GB及200μl無水乙醇充分混勻。將Spin Column置于Collection Tube上，把上步混勻后的液體轉(zhuǎn)移至SpinColumn 中，以 12000 rpm 離心 2 min，棄去濾液。在Spin Column中加入500 μl的Buffer WA，經(jīng)12000 rpm 離心1 min后丟棄去濾液。在Spin Column中沿其管壁四周加700 μl Buffer WB，經(jīng)12000 rpm 離心1min后，棄去濾液。將Spin Column置于EP管上，懸空于Spin Column膜中滴加30μl Elution Buffer，在室溫下靜置5min。12000 rpm 離心 2 min 以洗脫膜上的DNA。將獲得的DNA原液置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4.基因檢測(cè)：將所得的細(xì)菌DNA原液于冰上解凍，2μl于NanoDrop2000 上檢測(cè)濃度和純度，據(jù)此將所有待測(cè)樣本濃度均一以行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。16s rRNA 基因V3-V4區(qū)PCR分為兩個(gè)部分，首先是對(duì)待測(cè)標(biāo)本進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，預(yù)實(shí)驗(yàn)成功后進(jìn)一步行帶有Barcode測(cè)序接頭引物行PCR。16s rRNA基因V3-V4區(qū)普通PCR的引物如下：上游引物338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′；下游引物806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性3min，95℃變性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸45sec，72℃終末延伸10min，共循環(huán)27次。同時(shí)進(jìn)行Miseq 高通量測(cè)序檢測(cè)，經(jīng)過PCR檢測(cè)后，DNA片段得到擴(kuò)增形成DNA簇，再將這些擴(kuò)增產(chǎn)物線性化形成單鏈DNA，加入帶4種熒光標(biāo)志的dNTP和特殊的DNA聚合酶，使每個(gè)循環(huán)只合成一個(gè)堿基并檢測(cè)其堿基配對(duì)時(shí)釋放的熒光信號(hào)，讀取序列信息，以獲取模板DNA堿基序列。

5.病原菌培養(yǎng)：對(duì)置入無菌容器內(nèi)封閉保存的標(biāo)本于30min內(nèi)送檢，采用美國BD公司提供的細(xì)菌培養(yǎng)儀(型號(hào)BACTEC9120)進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，借助于全自動(dòng)微生物鑒定儀(美國BD公司，VITEK-2 Compact型)對(duì)病原微生物進(jìn)行鑒定，實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照無菌標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行，并遵循《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第4版)[7]。

6. 質(zhì)量控制：所有納入患兒的病歷資料均源于本院兒科診治的新生兒VAP，日齡均不足28d，患兒所有信息均由資質(zhì)護(hù)士如實(shí)填寫，資料真實(shí)無誤。采用質(zhì)控菌(如肺炎克雷伯菌ATCC 700603和金黃色葡萄球菌ATCC 29213等)進(jìn)行質(zhì)量控制。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS20.0分析研究數(shù)據(jù)，性別和分類等計(jì)數(shù)資料采取例(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，logistic回歸分析氣管導(dǎo)管尖端生物膜中主要菌群分布與新生兒VAP發(fā)生的關(guān)系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、呼吸機(jī)治療新生兒的流行病學(xué)分析

65例新生兒VAP，VAP胎齡<28周、出生體重<2.5kg、機(jī)械通氣時(shí)間>10d、母體妊娠方式為剖宮產(chǎn)、呼吸機(jī)類型為有創(chuàng)占比較高(見表1)。

表1 呼吸機(jī)治療新生兒的流行病學(xué)分析[n(%)]

二、生物膜細(xì)菌DNA中16S rRNA基因V3-V4區(qū)PCR檢測(cè)和測(cè)序結(jié)果分析

本研究65例患者均成功提取細(xì)菌DNA，預(yù)實(shí)驗(yàn)中均成功擴(kuò)增出目的條帶，如圖1所示。

圖1 圖中“1～18”表示目的條帶，均與500bp相接近，“19”為陰性對(duì)照，無條帶

三、65例VAP患兒氣管導(dǎo)管尖端生物膜菌群種類分析

65例VAP患兒共89份氣道導(dǎo)管尖端微生物膜，共分離出菌株71株，分離率79.77%(95%CI：69.66%～88.76%)；其中革蘭氏陰性菌占總檢出的85.92%，銅綠假單胞菌占比32.39%、肺炎克雷伯桿菌占比28.17%，而革蘭氏陽性菌占總檢出的14.08%，鏈球菌占比5.63%(見表2)。

表2 65例VAP患兒氣管導(dǎo)管尖端生物膜菌群種類分析

四、不同特征VAP患兒氣管導(dǎo)管尖端生物膜菌群主要種類分布比較

不同特征VAP患兒氣管導(dǎo)管尖端生物膜菌群主要種類分布概率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表3)。

表3 不同特征VAP患兒氣管導(dǎo)管尖端生物膜菌群主要種類分布比較

五、氣管導(dǎo)管尖端生物膜中主要菌群分布與新生兒VAP發(fā)生的關(guān)系分析

采用logistic回歸分析提示導(dǎo)管生物膜銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌和鏈球菌是VAP發(fā)生的獨(dú)立影響因素 (P<0.05)(見表4)。

表4 氣管導(dǎo)管尖端生物膜中主要菌群與新生兒VAP發(fā)生的關(guān)系分析

討 論

新生兒VAP不僅影響機(jī)械通氣治療患兒的臨床效果，甚至威脅患兒生命健康，新生兒 VAP是目前備受關(guān)注的公共健康衛(wèi)生問題[8]。研究發(fā)現(xiàn)在機(jī)械通氣治療期間，呼吸機(jī)氣管導(dǎo)管可為致病菌進(jìn)入原先無菌條件下的氣道和肺部提供了通道，值得注意的是細(xì)菌一旦進(jìn)入呼吸機(jī)氣管導(dǎo)管，則可快速黏附于氣管導(dǎo)管的表面從而形成生物膜，生物膜被視為是細(xì)菌的一種不同于浮游狀態(tài)的復(fù)雜表現(xiàn)形式，主要由細(xì)菌分泌的胞外多糖、蛋白及核酸等形成，其對(duì)抗菌藥物的耐藥性較高[9-10]。文獻(xiàn)報(bào)道超過90.0%機(jī)械通氣患者氣管導(dǎo)管尖端可在一定程度上形成生物膜，而這些附著于呼吸機(jī)氣管導(dǎo)管表面的生物膜一旦受到氣流動(dòng)力影響，可致生物膜脫離氣管導(dǎo)管表面而彌散至下氣道或深部肺組織，是引起新生兒VAP發(fā)病的一項(xiàng)重要影響因素[11]；國外一項(xiàng)研究報(bào)告指出70%生物膜中病原菌的存在與下呼吸道分泌物細(xì)菌相同，說明生物膜的存在或與VAP的發(fā)生有一定關(guān)聯(lián)[12]。而進(jìn)一步明確新生兒VAP患兒氣管導(dǎo)管尖端生物膜菌群變化及其與VAP發(fā)病的關(guān)系，或有助于臨床上更為深入了解新生兒VAP的致病原因。

圖2 樣本稀釋曲線

本次研究結(jié)果65例新生兒VAP，VAP胎齡<28周、出生體重<2.5kg、機(jī)械通氣時(shí)間>10d、母體妊娠方式為剖宮產(chǎn)、呼吸機(jī)類型為有創(chuàng)占比較高，胎齡<28周、出生體重越低的新生兒，機(jī)體發(fā)育尚不成熟，抵抗力相對(duì)較低，在機(jī)械通氣過程中一旦病原菌侵襲發(fā)生VAP的風(fēng)險(xiǎn)高，而機(jī)械通氣時(shí)間越長往往意味著外源性病原菌感染機(jī)會(huì)越高，而呼吸機(jī)有創(chuàng)則預(yù)示著患兒機(jī)體創(chuàng)傷更大，出現(xiàn)感染風(fēng)險(xiǎn)越高，故認(rèn)為出生體重低、機(jī)械通氣時(shí)間長及有創(chuàng)機(jī)械通氣的新生兒更易發(fā)生VAP，與國內(nèi)學(xué)者周艷芳等[13]報(bào)告的基本相符。此外，本結(jié)果還顯示65例VAP患兒氣道導(dǎo)管尖端微生物膜中共分離出菌株71株，分離率高達(dá)79.77%(95%CI：69.66%～88.76%)，其中革蘭氏陰性菌占比85.92%，以銅綠假單胞菌(32.39%)和肺炎克雷伯桿菌(28.17%)較為常見，而革蘭氏陽性菌占比14.08%，以鏈球菌(5.63%)最為常見，與上述周艷芳等報(bào)道的VAP患兒呼吸道分泌物標(biāo)本中病原菌培養(yǎng)結(jié)果顯示的革蘭氏陽性菌以表皮葡萄球菌、糞腸球菌為主而革蘭氏陰性菌則以鮑曼不動(dòng)桿菌等為主的觀點(diǎn)存在差異，說明氣管導(dǎo)管生物膜中病原菌分布有所變化，常規(guī)經(jīng)驗(yàn)用藥并不適用于新生兒VAP治療中。本結(jié)果還證實(shí)不同流行特征VAP患兒氣管導(dǎo)管尖端生物膜菌群主要種類分布概率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，此外進(jìn)一步相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，氣管導(dǎo)管生物膜中銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌和鏈球菌的檢出率與VAP 的發(fā)生存在明顯的關(guān)系，初步提示氣管導(dǎo)管生物膜病原菌群的存在與VAP發(fā)病密切相關(guān)，氣管導(dǎo)管生物膜其內(nèi)的微生物存在多樣性，并且這些微生物間可相互作用促進(jìn)VAP的發(fā)生發(fā)展[14]。研究證實(shí)銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌和鏈球菌常存在氣管導(dǎo)管內(nèi)，其可促進(jìn)細(xì)菌生物膜的形成，各病原菌可相互作用增加毒力[15]，導(dǎo)致新生兒VAP發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著增高。

綜上所述，本次研究初步證實(shí)了新生兒VAP氣管導(dǎo)管尖端生物膜菌群分布特點(diǎn)，并明確了銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌和鏈球菌常存在氣管導(dǎo)管內(nèi)，是促進(jìn)細(xì)菌生物膜形成的關(guān)鍵菌株，在新生兒VAP發(fā)生中起著重要的作用，有望為新生兒VAP防治提供新的靶點(diǎn)。