芒萁黃酮類物質成分鑒定及體外抗氧化活性研究

歐陽可凡，王文君

(1.南昌大學食品學院，江西 南昌 330031；2.江西農業大學食品科學與工程學院，江西 南昌 330045)

芒萁(Dicranopterispedata)，真蕨目里白科芒萁屬植物，是亞熱帶紅壤丘陵區次生植被的標志種和識別種，廣泛分布于中國長江以南各省及東南亞地區[1-2]。因其耐旱耐瘠耐酸、繁殖生長能力極強，在保護南方紅壤侵蝕區水土流失起著重要作用[3-4]。由于芒萁莖葉剛韌且粗糙，不易消化吸收，適口性較差[5]，通常不做飼草用，而被視做生態草、觀賞草、能源草，同時也可做為工業草提取天然色素或做為藥用草。據記載，芒萁可全株入藥，有瀉火利尿、止血化瘀的功效[6]。芒萁含黃酮、皂苷及多糖類等活性成分，具有很強的抗氧化、抗菌、抗癌活性，對帕金森病也有一定的療效[7-10]。黃酮是一種植物次生級代謝產物，在人體中無法合成，僅可通過食物攝入。因其優異的抗氧化活性，能夠起到預防心腦血管疾病、抗癌等作用[11]。經測定芒萁中黃酮的含量高達13%以上[7]，比紅豆草和小冠花等豆科牧草的黃酮含量(0.46%～1.70%)[12]要高得多。目前，芒萁在我國雖然分布極廣，產量也極為巨大，但芒萁黃酮的保健功效和藥理作用并未受到人們的關注。本研究采用超聲波法輔助法提取芒萁黃酮，分析其總黃酮的含量，并對其成分進行鑒定，進而探討了其體外抗氧化活性，以期為進一步開發利用芒萁這一南方地區常見藥用草提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試芒萁于2020年7月采摘于江西省贛州市寧都縣翠微峰國家森林公園。蘆丁標準品、異槲皮苷標準品、木犀草素-5-O-葡萄糖苷標準品、阿福豆苷標準品：分析純，北京Solarbio科技有限公司；聚酰胺樹脂：30-60目，國藥集團化學試劑有限公司；乙腈、甲醇：色譜純，TEDIA USA；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：純度≥97%，東京化成工業株式會社；2,2′-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、鹽酸、過氧化氫、硫酸亞鐵、硝酸鋁、水楊酸、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、維生素C、無水乙醇、過硫酸鉀等：分析純。

1.2 試驗儀器

粉碎機：XM-800Y型，永康市鑫之鴻電器有限公司；數控超聲波清洗器：KQ-250DE型，昆山市超聲儀器有限公司；酶標儀：M2型，美國Molecular Device公司；有機相微孔濾膜：0.22 μm，Millipore USA；冷凍干燥機：Scientz-10N，寧波新芝生物科技股份有限公司；液相色譜儀：Agilent 1260 Infinity，Agilent USA；數顯恒溫攪拌循環水箱：HH-60型，國華儀器制造有限公司；電子天平：AUY220型，日本京都島津制作所；循環真空水泵：SHZ-D(Ⅲ)型，鞏義市子華儀器有限責任公司；旋轉蒸發儀：N-1100型、油浴鍋：OSB-2100型，上海愛朗儀器有限公司；低速離心機：TD4型，上海盧湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 芒萁黃酮的提取與純化

1.3.1 芒萁黃酮粗提物制備 取其地上部位莖葉，剪碎并于60℃干燥后進行粉碎，過60目篩后密封保存。芒萁黃酮粗提物采用超聲波輔助提取法提取[7]，取芒萁莖葉粉末5.0 g、與50%乙醇500 mL加入錐形瓶中混合，超聲處理20 min，溫度50℃，功率125 W；采用85℃恒溫水浴90 min，4 000 r/min離心10 min后過濾，于60℃下進行真空減壓濃縮至原體積的30%；冷凍干燥后保存備用。

1.3.2 芒萁黃酮的分離純化 采用乙醇梯度洗脫法，根據文獻[13]略作修改：活化聚酰胺樹脂后，取適量芒萁粗提物，用蒸餾水配制成濃度25 mg/mL的試樣液，緩慢添加進層析柱上端，吸附時間為2 h。采用4個濃度梯度(0%、30%、50%、70%)的乙醇溶液進行梯度洗脫，流速為1.5 mL/min，洗脫至解吸液無明顯顏色即換用更高濃度。收集各梯度醇洗液，于60℃減壓濃縮后冷凍干燥，最終得到水洗物、30%、50%、70%醇洗物。

1.3.3 蘆丁標準曲線制作 稱量蘆丁標準品10.0 mg，用50%乙醇配制成0.2、0.1、0.05、0.025、0.012 5、0.006 25 mg/mL的標準液，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法，于510 nm波長下測定其吸光度(A值)，并制作標準曲線。采取最小二乘法進行線性回歸，得到回歸方程：Y=0.380 82A+0.019 67，R2=0.999 87，線性范圍為0～0.02 mg/mL(圖1)。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

1.3.4 芒萁黃酮含量的測定 分別取2 mg上述芒萁黃酮粗提物及不同梯度乙醇洗脫物，以50%乙醇溶解后定容至10 mL容量瓶中，按1.3.3的方法測定其黃酮濃度，并計算總黃酮含量。

式中：W為總黃酮百分含量，%；C為總黃酮濃度，mg/mL；M為樣品質量，mg。

1.4 芒萁黃酮成分分析

采取HPLC法進行分析。分別取適量的芒萁黃酮粗提物和各濃度梯度醇洗物經甲醇溶解、有機濾膜(0.22 μm)過濾后采用C18色譜柱(4.6 mm×250mm，5 μm)，以乙腈(α)- 0.4%乙酸超純水(β)系統為流動相，梯度洗脫(0～15 min，10%～25% α；15～30 min，25%～40% α；30～40 min，40%～50% α)，進樣量10 μL，流速1.0 mL/min，波長254 nm，柱溫40℃。

將粗提物HPLC圖譜各峰的峰面積數據代入標準品標準曲線，得到單體組分濃度，并計算黃酮單體組分百分含量。

式中：W為單體組分百分含量，%；C0為粗提物濃度，μg/mL；C1為單體組分濃度，μg/mL。

1.5 芒萁黃酮體外抗氧化試驗

1.5.1 芒萁黃酮清除羥基自由基(·OH)能力試驗 根據文獻[14]修改如下：于10 mL離心管中加入2 mL FeSO4(6 mmol/L)，2 mL試樣，2 mL過氧化氫(6 mmol/L)，2 mL水楊酸-乙醇(6 mmol/L)，恒溫水浴處理20 min (37℃)，以蒸餾水為參考，于510 nm處測定吸光度。試樣為不同濃度的(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL)芒萁純化黃酮溶液或Vc溶液。重復3次。

采用以下公式計算·OH清除率。

式中：A0為空白對照的吸光度，A1為加入供試品的吸光度，A2為不加入水楊酸-乙醇溶液的吸光度。

1.5.2 芒萁黃酮清除ABTS+能力試驗 參考文獻[15-16]的方法：稱取ABTS粉末5.0 mg于離心管，按照文獻[17]配制成ABTS+工作液。于4 mL離心管中按順序添加1 mL 80%乙醇，1 mL ABTS+工作液，搖勻，避光靜置30 min，于734 nm下測定吸光值A0。于4 mL離心管中按順序添加0.25 mL不同濃度(20、40、60、100、200、400 μg /mL)的芒萁純化黃酮溶液或Vc溶液，0.75 mL 80%乙醇，1 mL ABTS+工作液，搖勻，避光靜置30 min，于734 nm下測定吸光值A1。重復3次。

采用以下公式計算ABTS+清除率。

式中：A0為空白對照的吸光度，A1為加入供試品的吸光度。

1.5.3 芒萁黃酮清除DPPH自由基能力試驗 參考文獻[14]的方法：于4 mL離心管中按順序添加2 mL的DPPH-乙醇溶液(0.1 mmol/L)，2 mL濃度遞增的芒萁純化黃酮溶液(10、15、20、30、40、60 μg/mL)，避光反應0.5 h，以70%乙醇為參考，于517 nm測定其吸光度。試樣為不同濃度的(10、15、20、30、40、60 μg/mL)芒萁純化黃酮溶液或Vc溶液。重復3次。

采用以下公式計算DPPH自由基清除率。

式中：A0為空白對照的吸光度，A1為加入供試品的吸光度，A2為不加入DPPH-乙醇溶液的吸光度。

1.5.4 統計分析 采用Origin 2019軟件繪圖，采用SPSS 21.0進行t檢驗分析并計算其半抑制濃度IC50值。

2 結果與分析

2.1 芒萁黃酮提取率及芒萁黃酮純化物的黃酮含量

本試驗通過超聲波輔助提取法得到了芒萁黃酮粗提物(CEE)，黃酮提取率為13.42%。采用乙醇梯度洗脫法對芒萁黃酮粗提物進行分離純化，分別獲得了水洗物(WE)、30%醇洗物(30%EE)、50%醇洗物(50%EE)、70%醇洗物(70%EE)。粗提物和不同梯度洗脫物黃酮含量測定結果見圖2。以50%EE的黃酮含量最高，可達76.25%，其次為30%EE、CEE、WE，70%EE的黃酮含量最低，僅為2.37%。

圖2 芒萁黃酮粗提物和不同梯度乙醇洗脫物的總黃酮含量Fig.2 Total flavonoid content of CEE and different ethanol eluates注：CEE：粗提物；WE：水洗物；30%EE：30%醇洗物；50%EE：50%醇洗物；70% EE：70%醇洗物

2.2 芒萁黃酮HPLC圖譜及分析

芒萁黃酮粗提物和各醇洗物的HPLC圖譜見圖3。除70%EE組分的HPLC圖無明顯峰外，無論是粗提物還是各洗脫物的各峰分離效果都較好，雜峰較少，其純化前后圖譜各峰出峰時間并無明顯差異。芒萁黃酮3個明顯峰分別對應混合對照品中的異槲皮苷標準品、木犀草素-5-O-葡萄糖苷標準品、阿福豆苷標準品。

圖3 芒萁黃酮HPLC圖Fig.3 HPLC chromatogram of flavonoids from Dicranopteris pedata注：A：CEE(粗提物)；B：WE(水洗物)；C：30%EE(30%醇洗物)；D：50%EE(50%醇洗物)；E：70% EE(70%醇洗物)；F：標準品

通過各標品標準曲線(表1)計算，可得芒萁粗黃酮中所含有的3種黃酮類化合物含量分別為：異槲皮苷0.856%、木犀草素-5-O-葡萄糖苷1.462%、阿福豆苷2.155%。

表1 黃酮標準品線性關系

2.3 芒萁黃酮體外抗氧化試驗結果

本研究選擇了黃酮純度最高的50%EE進行試驗，以評價芒萁黃酮的抗氧化能力。

2.3.1 芒萁黃酮對羥基自由基的清除能力 當濃度較低(< 200 μg/mL)時，芒萁黃酮的·OH清除能力略強于Vc，但是隨著濃度遞增，達到400 μg/mL及以上時，Vc的抑制效果明顯好于芒萁黃酮。芒萁黃酮、Vc對羥基自由基的IC50值分別為：1 079.01、301.02 μg/mL(圖4)。

圖4 芒萁黃酮與Vc對羥基自由基的清除率Fig.4 Scavenging rate of dicranopteris pedata flavonoids and Vc on hydroxyl free radicals (·OH)注：*表示同一濃度下的值差異顯著(P<0.05)，** 表示同一濃度下的值差異極顯著(P<0.01)，無標志表示同一濃度下的值差異不顯著(P>0.05)，下圖同

2.3.2 芒萁黃酮對ABTS+的清除能力 在本試驗條件下，芒萁純化黃酮對ABTS+自由基的清除率與濃度幾乎呈線性關系。在低濃度時芒箕黃酮對ABTS+自由基的清除效果遠不如Vc，但在400μg/mL的濃度下，芒萁黃酮的清除效果達到Vc的78.01%。如劑量再提高，有可能會進一步縮減兩者的差距。芒萁黃酮、Vc對ABTS+自由基的IC50值分別為248.74、40.34 μg/mL(圖5)。

圖5 芒萁黃酮與Vc對ABTS+自由基清除率Fig.5 Scavenging rate of Dicranopteris pedata flavonoids and Vc on ABTS+

2.3.3 芒萁黃酮對DPPH自由基的清除能力 芒萁黃酮對DPPH自由基的清除率同樣也存在劑量依賴，隨濃度增加清除率提高較快，近線性關系。芒萁黃酮、Vc對DPPH自由基的IC50值分別為50.14、2.74 μg/mL(圖6)。

圖6 芒萁黃酮與Vc對DPPH自由基清除率Fig.6 Scavenging rate of Dicranopteris pedata total flavonoids and Vc on DPPH free radicals

3 討論

目前，黃酮類化合物已在食品、化工、保健食品等多個行業廣泛應用，是多種醫藥、護膚品、食品添加劑的重要成分[11]。芒萁作為藥用草分布廣泛，根據丁利君等[7]的研究，其全株黃酮含量達到13.56%，是開發和利用黃酮的優質原料[8]。陳少美等[20]發現，不同采集部位對芒萁黃酮成分與含量的影響較大，其中以主根中含量最高(28.06%)，依次是老葉(22.05%)、嫩葉(15.32%)、老莖(9.64%)、嫩莖(5.94%)。本研究以芒萁莖葉為原料，運用超聲波法輔助法提取芒萁黃酮的提取率為13.42%，與上述研究中的莖、葉黃酮含量平均值接近。同時，運用本方法提得的芒萁黃酮得率，遠高于同類方法提取紫花苜蓿(0.64%)、辣木葉(4.89%)的黃酮得率[17-18]，說明芒萁黃酮含量高，較易提取，在生產上具有較好的應用前景。倪再輝等[19]檢測出芒萁中含有蘆丁、槲皮苷、阿福豆苷、槲皮素和山柰酚5種黃酮類物質。毛娟玲等[10]于芒萁純化后的二氯甲烷部分中鑒定出 15 個黃酮類化合物，于正丁醇部分中鑒定出 19 個黃酮類化合物。本研究在芒萁黃酮粗提物和各梯度醇洗物中鑒得阿福豆苷、木犀草素-5-O-葡萄糖苷和異槲皮苷3種黃酮類化合物，其中木犀草素-5-O-葡萄糖苷和異槲皮苷系首次在芒萁中發現。陳少美等[20]認為芒萁不同部位、不同采集時間對黃酮成分與含量影響較大，或為產生差異的原因之一。同時，提取途徑和純化方法的差異也是影響黃酮類物質鑒定的重要因素。

植物源黃酮具有很強的抗衰老和抗氧化能力，在增益機體免疫調節功能、促進人類和家畜健康以及預防慢性病等方面發揮重要作用[21-24]。因其具有抑制并清除活性氧的特性，可用于抵御氧化損傷。其機理是從黃酮類物質骨架上的羥基取代基電離出氫原子，來中和氧自由基，再與已電離的黃酮類物質結合，生成防止逆向結合的雙體[25-26]。丁利君等[7]的研究中發現芒萁的水提液對羥自由基有很好的清除效果，而其乙醇提取液卻不能清除羥自由基。但本研究中純化后的芒萁黃酮能夠很好地清除羥自由基，這與曾偉[27]的研究結果相一致，這可能是純化后黃酮成分與含量不同所致。芒萁純化黃酮在對3種不同自由基的抑制效果上表現出較大差異，推測與其所含成分的協同作用、單體結構有關，芒萁成分與抗氧化活性的構效關系還有待更深層次的探討。

4 結論

本研究通過超聲波輔助醇提法對芒萁莖葉黃酮的提取率為13.42%，純化所得50%醇洗物部分的總黃酮含量最高，達76.25%，主要含有阿福豆苷(2.155%)、木犀草素-5-O-葡萄糖(1.462%)、異槲皮苷(0.856%)3種黃酮類物質。芒萁黃酮清除·OH、DPPH、ABTS+自由基的IC50值分別為：1 079.01、248.74、50.14 μg/mL。表明芒萁黃酮含量高，抗氧化活性優良。