活性氧類在聲動力療法中的研究進展

閆春陽，王碧琳，畢良佳

(哈爾濱醫科大學附屬第四醫院口腔科，哈爾濱 150001)

聲動力療法(sonodynamic therapy，SDT)是由超聲聯合化學藥物聲敏劑，生成活性氧類(reactive oxygen species，ROS)并產生抗腫瘤效應的一種非傳統治療方式。ROS是一種可以使周圍底物被氧化的高反應性試劑，可使靶組織產生一系列不可逆性損傷[1]。SDT于20世紀80年代末由Umemura等[2-3]首次提出，是基于光動力療法(photodynamic therapy，PDT)和超聲基礎上發展而來的新型微創且安全有效、性價比較高的特異性療法。SDT工作原理與PDT相近，均以ROS作為主要產物，但SDT在臨床中優于PDT，關鍵在于SDT將超聲作為外源性激發源替代PDT中的光刺激，而且與PDT以線粒體作為靶細胞相比，SDT更注重以線粒體及線粒體的膜結構作為重點[4-6]。同時，與PDT相比，SDT的穿透能力更強[7](超聲可以穿透幾十厘米的軟組織[8]，光的穿透單位仍以毫米居多)、費用更低(可在CT/磁共振成像時進行操作)、靶向給藥更精確，而且減少了由光刺激導致的組織變性。SDT很好地結合了超聲的無創性特點[9-10]，在臨床上廣泛應用。現就ROS在SDT中的研究進展予以綜述。

1 ROS概述

1.1ROS的生物學特性 ROS是細胞內聲敏劑在SDT作用下的產物，在腫瘤、炎癥及動脈粥樣硬化的診療中均具有重要意義。ROS的主要代表物包括羥基自由基、過氧化物、超氧化物、單線態氧、次氯酸鹽以及脂質過氧化物等高活性分子。ROS的半衰期長短決定了ROS的作用范圍及細胞毒性效應，其中羥基自由基是氧化性能最強的ROS分子，可直接對細胞核酸及蛋白質造成損害，而單線態氧是破壞性極強的ROS，這些主要產物在適當的微環境下能夠進行相互轉化，完成ROS的清除[11]。例如，細胞內的超氧化物主要是由還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)與NADPH氧化酶發生反應及細胞自身線粒體代謝共同產生的，而生成的超氧化物可在超氧化物歧化酶作用下生成過氧化物，當過氧化物積蓄到一定濃度時可在金屬陽離子(錳離子、銅離子、鋅離子)的作用下生成羥基自由基；同時，生成的過氧化物又可在過氧化物酶、過氧化氫酶及谷胱甘肽分子的作用下生成過氧化氫，ROS具有相互轉化的特性，增加了反應的復雜性[12]。

1.2ROS的來源 ROS可由NADPH氧化酶和線粒體代謝產生，也可通過光刺激和聲刺激激發產生。根據產生的條件不同，ROS可分為內源性ROS和外源性ROS。內源性ROS主要由機體自身產生，另外，胞內細胞器(線粒體產生約占總ROS產量的90%[13]、內質網等)、酶體系(過氧化物酶)[14]、巨噬細胞及粒細胞等也有產生ROS的能力。外源性ROS則是由外界環境(如超聲、光、藥物)刺激產生，外源性ROS主要有能量轉移和電子轉移兩種產生方式。

1.3ROS的雙面性

1.3.1重度氧化應激反應 ROS的產生對細胞有雙面性[15]，高水平、大劑量ROS因具有強氧化性，因此殺傷作用強，最終可導致不可逆性損傷、癌變[16]或者促進腫瘤的存活[17]，在強侵襲性、容易轉移、不易根治的腫瘤疾病中表達增強。當細胞受到微環境刺激或抗氧化系統失調生成ROS過量時[18]，細胞內ROS的產生可破壞大分子生物的完整性，引起細胞損傷，產生氧化應激反應[19]，對細胞內的線粒體DNA具有損傷作用，誘導細胞凋亡[20]、壞死、衰老以及增殖阻滯[21]。

1.3.2輕度氧化應激反應 低水平、小劑量的ROS是機體內普遍存在的一種生理形式，發揮細胞內信號轉導的作用，可作為生物的第二信使，對支持細胞生命活動起重要作用，通常以可逆化氧化蛋白巰基基團作為信號轉導分子，使生成和清除的ROS維持動態平衡[22]。ROS的清除主要依賴于非酶類抗氧化分子(組氨酸)和ROS清除酶(超氧化物歧化酶、過氧化物酶)[23]。

1.4ROS常見的檢測手段

1.4.1直接檢測法 由于單線態氧的活性壽命極短，產量低，不易檢測，目前直接檢測方法主要包括帶濾光片的近紅外光譜分析儀和以磷光體作為熒光屏的近紅外光光電倍增管掃描儀(原理是檢測1 270 nm時單線態氧發出的磷光)。帶濾光片的近紅外光譜分析儀根據記錄時間的長度分為多通道計數法、門控光子計數法以及時間相關單光子計數法。多通道計數法因具有采集時間短、范圍廣、時間精準(可精確到1 ns)等特點，是主要的檢測方法[24]。

1.4.2間接檢測法 間接檢測法以探針(熒光探針、化學發光探針)作為主要手段進行熒光檢測，但存在細胞毒性，因間接檢測探針能與其他蛋白質發生反應，導致結果不準確。目前市面上常用的探針包括9,10-蒽二丙酸熒光探針[25]、1,3-二苯基異苯并呋喃熒光探針以及紅色線粒體超氧化物熒光探針等，其中紅色線粒體超氧化物熒光探針是常見的測量超氧化物的熒光探針[26]。化學發光探針通過與單線態氧的結合迅速發光釋放能量，通過對發光信號的檢測，得到單線態氧的含量。目前，含蒽衍生物發光探針是主流探針。

1.5ROS的不足 目前ROS的不足主要包括：①擴散距離短，存在還未到達靶組織就被清除的可能性，且單線態氧在細胞微環境中的擴散距離僅為45 nm，這種擴散程度不足以穿透細胞單層膜結構；②壽命短，單線態氧是最具破壞性的ROS，但在水溶劑中單線態氧的壽命僅為3.5 μs；③有氧環境對SDT中超聲激活聲敏劑產生ROS至關重要，因而是否存在有氧環境對SDT中ROS的療效影響較大；④ROS會被特定的淬滅劑作用產生淬滅，如D-甘露醇和疊氮鈉；⑤ROS的大量產生依賴于外界刺激(如光刺激)，但外界這種不正常的刺激會對人體造成傷害[27]。目前納米聲敏劑載體仍作為ROS靶向運輸的通路應用于SDT[28]。

2 ROS-SDT的作用

正常生理功能下，細胞內產生和代謝的ROS處于平衡穩定狀態，能夠誘導細胞有絲分裂、消除炎癥反應，且不產生細胞毒性。SDT采用的聲敏劑主要來源于PDT的光敏劑，光敏劑的靶向作用位點不同則作用機制不同。研究表明，當光敏劑作用于線粒體時，極低量的PDT即可激發線粒體的呼吸傳遞鏈，使生成的ROS對細胞凋亡起到重要作用[29]。當光敏劑的靶向位點為線粒體和溶酶體時，可激發細胞凋亡機制，使細胞發生凋亡；當光敏劑的靶向位點為細胞的內質網時，則會發生自噬現象；當光敏劑的靶向位點為細胞膜時，則直接導致細胞死亡[30-31]。血卟啉單甲醚是應用較廣的聲敏劑，超聲與血卟啉單甲醚結合時，可產生ROS，進而激活胱天蛋白酶(caspase)-3、caspase-9、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)等通路，誘導DNA斷裂、促凋亡細胞高表達[32]。

2.1ROS-SDT的功能性效應 SDT中ROS的生成是基于SDT超聲空化作用中的慣性空化效應。超聲空化作用是一種獨特的物理現象，是超聲作用于液態組織時產生的動態過程。空化作用作為SDT的主流效應，可分為兩種類型，即非慣性(穩定)空化效應和慣性(瞬態)空化效應[33]。在穩定空化下，超聲的頻率占主要因素，氣泡直徑的變化甚微，主要表現為產生的氣泡不會劇烈變化導致坍塌，且存在周期較長；氣泡以被迫振動為主要振動方式，在外界環境的改變下，膜滲透性增高[34]。在慣性空化中，液體氣泡吸收大量的超聲能量，且在極短的時間內急劇釋放，氣泡先收縮后膨脹至其共振尺寸的2～3倍，最后壓縮在半周內，可在短時間內產生高熱，經歷強烈超聲的輻射，形成自由基[1]。當細胞受到外源性的強烈刺激時，會對自身結構和支持代謝的酶產生不可逆性的損傷[35-36]。同時，為了提高SDT的治療效果，需要對超聲的頻率、強度及聲敏劑的靶向性更加關注。

因對周圍組織的損傷情況不同，穩定空化效應是目前研究的重點生物學效應，這使得低頻、低強度(<1 MHz、3 W/cm2)的超聲成為主流。SDT可激活Bax/Bcl-2異二聚體或Bax/Bax同源二聚體、Fas/FasL信號通路的高表達以及caspase-8和caspase-3升高等一系列變化[37]。以上生物學效應導致組織中的水分子裂解產生自由基(如羥基自由基、單線態氧)等ROS，這些物質聯合聲敏劑及超聲協同殺滅靶細胞[38]。ROS可以損傷脂質與蛋白質的特性，表明SDT下產生的ROS在細胞水平上產生了實質性改變。

2.2ROS-SDT的作用機制 首先，SDT誘導細胞內ROS產生，使線粒體膜電位下調，導致線粒體不能進行正常的氧化磷酸化和腺苷三磷酸的合成步驟，誘導細胞凋亡[19]。其次，SDT的激發使線粒體膜上的Bax高表達和Bcl-2低表達，Bax與Bcl-2呈拮抗關系，Bax可促進細胞凋亡，Bcl-2起到抑制細胞凋亡的作用，Bax通過形成Bax/Bcl-2異二聚體或Bax/Bax同源二聚體方式增加線粒體膜的通透性，導致內源性凋亡的可能；同時，SDT的存在使線粒體生物膜上鈣離子含量增高呈過載狀態，當鈣離子含量超過閾值時，細胞膜破裂并不再完整[39]。線粒體膜電位的降低可促進ROS生成，產生細胞毒性[7]。這些均證明SDT對ROS的產生具有正向促進作用。

2.3SDT介導ROS產生的過程 SDT介導ROS產生的過程主要包括：①生物相容性良好的聲敏劑先與靶組織結合；②超聲在特定區域內產生機械效應；③超聲與聲敏劑相結合產生空化現象、熱效應及機械效應，使介質震蕩，同時超聲照射靶組織；④短時間內的局部高壓環境使介質中的氣泡崩塌，產生大量熱能、羥基自由基陰離子和氫離子[40]；⑤聲敏劑同崩塌的細胞相結合產生電子躍遷，電子從激發態回到基態時，伴隨能量的釋放，產生殺死靶細胞的ROS物質[7]；⑥ROS產生氧化應激反應，導致細胞核酸、脂質及蛋白質損傷[25]。

2.4ROS在SDT中的應用 SDT作為一種安全、無創、無毒的新型療法，在臨床中應用廣泛。SDT作為PDT的延伸，使用特定的、對周圍組織不產生損害的聲波來代替PDT中的光波，增加了定位準確性。同時，使用特定頻率、波長及強度的超聲與集聚在靶組織中的聲敏劑相結合形成的SDT可以彌補單純超聲及PDT的局限性。Li等[41]對荷瘤小鼠模型腫瘤安全消融的研究表明，當黑磷[42]納米片作為聲敏劑載體時，可產生優勢性的羥基自由基陰離子，與外界環境添加的過氧化物產生協同作用，在黑磷納米片上生成ROS；以2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽作為ROS敏感熒光探針，結果發現，在53 kHz、0.14 W/cm2的超聲和0.05 mg/L的黑磷納米片作用下單線態氧和過氧化物均高表達，腫瘤體積顯著縮小。Li等[43]以硫化銀作為聲敏劑，以紅細胞(在哺乳動物體內能進行氧氣運輸，具有過氧化氫酶的特性，可避免產生有毒物質)作為載體作用于腫瘤細胞，結果顯示，在SDT刺激下腫瘤內的氧分子轉化為氧自由基和單線態氧，可有效消除腫瘤，提高小鼠存活率。Yang等[44]以全氟戊烷為核心，將血卟啉單甲醚與葉酸(folate，FA)結合到含有磷脂的細胞膜中作為聲敏劑與納米脂質體(nanodroplets，NDs)相結合形成FA-H@NDs系統，并通過光聲成像系統進行檢測，結果發現，FA-H@NDs系統經聲致相變后轉變成氣泡，進一步增強了超聲和納米脂質體的穿透能力，同時FA-H@NDs系統在超聲照射下可誘導ROS產生，導致人卵巢癌SKOV3細胞抑制率顯著增高，進而導致腫瘤細胞和組織凋亡、壞死，表明SDT介導產生的ROS對腫瘤的治療效果顯著。

3 小 結

ROS主要存在于生物自身組織細胞中，小劑量的ROS并不能對機體細胞代謝產生負向作用。SDT主要通過超聲機械壓力、超聲與聲敏劑結合產生ROS誘導細胞凋亡、空化效應三者協同破壞靶細胞。SDT是繼傳統手術療法、藥物療法后最具潛力的療法。SDT因聲敏劑選擇的差異性、超聲的強度、頻率參數的不同以及對熱效應與空化效應檢測的缺失性而具有限制性。未來應明確ROS產生與SDT機械效應的機制，優化空化效應，以減少其他不必要的機械效應對能量的削弱。