成纖維細胞來源外泌體在疾病相關細胞外基質重構中的作用

胡佳琦 謝臻蔚

浙江大學醫學院附屬婦產科醫院，浙江省杭州市 310000

成纖維細胞是介導細胞外基質(Extracellular matrix， ECM)重構的重要細胞類型，可產生膠原、彈性蛋白等組成ECM，亦可分泌其降解關鍵酶——基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMPs)等分解ECM。當成纖維細胞調控ECM重構過程失衡時，將引起ECM過度沉積或過度降解，導致器官纖維化、炎癥、皮膚衰老及腫瘤侵襲等[1-2]，但其具體調控機制尚不明確。外泌體是一種新型胞間通訊方式，新近研究發現，成纖維細胞來源的外泌體可攜帶膠原、MMPs等參與ECM組成及代謝[3-4]，還可以自分泌形式區域性調控成纖維細胞功能，在局灶ECM重構中發揮關鍵作用，為人體多種疾病病因機制和治療靶點研究帶來了新思路。

1 成纖維細胞外泌體簡介

外泌體(Exosomes)是一類由多種細胞內體—溶酶體途徑產生、直徑40～160nm的胞外囊泡[5]，可聚集并傳遞蛋白、脂質及遺傳物質等，類似“號富集器”。由于外泌體具備特有的囊泡結構，保證了信號群轉移的完整性，使胞間信息傳導更精準和全面[5-6]，因此，其在維持局灶微環境穩態中的作用日益被關注。

在病理及生理情況下，成纖維細胞均可分泌外泌體[7]。早在2006年，Zhang等采用密度梯度離心法成功獲得人滑膜成纖維細胞來源的外泌體[8]。其后，隨著超濾法、超速離心法、基于聚合物的共沉淀法等外泌體提取技術的發展，許多學者在支氣管、肌肉、滑膜、肝臟等多種組織中獲得成纖維細胞外泌體[9-13]。目前，成纖維細胞來源外泌體鑒定方法已較成熟，主要包括以下3點：(1)大小30～100nm[9]；(2)形態為經典的“杯狀”；(3)表達外泌體相關蛋白標志物。現較明確的外泌體蛋白標志物主要有：腫瘤易感性基因101蛋白、熱休克蛋白70、凋亡誘導因子相互作用蛋白、四跨膜蛋白質CD9、CD63和CD81。波形蛋白是成纖維細胞的蛋白標志物，若提取到的外泌體出現波形蛋白，則可認為該外泌體來源于成纖維細胞[10-11]。以上多種鑒定方法的成熟運用為成纖維細胞外泌體的深入研究奠定了基礎。

2 成纖維細胞外泌體與ECM重構

ECM是廣泛存在于人體多種組織中的動態結構，在應激條件下，通過不斷的重構以維持組織微環境穩態[14]。ECM主要由膠原蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖、彈性蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白等組成[14]；并可被多種蛋白酶降解，包括MMPs、聚蛋白多糖酶、組織蛋白酶、肝素酶和硫酸酯酶等[1]，其中，MMPs及其抑制劑(Tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs)是其降解關鍵酶。ECM重構過程中的主要環節是組分的合成和降解，其他還包括組分的組裝和化學修飾[1]等。

研究顯示，成纖維細胞外泌體可能通過參與ECM合成和降解等機制參與ECM重構。2017年，有學者基于高分辨質譜技術，將人正常傷口中分離出的肌成纖維細胞的胞外囊泡進行蛋白質組學鑒定及功能分析，發現其中涉及細胞外基質組成的蛋白—膠原分子[4]，且成纖維細胞來源的外泌體內攜帶有MMPs-TIMPs[3]。另有學者對腫瘤相關成纖維細胞(Cancer associated fibroblasts,CAFs)外泌體進行高通量測序，鑒定出了其中含有種類豐富的長鏈及短鏈非編碼RNA，且外泌體內miRNA與ECM重構的發生相關[7,11]。此外，成纖維細胞外泌體還可以自分泌方式參與ECM重構。將纖維化肺組織來源的原代人肺成纖維細胞分泌的外泌體作用于正常人肺成纖維細胞，觀察到外泌體處理后的細胞內纖連蛋白、Ⅰ型膠原和肌腱蛋白C等ECM蛋白的基因表達下降[15]。上述對成纖維細胞外泌體內容物的研究，提示成纖維細胞來源外泌體參與ECM組成和代謝，并存在自分泌作用，是ECM重構的重要調控方式。

3 成纖維細胞外泌體在不同疾病相關ECM重構中的作用

越來越多的研究表明，成纖維細胞來源外泌體攜帶蛋白、RNA等信號分子，通過傳遞胞間信息來調控ECM重構，參與組織損傷修復、細胞遷移等病理生理過程，與皮膚老化、腫瘤、炎癥等疾病密切相關。部分證據顯示，外源性給予成纖維細胞來源外泌體，可改善組織ECM重構病理狀態，有望治療疾病，具潛在臨床應用價值[16-17]。

3.1 成纖維細胞外泌體與皮膚衰老 ECM重構紊亂導致其膠原組分改變是皮膚老化的重要特征[18]。紫外線照射下，皮膚Ⅰ型前膠原分子合成減少而MMPs合成增加，使局部組織膠原蛋白缺乏，從而引起皮膚彈性缺失、產生皺紋。皮膚成纖維細胞可分泌外泌體，促進Ⅰ型前膠原分子及TIMPs的表達，通過介導ECM重構改善皮膚老化現象。Hu等[16]通過構建紫外線誘導皮膚衰老的小鼠模型，在其背部皮膚局部注射人真皮成纖維細胞外泌體，發現注射區域內膠原纖維豐富且致密、ECM重構蛋白MMP-1表達下調而TIMP 1-2表達上調，提示成纖維細胞外泌體可通過抑制膠原降解來改善皮膚膠原含量。

成纖維細胞來源外泌體對皮膚衰老具有潛在的治療前景。尤其是研究發現，小鼠局部皮膚注射人真皮成纖維細胞外泌體比注射間充質干細胞外泌體，更能增加局部組織內Ⅰ型前膠原分子表達[16]，其具體機制可能與轉化生長因子-β(Transforming growth factor-beta,TGF-β)、IL-1β、腫瘤壞死因子-α等因子表達改變有關。其中，TGF-β是公認的ECM生物合成的主要調節分子，可上調膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白、肌腱蛋白等多種ECM蛋白的表達[19]。該信號轉導異常將引起膠原蛋白合成減少、ECM重構障礙，使真皮中膠原蛋白呈碎片狀、粗分布[20]。而外源性人真皮成纖維細胞外泌體注射可促進小鼠皮膚TGF-β高表達。通過激活TGF-β信號通路，成纖維細胞外泌體發揮局部組織的抗衰老效應。

3.2 成纖維細胞外泌體與腫瘤 在腫瘤的發生發展過程中，ECM發生了重構，這種重構最重要的特征表現為ECM的分子組成的改變，重構后的ECM為腫瘤細胞的增殖、分化創造了一個寬松的微環境，導致腫瘤細胞轉移和浸潤生長[21]。其中，MMPs的水解作用是導致 ECM 重構的主要原因。

CAFs是腫瘤組織中持續活化的成纖維細胞，其所產生的外泌體在腫瘤微環境中起信號轉導作用，誘導細胞外基質降解和重構。研究顯示，口腔鱗狀細胞癌組織中CAFs來源的外泌體內miR-34a-5p含量較正常成纖維細胞外泌體下降， miR-34a-5p可經外泌體途徑傳遞至腫瘤細胞，直接結合于受體酪氨酸激酶AXL(Aexekleto，AXL)靶基因，經糖原合成酶激酶-3β/β-連環蛋白/鋅指轉錄因子snail信號級聯反應，調控E-鈣黏蛋白和MMPs的表達[22]。將腫瘤細胞內miR-34a-5p分子過表達，發現腫瘤細胞內E-鈣黏蛋白表達水平同樣升高，MMP-2和MMP-9表達下降。已知基底膜由Ⅳ型膠原蛋白、層粘連蛋白、巢蛋白、蛋白多糖如聚集蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白等組成[14]，而MMP-2及MMP-9可參與其中多種成分的降解。因此，CAFs所分泌的含低水平miR-34a-5p的外泌體作用于口腔鱗癌細胞，經AXL/GSK-3β/β-catenin/snail信號通路，調控MMP-2及MMP-9的表達，從而參與基底膜降解，在腫瘤細胞的轉移中發揮了重要作用。

3.3 成纖維細胞外泌體與炎癥 炎癥作為組織重構的重要驅動因素，導致了骨組織慢性重塑，其所導致的組織損傷與基質降解酶密切相關。MMPs在炎癥條件下表達增加，活性增強，且與炎癥的嚴重程度有關[23]。炎癥組織中MMPs及含血小板結合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶(A disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs, ADAMTS)等酶的活化，參與基膜及間質膠原的降解，導致細胞外基質重構。

炎癥組織中，成纖維細胞外泌體下調軟骨細胞膠原表達，而促進膠原降解相關酶的表達，引起ECM過度降解。Kato等將白介素-1β(Interleukin，IL-1β)刺激人滑膜成纖維細胞，發現外泌體釋放增加，將外泌體與關節軟骨細胞共培養24h，結果顯示，與未受IL-1β處理的成纖維細胞來源外泌體相比，IL-1β刺激組中軟骨細胞內MMP-13、ADAMTS-5表達上調，聚集蛋白聚糖、Ⅱ型膠原蛋白表達下降[13]。而在軟骨關節中，ECM主要由Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖組成，MMP-13被認為是骨關節炎疾病中降解ECM的主要酶類，且ADAMTS-5具有降解蛋白聚糖的能力。兩者的上調將引起骨關節中細胞外基質的過度降解，結合胞外基質成分合成減少，最終導致骨關節的破壞。在牙周炎進展中，Zhao等發現經脂多糖處理的成纖維細胞來源外泌體，可下調人成骨細胞內的堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原蛋白等骨特異性基質蛋白的表達水平[24]，且Runt相關轉錄因子2與骨保護素的表達下降共同參與了胞外基質重構過程[25]。上述研究均提示成纖維細胞外泌體在炎癥疾病ECM重構過程中發揮重要作用。

3.4 成纖維細胞外泌體與纖維化 纖維化是一種主要由成纖維細胞介導的過度細胞外基質產生和沉積的疾病，表現為膠原纖維的過度沉積，各類型膠原比例失衡，排列紊亂，可發生在多種組織器官中[1]。Ⅰ、Ⅲ型膠原的過度表達及早期膠原酶活性的增加，晚期活性的降低，導致膠原蛋白網絡發生改變[26]。ECM合成和降解之間的失衡致使ECM重構障礙。

在肝纖維化疾病中，肝星狀細胞作為損傷后分化為肌成纖維細胞的主要來源，經血小板源性生長因子刺激后，分泌富含血小板源性生長因子受體α的外泌體，以酪氨酸磷酸酶依賴性方式，促進體外HSCs的遷移和體內肝纖維化的發生[12]。在肺纖維化疾病中，人肺成纖維細胞來源外泌體以自分泌方式作用于成纖維細胞后，成纖維細胞代謝活性及增殖能力增強[15]。用TGF-β刺激人肺成纖維細胞，可增加外泌體內Wnt蛋白家族成員5a含量，進一步促進細胞增殖，參與肺纖維化進展。此外，miRNA也可經成纖維細胞分泌，經外泌體途徑參與纖維化疾病的進展。在杜氏肌營養不良疾病中，肌組織成纖維細胞來源外泌體內所含的miR-199a-5p水平顯著升高，將正常成纖維細胞與DMD成纖維細胞源性外泌體共培養后，細胞增殖能力增強，成纖維細胞中Ⅰ型膠原蛋白、纖連蛋白、TIMP-1和TGF-β等纖維化相關基因轉錄水平上升，胞外膠原沉積增加[11]。然而，Shannon等發現活化的成纖維細胞來源的外泌體存在對鄰近原始成纖維細胞的抗纖維化作用，且其內含有高水平的抗纖維化分子[27]。深入研究發現，過表達β-連環蛋白和轉錄因子Gata4的皮膚成纖維細胞來源的外泌體可減少小鼠脛骨前肌纖維化并改善小鼠運動能力[17]。因此，成纖維細胞外泌體內關鍵信號分子對纖維化的作用仍有待進一步研究。

4 展望

成纖維細胞是參與ECM重構的重要細胞，通過細胞與細胞間通訊，參與組織ECM成分合成與降解的穩態維持。外泌體作為胞間信號傳遞的一種方式，參與纖維化、炎癥等疾病的進展?，F認為成纖維細胞來源外泌體可以自分泌方式調控其細胞活性，而外泌體內攜帶的蛋白質、RNA等信號分子在ECM重構中可能發揮著至關重要的作用。在纖維化疾病的研究中發現，疾病組織中的成纖維細胞分泌的外泌體可促進正常成纖維細胞纖維化相關基因的表達。近年來，在皮膚衰老的研究中發現成纖維細胞來源的外泌體是一種極具前景治療方式。因此，深入闡明成纖維細胞來源外泌體在ECM重構相關疾病中的作用，以外泌體為載體，從而改變病理狀態下的細胞外基質，這將為更多的疾病治療提供思路。