基于DNA三鏈結構的信號放大型分子邏輯門構建

龐 雪， 楊 靜， 殷志祥， 唐 震，楊新木， 劉聰聰

（1.安徽理工大學數學與大數據學院，安徽淮南232001；2.上海工程技術大學數理與統計學院，上海201620）

三螺旋相互作用在調控基因表達、構建生物傳感平臺的分子開關、識別自然狀態下雙鏈DNA的特定序列以及操縱DNA納米結構等方面發揮著重要作用[1-4].Du Yan[5]等人報道了一種以石墨烯-介孔二氧化硅-金納米粒子雜化物為增強元件，以鏈置換DNA聚合和平行基序DNA三重體系為雙重擴增，構建了一個超靈敏、選擇性檢測DNA的集成傳感平臺.2017年，Li Zou[6]將可實現信號放大的雜交鏈式反應（HCR）和三鏈體形成寡核苷酸（TFO）功能化的納米粒子結合，構建了一個比色傳感平臺，用于測定包括核酸、小分子和蛋白質在內的廣泛靶標.2018年，Li Zou[7]將小檗堿作為三鏈結構檢測劑構建的無標記熒光傳感平臺實現了對H7N9病毒DNA和凝血酶的檢測.

本研究借助HCR和熒光標記技術設計了相關生物模型來模擬邏輯與門和邏輯或門.在邏輯與門的設計中，當且僅當兩個輸入值都為1，即輸入啟動鏈I和TFO時，才會在溶液中檢測到高背景的熒光，此時邏輯輸出值記為1.其中，由于初始數據池中含有小檗堿和處于莖環結構狀態下的H1、H2，啟動鏈首先與H1、H2發生HCR，使得莖環被打開，并且三者之間按照堿基互補配對原則有序結合形成DNA雙鏈；之后TFO與上述HCR產物DNA雙鏈結合形成部分三鏈結構.由于小檗堿具有與三鏈結構結合顯示高背景熒光的特性，因此能在反應后的溶液中檢測到高背景熒光.在邏輯或門的設計中，對初始數據池中處于莖環結構狀態下的H1及H2的兩端都分別進行熒光和猝滅標記處理，此時由于熒光和猝滅兩基團之間彼此靠近，所以溶液僅顯示低背景熒光.而當向數據池中任意加入一個充當啟動鏈角色的輸入時，就會引發三者間的HCR使得H1和H2的莖環結構被打開，熒光與熒光猝滅集團也隨之相互分離，從而溶液中顯示高背景熒光，此時邏輯輸出值記為1.

1 相關生物操作技術

由于生物分子具有納米級的尺度、高特異性的識別和優異的信號傳導能力等優點，1012個DNA分子可以放在同一個試管中；1克DNA分子與1萬億張普通CD的信息存儲能力等價.同時，現代生物技術的發展使得生物分子元件組裝成生物分子計算機成為可能，由此引出以DNA分子作為基本材料的DNA計算.它是一種以分子生物學作為技術基礎，通過構建計算模型來解決計算問題的新型計算法.由于生物分子的高特異性識別能力，使得一次生物計算能同時處理約1018個DNA分子，是現有超級計算機計算速度的105倍；DNA分子通過聚合鏈式反應（PCR）便可達到2n的擴增速度，因此生產大量的DNA分子計算模型所需的成本極低；由于DNA分子計算模型靠分子力和催化劑維持運作，所以其耗能極低，僅相當于普通電腦的十億分之一[8].DNA計算發展過程中融合了大量的分子生物技術，如DNA鏈置換反應、PCR、HCR、熒光標記等.

1.1 HCR

HCR作為信號放大的手段，它不需要酶的參與，操作簡單，易于實現，是DNA計算中常見的生物操作技術.2012年，Chen[9]等利用HCR信號放大技術構建了超靈敏電致化學發光傳感器.2019年，李朦朦[10]基于HCR設計了可以區分6種乙肝病毒耐藥基因的DNA熒光傳感器陣列，該陣列靈敏度高，對耐藥基因的響應范圍為1~20 nm，并且在進行凝膠電泳和熒光檢測的實驗后，驗證了HCR和熵驅動信號放大聯用的可行性.2019年，崔建中[11]等設計了基于HCR的0-1整數規劃問題計算模型，在該模型中褪火在訂書機鏈上的DNA發夾結構被用來表示二叉樹，再通過HCR生成所有的路，設計符合條件的探針并借其逐步篩選出滿足約束條件的路，最終找出最優解.2020年，劉永新[12]等將HCR與納米材料結合實現了對核酸檢測的分析總結.HCR的原理如圖1所示，HCR元件包括兩個部分：引發探針、兩條可雜交互補并帶有黏性末端的發夾型DNA（R1和R2）.當不存在引發探針時，兩條發夾探針R1和R2穩定存在于溶液中.若引發探針存在時，便會觸發HCR開始，于是發夾探針R1與R2被逐次打開，并交替雜交形成一條帶有缺口的DNA長鏈，直到發夾探針R1與R2至少有一方消耗完為止.每一條這樣的引發鏈均可以誘發HCR的發生，形成大量DNA雙鏈作為反應產物，從而達到放大靶標信號的效果，使得檢測更加可行.HCR的優點在于不需要酶的輔助，避免了非特異性擴增對分析結果的影響，反應條件溫和、易控制，等溫條件下經一步反應就可以實現短鏈DNA的擴增，并不需要復雜的儀器設備，且HCR這一信號擴增技術與各類檢測技術都具有較高的兼容性.

圖1 HCR原理圖

1.2 熒光標記技術

熒光標記技術指利用一些能發射熒光的物質共價結合或物理吸附在所要研究分子的某個基團上，利用它的熒光特性來提供被研究對象的信息.生物分子計算領域常常通過檢測標記在基團上的熒光分子的熒光強度相對變化量來做出某種判斷[13].熒光猝滅是使用熒光標記技術過程中的常用輔助，原理為熒光基團與猝滅基團之間產生的熒光能量共振轉移作用，如圖2所示，主要表現是：

圖2 熒光標記技術原理

（1）當熒光基團與猝滅基團相互接近時，兩基團之間的相互作用增強，熒光信號削弱乃至消失；

（2）當熒光基團與猝滅基團相互遠離時，兩基團之間的相互作用減弱，熒光信號得以重新恢復[14].

2 DNA邏輯計算模型

電子計算機中的邏輯門是具有一個或多個輸入但只有一個輸出的電路.不同時刻的輸出狀態由該時刻的輸入狀態決定，所以輸入和輸出之間具有必然的因果聯系，而這種聯系常用邏輯一詞表示.高度特異性識別的堿基互補配對原則使得由四種脫氧核糖核酸排列組合而形成的DNA成為優秀的信息攜帶者，如果將電子計算機中的輸入信號、輸出信號和邏輯門用DNA等生物分子來表示，并在分子水平上進行邏輯操作，那么就稱這樣的電路為分子邏輯門.

2.1 分子邏輯與門

稱“只有當決定一件事情的所有條件都成立時，事件才會發生”這種邏輯關系為與邏輯關系.在有兩個輸入Input A、Input B和一個輸出Output的與門邏輯電路中，其邏輯真值表如表1所示.

表1 邏輯與門真值表

2.1.1 分子邏輯與門電路設計

實驗材料如下：首先設計兩種莖環結構DNA H1和H2，要滿足二者黏性末端都含有DNA識別區域且二者堿基序列互補兩個條件；接著設計一種可識別H1黏性末端的線性單鏈DNA作為啟動鏈I；然后準備TFO，根據Watson-Crick配對原則，雙螺旋結構的DNA鏈形成了一個大溝和一個小溝，TFO可高特異性地結合于雙螺旋DNA富含嘌呤的大溝上[16，17]，由此形成的三螺旋可誘導DNA修復、刺激染色體上同一基因兩個串聯拷貝之間的同源重組[18]；最后準備小檗堿（一種植物的異喹啉生物堿），它在水溶液中幾乎不發熒光，但與三鏈體DNA結合后會顯示出強熒光[19].

在分子與門的設計中，將加入H1、H2和小檗堿的溶液作為初始數據池.在零輸入的情況下，小檗堿本身呈低背景熒光.當有兩個值輸入時，首先啟動鏈與H1、H2發生HCR形成雙鏈DNA，然后TFO與雙鏈結合形成三鏈結構，小檗堿識別并結合三鏈結構以后才會呈現出高背景的綠色熒光.根據溶液中是否能檢測到高背景熒光來判斷輸出結果，反應結束后，若能檢測到高背景的熒光，則輸出結果邏輯值為1，若不能檢測到高背景的熒光，則輸出結果邏輯值為0.邏輯與門的操作如圖3所示.

圖3 邏輯與門操作示意圖

與門對應的結果有四種可能：

（1）Input A=0，Input B=0時，初始數據池中不加入任何物質，小檗堿獨立存在，無高背景熒光.邏輯輸出值為0.

（2）Input A=0，Input B=1時，在初始數據池中加入啟動鏈I，原本在數據池中互不影響的H1、H2由于I的加入打破了原有的平衡，I與H1的黏性末端通過堿基互補配對結合，進而打開H1的莖環結構，隨之而來的是H2的莖環結構被H1打開，如此循環，直至溶液中的H1、H2至少有一方完全消耗，三者間的HCR才宣告結束.與此同時，我們將得到一條類似于交替共聚物的帶切口的雙螺旋DNA.但是由于沒有三鏈結構的存在，小檗堿與雙螺旋結構之間不會發生反應，所以沒有高背景的綠色熒光產生.邏輯輸出值為0.

（3）Input A=1，Input B=0時，在初始數據池中加入TFO，在缺乏啟動鏈的情形下，H1、H2穩定共處，不會形成雙螺旋結構，因此TFO也不會發生任何反應.于是僅僅加入TFO也沒有高背景熒光產生.邏輯輸出值為0.

（4）Input A=1，Input B=1時，在初始數據池中同時加入啟動鏈I和TFO，I與H1、H2發生HCR，形成雙螺旋結構DNA，再與TFO結合生成三鏈結構，此時大量的小檗堿結合到三鏈結構上，在溶液中呈現高背景熒光.只有在此種情況下與門的邏輯輸出值為1.

2.2 分子邏輯或門

稱“若決定一件事情的數個條件中至少有一個發生，則事件就發生”這種邏輯關系為或邏輯關系.在有兩個輸入input 1，input 2和一個輸出的或門邏輯電路中，其邏輯真值表如表2所示.

表2 邏輯或門真值表

2.2.1 分子邏輯或門電路設計

制備兩種具有莖環結構的單鏈DNA H1和H2，二者具有一段互補的堿基序列，且這兩段堿基序列分別作為H1和H2的黏性末端.用熒光猝滅基團修飾H1的3′端和H2的5′端，再用熒光基團修飾H1的5′端和H2的3′端.將它們放置于溶液中作為初始數據池.輸出結果參照反應結束后是否能檢測到高背景熒光，若能檢測到高背景熒光，則邏輯輸出值為1，反之，則邏輯輸出值為0.當不添加任何輸入信號時，H1與H2在溶液中穩定共存，熒光猝滅基團與熒光基團相互接近，溶液無熒光顯示，邏輯輸出值為0.分別制備可識別上述H1、H2黏性末端的兩種DNA單鏈作為Input 1和Input 2.不論是僅輸入Input 1、僅輸入Input 2還是同時輸入Input 1和Input 2，都會有引發鏈與H1或H2的HCR發生，從而H1和H2的莖環結構被打開，原本靠近的熒光基團與熒光猝滅基團相互分離，進而溶液中有高背景的熒光顯示.此時邏輯輸出值為1.邏輯或門的操作過程如圖4所示.

圖4 邏輯或門操作示意圖

2.3 模型分析

基于HCR擴增和DNA三鏈體自組裝，并使用經濟高效的小檗堿作為三鏈體指示劑，構建了邏輯與門.在輸入啟動鏈的情況下，首先會發生HCR，打開初始數據池內兩種發夾DNA的莖環結構，產生了帶切口的DNA雙螺旋長鏈；此時，若溶液中存在TFO，則其會識別HCR產物并與之形成DNA三鏈結構，由于HCR擴增使得TFO與產物結合生成三鏈結構的概率變大，此為一次信號放大.由于三鏈結構的存在，溶液中大量的自帶低背景熒光的小檗堿將自主結合到三鏈結構上，轉而釋放高背景熒光信號，使得實驗結果的檢測更加靈敏，此為二次信號放大.此方法沒有使用染料標記核酸或嵌入雙鏈DNA的熒光染料，而采用經濟高效的小檗堿，這使得實驗成本大大降低；此外生物操作過程簡單無標記，兩次信號放大使得結果不僅容易檢測且靈敏度高.由于小檗堿對于三鏈結構高度選擇性的響應，因此該方法在復雜的生物介質中具有巨大的潛力，為聯合等溫核酸擴增技術和無標記的熒光探針打開大門.

3 結論

首先，本文設計了啟動鏈和TFO作為輸入信號，利用HCR擴增和DNA三鏈體自組裝，并借助小檗堿來檢測三鏈結構，通過反應前后熒光強度對比來判斷邏輯結果，實現了邏輯與門的構建.然后，本文利用HCR會打開發夾DNA的莖環結構，使得原發夾DNA上相互靠近的猝滅基團與熒光基團分離，同樣通過反應前后熒光強度對比來判斷邏輯結果，構建了邏輯或門.雖然上述方法在操作上簡單易行，實驗結果也相對易于檢測，但用上述方法實現或非門、與非門級聯來構建完整的邏輯電路還有許多不足和改進之處，這也是我們下一步的研究目標.