污泥和生長素添加對草地早熟禾生長及土壤微生物的影響

曹允馨，張寧，常智慧

(北京林業大學草業與草原學院，北京 100083)

污泥是污水處理廠凈化處理污水時產生的不包括柵渣、浮渣和沉砂池沙礫的廢棄物[1]。污泥不僅可以提高植物氮素和水分利用效率，促進其在干旱條件下的生長[2-4]，而且可以提高土壤的生物和化學性質，促進土壤微生物的活性[5-7]，增加土壤中細菌和放線菌的數量[8-9]。

污泥中富含多種生物活性物質[10-11]，這是污泥對微生物產生影響的原因，如含有作為酶促底物的有機碳、有機氮[12-13]等可以促進土壤微生物生長和分泌各種酶[14]。研究表明施入污泥可以提高土壤酶活性[15]；污泥復混肥可以增加硝化細菌和好氣性纖維素分解細菌數量，提高放線菌和氨化細菌的活性[16]。此外污泥堆肥也可以顯著提高微生物量碳氮和土壤微生物量[12,17]，增加土壤中一些酶如脲酶、過氧化氫酶等的含量，從而改善土壤結構[18-20]。

微生物以污泥中的生物活性物質為基質，可以產生并向土壤中釋放激素[21]。許多獨立生長的微生物都可以合成植物激素，如生長素、赤霉素、類激動素物質等[22]。因此，污泥可以通過影響微生物，間接影響植物生長。吲哚-3乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)是天然植物生長素的主要活性成分[23]。近年來發現的與生長素合成相關的重要催化酶系和克隆的關鍵調控基因多數通過依賴色氨酸(Trp-dependent pathway)合成途徑合成[24]。此外，在植物體內還存在其他生長素，如吲哚丁酸(indole-3-bu- tyric acid,IBA)和4-氯吲哚-3-乙酸(4-chloroindole- 3-acetie acid,4-CI-IAA)等[25]。有研究表明，吲哚乙酸與吲哚丁酸的生理功能相似，但吲哚乙酸在植物體外易降解。與吲哚乙酸相比，吲哚丁酸不易被光分解，比較穩定[22,24]。

草地早熟禾(Poapratensis)是一種優質的冷季型草坪草，適應性廣、綠期長，坪質優美，是我國北方地區常用的建坪草種[26]。但草地早熟禾具有生長緩慢、抗旱性不強的特性，影響其坪用質量和效率[27]。本試驗用硝酸銨與污泥提供等量氮素，研究干旱脅迫下污泥和生長素對草地早熟禾生長和土壤微生物的影響，觀察草地早熟禾的耐旱性，探究污泥提高草地早熟禾抗旱性的機理。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗所用草種是草地早熟禾品種午夜，播種量為15 g/m2；基質是煅燒黏土(profile products，Chicago)，經800℃高溫煅燒，不含任何營養物質；污泥取自北京某污水處理廠，其含水量為84.7%，pH值為5.36，全氮含量66.6 mg/g，磷含量68.9 mg/g，鉀含量13.3 mg/g，有機質含量72.6%，腐殖酸含量40.0%。試驗所用氮肥是硝酸銨溶液與污泥，除氮素外的營養物質由無氮霍格蘭營養液提供。

1.2 污泥中草地早熟禾可利用的有效氮含量測定

試驗處理分為施用污泥和不施用污泥兩類，為保證所有處理能為草地早熟禾提供等量的有效氮素，需要用幾個梯度濃度的硝酸銨溶液和一定量的污泥處理草地早熟禾以測定污泥中的有效氮含量。

試驗在光照培養箱中進行，日/夜溫度為24℃/18℃，光照14 h，光強600 μmol/(m2·s)。采用直徑16 cm，深10 cm 的聚乙烯塑料盆，每盆裝0.7 kg 煅燒黏土。播種前澆水，使每盆的土壤含水量達到90%田間持水量。

試驗采用隨機區組設計，設6個處理：1)對照；2)25 mg/kg氮素；3)50 mg/kg氮素；4)75 mg/kg氮素；5)15 g未添加色氨酸的污泥(UB)；6)15 g添加20 μmol/g色氨酸的污泥(TB)。每個處理5次重復。前4個處理利用8 mg/mL 硝酸銨溶液提供氮素(具體添加量根據土重進行換算)，后兩個處理利用污泥提供氮素，硝酸銨溶液分別在播種前、播種15 d、播種30 d 分3次等量加入，污泥在播種前用水調成勻漿加入基質中，混合均勻。

試驗持續8周，全程保持充足的澆水，所有處理用無氮霍格蘭溶液提供除氮素外的其他營養物質。定期修剪，保持草坪草高度為8～10 cm，將每次修剪所得的草屑收集，烘干保存。試驗結束后，將所有地上部分全部收集烘干，與之前收集的樣品合并，采用凱氏定氮法[28]測定各處理草坪草的全氮含量。

利用前4個處理的數據作出氮攝入量Y(mg/盆)和氮施用量X(mg/kg)的標準曲線，并得出線性方程：Y= 0.339 6X+7.058 2(R2=0.942 3)。通過方程計算出未添加色氨酸的污泥的有效氮含量為2.339 mg/g，添加色氨酸的污泥的有效氮含量為2.577 mg/g。而后的試驗中要施用75 mg/kg氮素所需的UB、TB添加量分別為：19.87 g/kg和18.03 g/kg。

1.3 試驗條件

試驗在北京林業大學氣象站溫室進行，日夜溫度約為29℃/17℃，光照時間為13 h，光照強度約600 μmol/(m2·s)。

1.4 試驗設計

采用裂區設計，主處理為水分條件，包括：(1)充分澆水：土壤水分含量保持在90%田間持水量；(2)干旱處理：不澆水，草坪自然干旱，待土壤水分含量降至25%田間持水量時復水，保持90%田間持水量一周。副處理有5個：(1)對照CK；(2)吲哚丁酸處理IBA(2 μmol/L)；(3)未加色氨酸的污泥處理UB(19.87 g/kg)；(4)添加色氨酸的污泥處理TB(18.03 g/kg)；(5)色氨酸處理TRP(360.6 μmol/kg)，每處理4個重復。IBA 的施用量經計算后是0.365 mg/盆(相當于70%田間持水量時濃度為2 μmol/L 的IBA)。色氨酸的用量與TB 處理中的色氨酸含量相等。所有處理的氮施入量為75 mg/kg。污泥在播種前用水調成勻漿均勻混入基質中，IBA、TRP 配成溶液，播種前均勻混入基質中，硝酸銨溶液分別在播種前、播種15 d、播種30 d 分3次等量加入。2016年4月20日播種，在25 cm×25 cm的方形塑料花盆中裝入2.5 kg煅燒黏土，澆透水靜置一段時間后，土表與盆沿距離不超過1 cm為宜。播種前及整個生長期內保持充足的澆水，土壤含水量達到90%田間持水量。

取樣時間分別為：干旱處理組土壤水分含量分別為田間持水量的90%、50%、30%、25%和90%(復水一周后)時，具體時間為7月7日、7月14日、8月3日、8月11日和8月19日。

1.5 測定指標及方法

草坪坪觀質量參考楊燕等[29]的方法，9分制，依據草坪顏色、均一度、蓋度等方面打分，1代表草坪完全死亡，9代表草坪顏色濃綠、稠密、均一，有茂盛的地上莖葉，6代表可接受的最低草坪質量水平[3]；目測草坪葉片測定葉片萎蔫度，從0到100%，0代表葉冠完全，100%代表永久萎蔫；相對含水量采用飽和稱重法[4]。使用Li-6400 光合儀測定草地早熟禾葉片光合速率。微生物總量采用改良后的氯仿熏蒸浸提法[30]測定。土壤微生物群落結構在干旱處理開始前(7月7日)，取干旱脅迫組的各處理的土壤樣品(每個處理3個重復)，送至美吉生物公司做16S rRNA 測序，以測定干旱脅迫開始前不同處理的土壤微生物多樣性。

1.6 數據分析

使用Microsoft Excel 2007 軟件整理原始數據、繪制圖表，用SPSS 20.0對數據進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 污泥和生長素對干旱脅迫下的草地早熟禾生長的影響

2.1.1 坪觀質量 充分澆水條件下，各處理的坪觀質量基本沒有顯著變化，整體來看，兩種污泥處理的坪觀質量高于對照(表1)，污泥處理可以顯著提高草地早熟禾的坪觀質量。干旱處理情況下，各處理的坪觀質量隨土壤含水量的下降而下降，復水一周后顯著恢復。干旱期間，IBA處理與空白對照的坪觀質量無顯著差異，TRP、UB和TB 處理可以顯著降低干旱對草地早熟禾坪觀質量的損傷。

表1 2種水分條件下草地早熟禾的坪觀質量

2.1.2 葉片相對含水量 充分澆水條件下，純污泥處理的葉片相對含水量在試驗過程中無顯著變化，CK、IBA、TB和TRP處理均在8月3日顯著上升，之后無顯著變化(表2)。 單獨施用IBA和TRP只能在試驗前期提高草地早熟禾的葉片相對含水量，而施用兩種污泥能顯著提高草地早熟禾葉片的相對含水量(P<0.05)。

表2 2種水分條件下草地早熟禾葉片的相對含水量

干旱脅迫條件下，各處理葉片相對含水量均從脅迫之初開始一直顯著下降，復水一周后顯著回升。干旱處理期間，4個處理的葉片相對含水量均顯著高于對照(P<0.05)，IBA、UB、TB和TRP處理都能在干旱脅迫下減緩草地早熟禾葉片相對含水量的下降，UB、TB 和TRP 對葉片相對含水量的影響比IBA 處理更顯著。

2.1.3 葉片萎蔫度 充分澆水條件下的各處理葉片萎蔫度無顯著變化。干旱脅迫下，各處理的葉片萎蔫度都隨著土壤水分含量的下降而顯著上升，復水后顯著下降(表3)。干旱處理期間，IBA、UB、TB 和TRP處理的葉片萎蔫度都顯著低于對照(P<0.05)。復水一周后，對照組的葉片萎蔫度仍然顯著高于其他處理(P<0.05)。說明，IBA、UB、TB 和TRP 處理均能在干旱脅迫下緩減草地早熟禾的萎蔫，且在復水后可以加快草坪草的恢復速度。

表3 干旱脅迫下草地早熟禾葉片的萎蔫度

2.1.4 光合速率 充分澆水條件下，各處理的光合速率在試驗過程中均無明顯變化(表4)，污泥處理和激素處理都可以顯著提高草地早熟禾的光合速率。試驗后期，UB、TB 和TRP 處理的光合速率顯著高于IBA(P<0.05)，說明在試驗后期，UB、TB 和TRP 對草地早熟禾的光合速率的影響比IBA 處理更顯著。

表4 2種水分條件下草地早熟禾葉片的光合速率

干旱脅迫下，所有處理的光合速率均隨著土壤水分含量的下降而降低，在8月11日達到最低，8月19日(復水一周后)有所回升。與對照相比，TRP、UB 和TB 處理能顯著提高干旱脅迫下草地早熟禾的光合速率，IBA也可以提高其光合速率，但差異不顯著，總體上污泥處理的影響比激素處理更顯著。

2.2 污泥和生長素對干旱脅迫下的草地早熟禾土壤微生物的影響

2.2.1 土壤微生物量碳 充分澆水條件下，處理間微生物量碳的關系為UB、TB>IBA、TRP>CK，IBA、TRP、UB和TB處理在充分澆水條件下都能夠提高土壤微生物量碳，但污泥處理的影響比激素處理更顯著。

干旱處理下，各處理的土壤微生物總量均在8月11日(土壤水分含量降至25%田間持水量)顯著下降(P<0.05)，又在復水一周后顯著回升，且與對照差異顯著(P<0.05)。在干旱脅迫下，IBA和TRP處理均能顯著提高土壤微生物量碳，UB和TB處理也能顯著提高土壤微生物量碳的含量，且效果明顯優于IBA和TRP處理。

2.2.2 土壤微生物生物多樣性 稀釋性曲線[31]用來比較測序數據量不同的樣本中物種的豐富度，也用來說明樣本的測序數據量是否合理。

Shannon-Wiener反映樣本中微生物多樣性的指數[32]，以此反映各樣本在不同測序數量時的微生物多樣性。由圖1和圖2可知，本試驗的數據量是合理的。

表5 2種水分條件下草地早熟禾土壤的微生物量碳

圖1 稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curve

圖2 Shannon-Wiener 曲線Fig.2 Shannon-Wiener curve

此外，Shannon指數越高代表生物多樣性越高。充分澆水條件下，UB 處理的土壤微生物多樣性顯著高于CK、IBA 和TRP 處理(P<0.05)，CK 顯著高于IBA和TR 處理(P<0.05)，UB 和TB處理間無顯著差異(圖3)。

圖3 污泥和生長素處理下草地早熟禾土壤微生物多樣性Fig.3 Effects of biosolids and auxin on soil microbial diversity of Kentucky bluegrass

2.2.3 土壤微生物種群結構 Venn 圖[33]用于統計多個樣本中所共有和獨有的OTU 數目，即菌種數目。大部分的菌種是所有處理及對照所共有的，此外每個處理還有一定數量的特有的菌種，其中兩種污泥處理所特有的菌種最多，遠高于其他處理，而兩種激素處理所特有的菌種低于對照(圖4)。由此表明添加污泥(UB 和TB)能夠提高水分充足條件土壤微生物的豐度。

圖4 污泥和生長素處理下草地早熟禾土壤微生物豐度Fig.4 Effects of biosolids and auxin on soil microbial abundance of Kentucky bluegrass

LEfSe[34]分析結果中，從內到外的5個圓圈分別代表門、綱、目、科、屬5個分類學水平，每個圓圈上的彩色點代表在該分類水平上該顏色所代表的處理組中的對樣本劃分具有顯著差異影響的類群。圖5中，紫色、藍色、綠色和紅色分別代表TB、UB、IBA 處理和CK。由圖可以看出，紫色所覆蓋的范圍遠大于藍色，藍色覆蓋的范圍大于紅色和綠色，這說明TB 和UB 處理的土壤微生物豐度明顯高于CK 和IBA 處理。已知類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)中的一些菌種能夠刺激植物的生長[35]，通過對每個處理的單樣本多級生物組成分析，可以找出各處理的土壤中類芽孢桿菌的含量百分比，如圖6，TB 處理中的類芽孢桿菌含量顯著高于CK 和TRP 處理(P<0.05)，IBA 和UB 處理的類芽孢桿菌含量高于CK，低于TB 處理，但差異不顯著。

圖5 污泥和生長素對草地早熟禾土壤微生物豐度(顯著差異物種)的影響-Lefse 分析Fig.5 Effects of biosolids and auxin on soil microbial abundance(significantly different species)of Kentucky bluegrass using Lefse analysis

圖6 污泥和生長素處理下土壤中類芽孢桿菌含量Fig.6 Effects of biosolids and auxin on the abundance of Paenibacillus in soil

PCoA[32]是一種研究數據相似性或差異性的可視化方法，Unifrac PCoA 基于進化距離，在進化水平上挖掘影響樣品群落組成差異的潛在主成分。PC1 和PC2 代表對于兩組樣本微生物組成發生偏移的疑似影響因素，PC1的值為43.96%，表示X 軸的差異結果可以解釋全面分析結果的43.96%，PC2的值為14.03%，表示Y 軸的差異結果可以解釋全面分析結果的14.03%(圖7)。

CK 與其他處理的微生物群落結構均存在差異，UB 和TB 處理的差異較小，IBA 與TRP 處理的差異較小，但可能UB 和TB 與CK 的差異較IBA 與TRP 的差異更大(圖7)。

圖7 污泥和生長素處理下草地早熟禾土壤微生物群落結構Fig.7 Effects of biosolids and auxin on the structure of soil microbial community in Kentucky bluegrass

2.3 土壤中特征微生物

Heatmap[36]直觀地將數據值的大小以定義的顏色深淺表示出來。將高豐度和低豐度的物種分塊聚集，通過顏色梯度及相似程度來反映多個樣本在各分類水平上群落組成的相似性和差異性。

根據圖8中的色塊可以找出一些細菌如小單孢菌屬(Micromonospora)、鏈霉菌屬(Streptomyces)和紅球菌屬(Rhodococcus)等，在添加污泥的處理(UB 和TB)與未添加污泥的處理(IBA、TRP 和CK)中的含量相差很明顯，對上述3個菌種在樣品中的數量進行比較(表6)，UB 和TB 處理中的小單孢菌和鏈霉菌細菌數量均顯著高于CK、IBA 和TRP 處理(P<0.05)，UB 處理中的紅球菌數量顯著高于其他處理(P<0.05)。

圖8 污泥和生長素對草地早熟禾土壤微生物群落結構的影響-Heatmap 圖Fig.8 Heatmap showing the effects of biosolids and auxin on soil microbial community structure of Kentucky bluegrass

表6 草地早熟禾土壤中幾種微生物的含量

3 討論

3.1 污泥對干旱條件下草地早熟禾的生長及抗旱性的影響

施用污泥能在干旱脅迫下顯著降低草坪草坪觀質量和葉片萎蔫度，有效緩解光合速率、葉片相對含水量的下降，使草地早熟禾在干旱脅迫下仍能維持較高的生長勢。研究表明，施用污泥能夠提高高羊茅的坪觀質量、葉片相對含水量和葉綠素含量[2]，加快干旱脅迫復水后坪觀質量的恢復速率，在干旱脅迫下，污泥與無機肥料混合施用比單獨施用污泥更利于減緩干旱對坪觀質量造成的損傷[3]。在本試驗中，干旱脅迫下，UB、TB和TRP處理可以減緩坪觀質量的下降，UB和TB比TRP對改善草地早熟禾的坪觀質量有更顯著的影響，與前人研究結果一致。UB和TB處理在水分充足或是干旱脅迫下都可以提高草地早熟禾的光合速率，Zhang等[9]的研究表明污泥能夠提高高羊茅的光合速率，與本試驗研究結果一致。

本試驗中，在兩種水分條件下，4種處理對草地早熟禾葉片相對含水量均有顯著提高的效果，且UB和TB處理的表現優于IBA和TRP處理。干旱脅迫下，UB、TB和TRP處理均能減輕草地早熟禾葉片的萎蔫程度，干旱結束復水后，IBA、TRP、UB和TB處理還能加快草坪草的恢復，韓朝等[2]的研究也表明污泥能夠在重度干旱脅迫下降低高羊茅的葉片萎蔫度，與本試驗的結果一致。

3.2 污泥和生長素對土壤微生物數量和種群結構的影響

添加污泥能夠顯著提高土壤微生物量碳，增加微生物群落多樣性。本試驗中，UB和TB處理能夠顯著增加草地早熟禾土壤中的微生物量碳，且比IBA和TRP處理對其提高的幅度更大，在微生物群落結構的分析中也顯示，UB和TB處理的土壤微生物多樣性、微生物豐度明顯優于對照，在群落結構上與CK存在一定的差異。已有的研究表明污泥的施用能夠增加土壤微生物量碳，提高土壤微生物活性、增加土壤微生物群落功能多樣性指數，這與本試驗結果一致[37-39]。

有研究表明，施用污泥堆肥一段時間后可，土壤中的綠彎菌門(Chloroflexi)細菌成為優勢菌[40]，這種菌是絲狀菌，可以降解大分子有機物[41-42]，本試驗中，通過對單樣本多級物種組成的分析可知UB、TB和TRP處理均提高了土壤中綠彎菌門的數量。所以污泥中的豐富的營養物質可能會為微生物創造更適宜的條件而增加其總量與多樣性。超過80%從根際分離的細菌都可以合成IAA[43-44]。所以微生物量碳及群落結構的多樣性提高可能意味著為植物提供生長素的能力提高。

4 結論

試驗以污泥和生長素為主要影響因素，探究干旱脅迫下，污泥對草地早熟禾生長和土壤微生物的影響，旨在從植物生長和微生物層面，找到污泥提高草地早熟禾耐旱性的原因。污泥提高草地早熟禾的抗性可能是改變了土壤中微生物的數量和種類，促進了土壤微生物的生長，提高了土壤酶活性和生長素水平，改善了土壤結構，從而促進了草地早熟禾的生長代謝。在污泥中加入色氨酸比單獨施用污泥或色氨酸對草坪草的耐旱性能產生更顯著的影響，說明污泥提高微生物多樣性的效應與增加生長素前體色氨酸含量的效應疊加，可以為草坪草提供更多的激素營養，以促進其生長并改善耐旱性。這為生物污泥的再利用提供了新的思路。