高原鼢鼠陰道涂片HE、瑞氏和快速革蘭氏染色法比較

王艷莉，姚寶輝，譚宇塵，康宇坤，張德罡，蘇軍虎

(1.甘肅農業大學草業學院，草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室，中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農業大學-新西蘭梅西大學草地生物多樣性研究中心，甘肅 蘭州 730070)

陰道涂片法是指對陰道脫落物進行顯微鏡涂片檢查的一種方法，廣泛應用于動物發情周期鑒定及其病理組織學檢測，陰道涂片通常有刮取法和吸取法。刮取法即用玻璃棒或棉簽在陰道內壁輕輕刮一下，把玻璃棒或棉簽在載玻片上涂勻干燥后進行染色，然后在顯微鏡下觀察。吸取法即用細長的吸管或移液槍深入陰道后宮隆處吸取排液，制片染色[1]。因陰道上皮細胞受激素的影響發生周期性的變化，利用陰道細胞涂片檢查能比較確切地反映體內性激素水平及其對陰道上皮的影響，進而反映動物發情狀態[2]。陰道涂片法具有簡單、高效、基本無痛苦且經濟等優點，它是鑒別動物發情常用的一種檢查方法。目前陰道涂片的染色方法主要有HE染色[3]、快速革蘭氏染色[4]、吉姆薩染色[5]、瑞氏染色[6]、巴氏染色法[6]及其改良染色法等。巴氏染色法步驟較繁雜，快速革蘭氏染色雖然步驟簡單，易操作，但辨認細胞需要一定的經驗。吉姆薩染色時間較長，雜質易被染色，導致背景雜亂暗淡，細胞形態不鮮明，清晰度差[5]。HE染色法操作簡易便捷，可快速觀察鑒定動物的陰道上皮細胞，是目前動物發情周期常用的染色方法，在不同的動物上，該方法也有一定的適用性[3]。肖小芹等研究表明實驗樣本量大，判斷小鼠動情周期時，瑞氏染色法更適用；但樣本量小，只檢測小鼠陰道脫落細胞形態等時，巴氏染色法效果更好[7]。也有研究報道，大鼠陰道涂片大規模檢查時，呂氏堿性美籃染色法應用效果顯著[8]。檢驗這些方法在不同物種上的適用性，對物種進一步的研究能提供基礎參考。

高原鼢鼠(Eospalaxbaileyi)隸屬于嚙齒目(Rodentia)，鼴形鼠科(Spalacidae)，鼢鼠亞科(Myospalactinae)，凸顱鼢鼠屬(Eospalax)[9]，是青藏高原高寒草甸生態系統的關鍵種[10]。在人為和自然因素的影響下，鼠害增加，高寒草甸退化加劇[14]。因此，許多研究集中于尋找降低高原鼢鼠種群密度的防治措施[12]，但其在高寒草甸生態系統物質循環和能量流動中所具有的獨特功能和地位不容忽視，有關其數量的管理是關鍵[14]。而掌握高原鼢鼠的繁殖規律是控制其種群數量的有效途徑[15]。孫儒泳等研究表明，高原鼢鼠雌性一般以懷孕率、胎仔數、妊娠率等為繁殖指標，而雄性的繁殖指標一般有平均精巢長(或重量)和儲精囊及其睪丸、附睪的形態變化等[16]。其繁殖周期是從3月底到6月，繁殖周期因氣候條件不同而有所不同[17]。高原鼢鼠常年營地下生活[21]，其繁殖和儲糧行為皆在地下通道完成[18]，難以直接觀察且抓捕困難。鑒于此，陰道細胞涂片法結合外陰觀察更適用于高原鼢鼠發情周期的鑒定，且在其他哺乳動物和小型嚙齒動物上已有應用。國內外已通過陰道細胞涂片法確定了豚鼠(Caviaporcellus)[20]、小鼠(Musmusculus)[21]和子午沙鼠(Merionesmeridianus)[22]等的發情周期。高質量的陰道涂片檢查是準確確定發情周期的前提條件，而適宜的染色方法是高質量陰道涂片的重要保障[5]。高原鼢鼠陰道涂片應用尚不成熟，陰道涂片法判斷發情周期也處于探索階段，為此嘗試多種涂片染色方法。本研究通過野外非損傷活捕，室內飼養的方法，進行了發情周期陰道涂片染色方法的篩選。選用瑞氏、HE和快速革蘭氏3種染色方法，通過比較3種染色方法的陰道細胞涂片效果，旨在為陰道涂片法判斷高原鼢鼠發情周期提供一個簡單、高效的染色方法，以期為高原鼢鼠發情周期的鑒定及其繁殖生物學研究提供基礎資料，同時也為野外防治時機和方法的選擇提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

于2020年5月，在甘肅省武威市天祝藏族自治縣抓喜秀龍鎮用籠捕法隨機抓捕生長發育正常的高原鼢鼠，稱重后按體重來鑒別年齡[23]，根據相關文獻，初步判斷懷孕等狀況[24]，選取性成熟且健康未孕的雌性高原鼢鼠45只，體重147.54～217.75 g/只，平均(164.13±3.02)g/只，利用本實驗室的方法單獨飼養于(20×33×25)cm3的收納箱中，取其生活洞道土為墊料，以其喜食食物紅薯(Ipomoeabatatas)等喂養[25]。

1.2 實驗方法

實驗動物隨機分為3組，每組15只，每天8∶00，18∶00對3組高原鼢鼠分別使用自制棉簽制作陰道涂片。固定高原鼢鼠時一只手固定其頭部，另一只手抓住尾巴固定后腳使其露出陰道口，先用生理鹽水濕潤過的無菌棉簽擦拭陰道口，將蘸濕的棉簽插入高原鼢鼠陰道內0.5～1 cm，輕柔旋轉1～2圈，將棉簽均勻涂在事先滴有生理鹽水的干凈載玻片上，連續20 d。涂片自然風干后滴加甲醇固定10 min。涂片固定好后，分別進行染色。

1.2.1 HE染色 蘇木精染色液中染色5 min，流水沖洗，鹽酸酒精分化數秒，流水沖洗返藍，伊紅染色1 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡檢，觀察細胞的形態及著色[2]。

1.2.2 瑞氏染色 滴加數滴瑞氏染液(染液多少根據涂片面積調整)，瑞化1～3 min(為防止染液干涸，可縮短瑞化時間或及時添加染液)；按比例配制的KH2PO4、Na2HPO4緩沖液(pH=7.0)加染液量的1.5倍，二者混勻等10 min；流水沖洗(玻片平放，水流應緩)，二甲苯透明，自然風干，中性樹膠封片，顯微鏡鏡檢，觀察細胞的形態及著色。

1.2.3 快速革蘭氏染色 快速革蘭氏染色初染，滴加50 μL龍膽紫液(龍膽紫和乙醇)在涂片上，靜置10 s，蒸餾水沖洗；媒染，滴加50 μL碘溶液(碘和碘化鉀)在涂片上，靜置10 s，蒸餾水沖洗；脫色，滴加50 μL脫色液(乙醇)在涂片上進行脫色，靜置10 s，蒸餾水沖洗；復染，滴加50 μL沙黃溶液(沙黃和乙醇)在涂片上，靜置10 s，蒸餾水沖洗，自然風干，中性樹膠封片，顯微鏡鏡檢，觀察細胞的形態及著色[4]。

1.3 陰道細胞涂片鏡檢及數據分析

對陰道細胞涂片用普通光學顯微鏡進行鏡檢。白細胞，一般呈圓形或卵圓形，胞核、胞質分界不明顯，胞體邊界清晰，且小于上皮細胞；上皮細胞，直徑20～70 μm，大多呈圓形、四邊形或菱形，輪廓清晰，核濃縮，核質分形明顯；角化上皮細胞，一般呈多邊形且邊緣不規則，未完全角化上皮細胞核變小，核膜界限模糊，核質著色深淺因細胞角化程度不同而有明顯差別，完全角化上皮細胞是視野中最大的細胞，細胞核角化，隨著角化程度的不同細胞形態略有差別。根據陰道細胞特點區分不同染色方法下不同細胞類型的著色情況，同時記錄結果、照相。各染色方法間的檢出率采用SPSS 20.0統計學軟件并進行χ2檢驗數據分析，以P<0.01為檢驗標準。

2 結果與分析

高原鼢鼠的發情周期包括4個階段：發情前期、發情期、發情后期和發情間期。在發情前期上皮細胞和白細胞占主導地位，在發情期和發情后期3類細胞并存，即上皮細胞、白細胞和角質化上皮細胞；角質化上皮細胞則主要分布在發情期；發情后期角質化上皮細胞逐漸減少，以上皮細胞為主；發情間期陰道涂片上為大量白細胞和少量上皮細胞。現將用3種不同染色方法的陰道涂片鏡檢結果簡要敘述如下：

2.1 HE染色

HE染色過程中陰道細胞核經蘇木精染色呈現不同程度的藍紫色，角質化上皮細胞、細胞質、嗜伊紅顆粒等經伊紅染色呈現不同程度的紅色，白細胞核為深藍紫色，胞漿著色淡，分界不明顯，分葉核較明顯。發情前期，陰道涂片上以有核上皮細胞為主，細胞核呈藍紫色，細胞質染色較淡，呈淡粉色，透明度高(圖1-A)；發情期，幾乎都是無核角化上皮細胞，胞質染成粉色、胞核呈深藍紫色或粉色，細胞質由核至邊緣區著色逐漸變淺，呈簇狀、塊狀和串狀(圖1-B)；發情后期，陰道涂片可見大量白細胞和少量完全和未完全角化上皮細胞(圖1-C)；發情間期陰道涂片上為大量白細胞和少量上皮細胞。(圖1-D)；各時期圖片背景清晰無雜質。

圖1 高原鼢鼠發情周期陰道涂片HE染色結果(400×)Fig.1 HE staining results of vaginal smears of plateau zokor during estrus cycle (400×)注：A，發情前期；B，發情期；C，發情后期；D，發情間期；藍色三角表示上皮細胞；黑色三角表示完全角化細胞；綠色表示未完全角化細胞；紅色三角表示白細胞,下同

2.2 瑞氏染色

瑞氏染色過程中，陰道涂片細胞核經瑞氏染液被染成深藍紫色，角化上皮細胞、細胞質等被染成不同程度的淺藍紫色，白細胞分葉核不易觀察到。發情前期，白細胞核呈深藍紫色，細胞輪廓清晰可見，核質分型不明顯(圖2-A)；發情期，角化的上皮細胞被染成淺藍紫色(圖2-B)；發情后期，未完全角化的上皮細胞可見核被染成深藍紫色，細胞質及完全角化細胞被染成淺藍紫色(圖2-C)；發情間期，可見白細胞、核上皮細胞藍色淡染，核質分型不明顯(圖2-D)。

圖2 高原鼢鼠發情周期陰道涂片瑞氏染色結果(400×)Fig.2 Wright staining of vaginal smears of plateau zokor during estrus cycle (400×)

2.3 快速革蘭氏染色

快速革蘭氏染色過程中細胞核、細胞質經初染、媒染、脫色、復染4步分別呈紫紅色、玫紅色，白細胞則被染成深紅色。發情前期，陰道涂片以上皮細胞為主，一般呈圓形或橢圓形分布，其細胞核、細胞質分別被染成紫紅色和玫紅色，細胞輪廓較清晰，同時存在玫紅色的無核角化上皮細胞(圖3-A)；發情期，陰道涂片中滿視野為形態不規則多邊形的無核角化上皮細胞，其被染成玫紅色分布在涂片上(圖3-B)；發情后期，少量無核角化上皮細胞，細胞核輪廓較清晰，細胞膜完整，整體層次感明顯且易于區分，白細胞以卵圓形分布，呈深紅色，細胞形態清晰(圖3-C)；發情間期，以白細胞為主，有核細胞和無核角化上皮細胞極少量存在(圖3-D)。

圖3 高原鼢鼠發情周期陰道涂片快速革蘭氏染色結果(400×)Fig.3 Rapid Gram staining of vaginal smears of plateau zokor during estrus cycle (400×)

2.4 高原鼢鼠3種染色方法檢出率的比較

陰道涂片的檢出率是指陰道涂片鏡檢時背景清晰，各類細胞可見且易區分的涂片與總涂片數的比率。采用HE染色的陰道涂片檢出率為90.67%，對陰道涂片細胞的檢出率顯著高于瑞氏染色和快速革蘭氏染色方法(P<0.01)；采用瑞氏染色的陰道涂片檢出率為58.00%，采用快速革蘭氏染色的陰道涂片檢出率為67.30%，瑞氏和快速革蘭氏兩種染色方法對于陰道涂片的檢出判斷無明顯差別(P<0.01)(表1)。

表1 高原鼢鼠陰道涂片3種染色方法檢出率的比較

3 討論

通過染色、鏡檢分析，就染色過程而言，HE染色法步驟簡單易操作，且省料省能，但耗時較長，單片染色需20～23 min，所以提倡批量染色；瑞氏染色法瑞化時間較難控制，易染色過度，耗費人力物力，對操作要求較高，但單片耗時少，15 min左右；快速革蘭氏染色法初染、媒染、復染過程中染液量不易控制，易造成染色過度，整個過程單片耗時13～15 min，對操作人員要求高。從染色效果比較，HE染色根據細胞核與細胞質對蘇木精染液和伊紅染液的親嗜性不同，染成易于區分的藍紫色和粉紅色，細胞分型明顯，細胞核、細胞質著色分明，易操作，出現誤差較小，成功率高，著色均勻且涂片檢出率與其他兩種方法具有顯著差異(P<0.01)；瑞氏染色法中根據細胞核和細胞質對瑞氏染液的親嗜性的不同，核質被染成深淺不一的藍紫色，快速革蘭氏染色法包括初染、媒染、脫色和復染4個步驟使得細胞核和細胞質呈現不同程度的紅色；但3種染色方法鑒別結果基本一致。從染色背景而言，HE染色下的陰道涂片背景清晰、干凈，透明度高，利于觀察判斷，可進行批量染色；瑞氏背景雜亂，個別雜質相對較多，易造成細胞疊加，染色加深不易觀察判斷；快速革蘭氏染色背景相對暗淡、雜亂，核質區分不分明，不易觀察。

目前，用于檢查陰道涂片的方法有很多，大多數研究都采用HE染色法[21]，HE染色法染液配置方法簡單易操作，染色過程要求低，染色效果好、易觀察；部分研究中使用瑞氏染色[26]，但是瑞氏染液條件要求苛刻，按比例配制的KH2PO4、Na2HPO4緩沖液的pH不穩定，會造成一定的誤差，核質著色顏色相近不易區分，而且有時難以著色；快速革蘭氏在檢查陰道涂片中的應用不多[24]，其操作條件不好控制，初染、復染過程中易出現沖洗不夠或沖洗過度的情況；所以，大規模檢查高原鼢鼠陰道涂片時，采用HE染色法效率更高。通過對3種染色的比較，發現使用HE染色能夠準確、高效的篩選出處于發情周期的高原鼢鼠陰道涂片，因此建議在檢查大批量陰道涂片確定高原鼢鼠發情周期時使用HE染色。另外，在試驗過程中也發現了一些值得注意的問題，在取陰道分泌物時動作要輕緩，使用牙簽制作的小棉簽是為了比較容易進入高原鼢鼠的陰道，雖然削去了尖端但還是會有殘留且易刮傷試驗鼠陰道上皮。在進行染色前，一定要保證甲醇固定好且已自然風干；HE染色時酒精梯度時間可根據實際情況適當減少。瑞氏染色時緩沖液的pH不能偏酸或偏堿，否則會影響染色效果；快速革蘭氏染色時傾倒玻片上染液時要快，否則會造成染色不均，要用蒸餾水進行沖洗，用自來水沖洗會使涂片背景雜質增多。

4 結論

高原鼢鼠繁殖期用陰道涂片法判斷其發情周期時，HE染色后涂片背景及細胞分型清晰，核質著色差異明顯且檢出率高；瑞氏染色核質呈不同程度的藍紫色，背景雜亂，核質染色差別不明顯；快速革蘭氏染色將細胞核、細胞質分別染成紫紅色和玫紅色，背景相對暗淡，白細胞則染成深紅色，核質著色不易區分，影響觀察效果。綜合分析，HE陰道涂片染色更能準確、高效地鑒別出高原鼢鼠的發情周期。