干細胞源外泌體及改良外泌體在治療急性心肌梗死中的研究進展

胡悅,何潔瓊,陳軍

(1.廣東醫科大學，廣東 湛江 524023；2.廣東醫科大學深圳寶安臨床醫學院 深圳市寶安區人民醫院心血管內科，廣東 深圳 518101)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)指冠狀動脈急性閉塞、血流中斷引起的局部心肌缺血性壞死，是威脅人類健康的重大疾病。2018年中國心血管病報告顯示，我國AMI患者的死亡率自2005年開始呈快速上升趨勢[1]，隨著人們生活節奏的加快以及不良生活方式(加班熬夜、抽煙喝酒、高脂高熱量飲食等)的影響，AMI發病呈年輕化趨勢[2]。目前AMI的預防和治療已成為重要的公共衛生問題。目前臨床上AMI的治療包括溶栓、冠狀動脈內支架置入術、冠狀動脈旁路移植術以及藥物治療，上述治療均可改善癥狀，但部分患者的療效不佳。研究表明，干細胞可增殖分化為心肌細胞，并替代受損心肌細胞，進而改善心臟功能，其中外泌體發揮重要的調節作用；通過包膜表面的特異性受體將細胞內的蛋白質和核酸轉運至受體細胞，有望實現疾病的精準治療[3-4]?，F對干細胞源外泌體治療AMI的機制以及改良外泌體治療AMI的研究進展予以綜述。

1 外泌體

1.1外泌體的形成 活細胞能分泌多種膜狀囊泡，根據直徑和生成機制不同可分為外泌體(直徑40～100 nm)、微囊泡(直徑200～1 000 nm)和凋亡小體(直徑500～5 000 nm)[5]。外泌體是細胞通過內吞作用形成初級內體，初級內體再將細胞質中的信使RNA(messenger RNA，mRNA)、微RNA(microRNA，miRNA)、蛋白質及脂質等物質包裹在其中形成多泡晚期內體，然后多泡晚期內體與細胞膜融合通過胞吐作用將攜帶的蛋白質、基因和酶等物質釋放到細胞外所形成的膜狀囊泡，其廣泛存在于血液、尿液、唾液、腹水等體液中[6-7]。

1.2外泌體的生物學特性 外泌體是細胞間進行信息交流的樞紐[6]，其生物學特性為：①靶向性。不同細胞來源的外泌體表面表達特定的跨膜蛋白(CD63、CD9、CD81、熱激蛋白70等)，可靶向作用到特定的細胞[8]。②特異性。不同生理、病理狀態下分泌的外泌體會分泌特定的miRNA、mRNA、蛋白質和脂質，其中miRNA是高度保守的小分子非編碼單鏈RNA，與靶mRNA 3′非編碼區互補結合，通過降解mRNA或抑制蛋白質翻譯實現基因調控[9]，外泌體可通過這些特定的內含物向靶細胞傳遞相應的信號。③穩定性。外泌體具有雙層膜結構，可避開循環系統中RNA酶的降解，具有高度的生物穩定性[10]。④低毒性和低免疫原性[11]。外泌體屬于非細胞體系，具有低毒性和低免疫原性，可避免發生排斥反應，有利于外泌體作為載體向靶細胞傳遞信息。

2 外泌體治療AMI的作用

當冠狀動脈管腔發生急性完全閉塞時，其所供區域的心室壁心肌會出現透壁性壞死，臨床表現為典型的ST段抬高型心肌梗死，冠狀動脈閉塞后20～30 min，其供血心肌有少量壞死，1～2 h后絕大部分心肌呈凝固性壞死，壞死組織1～2周后開始吸收并逐漸纖維化，6～8周后進入慢性期形成瘢痕愈合，較大瘢痕處可逐漸外凸出形成室壁瘤，波及心內膜可導致附壁血栓形成，波及心包會出現反應性心包炎[12]。在心腔壓力作用下，壞死的心室壁可破裂，造成心包積血而引起猝死。雖然傳統治療(溶栓、冠狀動脈內支架置入術、藥物治療等)可暫時改善患者癥狀，但部分患者仍遺留較多并發癥，最終導致慢性心力衰竭。

干細胞具有多向分化特性，目前廣泛用于心肌梗死后心臟再生治療。干細胞療法雖然可明顯改善心臟功能，但易產生排斥反應和致畸作用[13]。移植細胞的旁分泌因子——外泌體可能在受損心肌細胞的修復過程中起主要作用，而非移植細胞本身。Zhao等[14]發現，人臍帶間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)可通過抗凋亡、促進細胞增殖和血管生成修復受損的心肌細胞，促進心臟功能恢復，而無外泌體的人臍帶MSC幾乎不能促進心臟功能恢復。提示人臍帶MSC對心肌細胞的修復是由外泌體介導的。外泌體本身具有低毒性和低免疫原性，可降低免疫排斥反應，彌補干細胞移植的缺陷。Suzuki等[15]的研究發現，外泌體主要通過抗凋亡、抗纖維化、抗炎、促進內皮細胞增殖和血管生成等幾個方面修復AMI后的心肌細胞。

2.1抗凋亡作用 細胞凋亡指為維持內環境穩定，由基因控制的細胞自主有序的死亡。心肌梗死區域心肌細胞凋亡率明顯升高，心肌缺血、缺氧等均可誘導心肌細胞凋亡[16]，心肌細胞的進行性喪失最終會導致心力衰竭，因此抑制早期心肌梗死中的心肌細胞凋亡對改善心臟功能、預防心室重塑和減少心血管事件非常重要，并且是治療心肌梗死的重要方法之一。外泌體作為細胞間信息傳遞的媒介，可與靶細胞結合，調控細胞凋亡，改善心肌預后。有研究發現，外泌體miR-133可抑制細胞凋亡，輸注miR-133過表達MSC心肌梗死大鼠的梗死心肌面積縮小[17]，推測外泌體miR-133可通過抑制細胞凋亡改善心臟功能，縮小心肌梗死面積。Zhang等[18]研究發現，在低氧環境下，骨髓MSC外泌體可通過上調miRNA-24抑制心肌細胞凋亡，進而減少心肌梗死面積。Dai等[19]的研究顯示，外泌體miRNA-379可通過調節腫瘤壞死因子-α誘導蛋白8，降低心肌細胞凋亡水平，保護心肌細胞免受AMI誘導的心肌損傷。另有研究表明，脂肪干細胞分泌的miR-214具有抗細胞凋亡作用，AMI時心肌細胞通過網格蛋白介導的內吞作用捕獲miR-214，導致心肌損傷，而氯丙嗪可抑制網格蛋白介導的內吞作用，降低心肌細胞凋亡[20]，這一研究成果為AMI的治療提供了新的方法。

2.2抗纖維化作用 心肌纖維化是心肌梗死后的主要病理過程，梗死后的心肌細胞在1～2周后逐漸纖維化，損傷組織由纖維化瘢痕取代，但過度的纖維化會改變心室順應性，增加心室壁厚度，影響心臟的收縮和舒張，嚴重者可導致心力衰竭[21]。研究顯示，心臟成纖維細胞與心肌細胞之間存在聯系，心肌缺血再灌注損傷時，心臟成纖維細胞會分泌富含miR-423-3p的外泌體，外泌體作為重要的旁分泌信號轉導介質，將miR-423-3p運送到心肌細胞中，通過影響下游效應因子Ras相關小鳥苷三磷酸酶蛋白超家族介導對心臟的保護作用[22]。目前抑制心肌過度纖維化是治療心肌梗死的理想方法，其中外泌體起重要作用。Luo等[23]通過建立大鼠心肌梗死模型和低氧誘導下心肌損傷體外模型研究miR-126過表達的脂肪干細胞源外泌體對損傷心肌細胞的作用，體外結果顯示，miR-126過表達的脂肪干細胞可降低心肌細胞纖維化相關蛋白的表達；體內研究證實，注入富含miR-126的外泌體大鼠心肌梗死模型的心臟纖維化和炎癥細胞因子的表達顯著降低，梗死后的心肌損傷面積也顯著縮小[23]。另外，轉化生長因子-β1在調節心臟成纖維細胞分化和膠原代謝中起關鍵作用，其可通過增加細胞外基質沉積以及膠原蛋白和纖連蛋白的合成，促進心肌纖維化，過表達可能導致心功能障礙[24]。Yu等[25]研究發現，外泌體miR-133a的過表達可降低心肌梗死后轉化生長因子-β1的水平，減少心肌膠原蛋白沉積，抑制心肌纖維化，改善心臟功能。

2.3抗炎作用 AMI時心肌缺血缺氧可誘導機體產生細胞因子和趨化因子，促使中性粒細胞和單核細胞在梗死區域聚集，進而產生炎癥反應，導致心臟功能受損。白細胞介素-10是天然存在的抗炎細胞因子，參與抗炎、增殖、抗凋亡等過程[26]。Yue等[27]研究發現，白細胞介素-10缺陷型心肌梗死小鼠心肌壞死加重，梗死面積增加，中性粒細胞浸潤增多。經白細胞介素-10治療后，炎癥反應減輕，成纖維細胞活化增強，心肌重構改善。進一步研究證實，白細胞介素-10缺乏時可通過上調外泌體中的整合素連接激酶以及激活受體細胞中整合素連接激酶介導的核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)通路促進炎癥反應；當外泌體中的整合素連接激酶表達降低時，炎癥反應減輕[27]，進而減少心肌損傷。Liu等[28]的研究表明，富含miR-93-5p的外泌體可通過靶向作用Toll樣受體4，抑制細胞凋亡和炎癥因子的表達，減輕心肌損傷。Yuan等[29]發現，miR-145-5p可通過負調節CD40減輕缺氧誘導的細胞炎癥反應，從而在心肌缺血性損傷中起心臟保護作用。還有研究表明，心肌梗死后小鼠miR-155的表達增加，其中miR-155主要存在于巨噬細胞中，巨噬細胞分泌的外泌體可將miR-155轉移到心臟成纖維細胞中，抑制心臟成纖維細胞增殖并促進成纖維細胞炎癥反應，而miR-155抑制劑可抑制此作用，降低炎癥反應和心臟破裂的發生率，并顯著改善心臟功能[30]。由此得出，miR-155抑制劑具有作為減輕AMI相關不良事件治療劑的潛力，這一研究成果也大大提高了利用外泌體修復缺血性心肌的可能性。

2.4內皮細胞增殖和血管生成作用 心肌梗死后心肌供血不足導致部分心肌細胞缺氧壞死，進而出現心肌細胞肥大和收縮力減弱，而新生血管增多可重新恢復心肌細胞氧供，增加冠狀動脈血流，減少心肌梗死面積，保護心臟功能。有研究發現，心肌梗死后循環系統中的外泌體及攜帶的基因選擇性地轉移到外周器官，并優先轉移到骨髓[31]。轉移的miRNA通過下調骨髓細胞中趨化因子受體4的表達，動員祖細胞促進內皮細胞增殖及血管生成。Ju等[32]向心肌梗死小鼠注入MSC源外泌體發現，MSC外泌體可促進心肌細胞增殖和血管生成，縮小梗死面積。Kang等[33]研究發現，脂肪干細胞分泌的miR-31也可促進血管生成，主要是通過抑制缺氧誘導因子1抑制因子發揮作用，缺氧誘導因子1是血管內皮生長因子的轉錄活化因子，通過轉錄活化編碼血管內皮生長因子的基因，促進血管新生[34-35]。還有研究表明，間充質細胞分泌的miR-125a和miR-30b可通過抑制血管生成抑制劑δ樣4的表達促進內皮細胞增生和血管生成[36-37]。以上研究表明外泌體可通過促進內皮細胞增殖和血管生成改善心臟功能，縮小心肌梗死面積。

3 改良外泌體在AMI治療方面的研究

干細胞源外泌體作為非細胞體系，被認為是治療心血管疾病的一種潛在方法。隨著研究的深入發現，外泌體與MSC移植聯合、外泌體加載物質或通過藥物阻斷吞噬系統對外泌體的內吞作用，可顯著提高外泌體改善心肌損傷的作用。

已有研究證明，基質細胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1，SDF-1)及其受體趨化因子受體4在干細胞移植到缺血性心肌組織中發揮重要的促進作用，SDF-1表達在局部心肌缺血性損傷后1～3 d達到峰值[38]。然而，SDF-1表達升高時如果存在急性炎癥反應和高氧化應激反應會嚴重影響移植細胞的存活[39]。Huang等[40]的研究發現，外泌體可通過增加SDF-1的表達及降低炎癥反應提高MSC的存活率，該研究先將外泌體遞送到心肌，然后再將MSC移植到梗死心肌，與單獨使用外泌體或MSC治療的對照組相比，可顯著改善心臟功能，增加新血管形成并減少梗死面積。研究顯示，AMI后30 min向心肌內注射外泌體，并在AMI后第3天聯合MSC移植治療可最大程度地改善心臟功能[40]。外泌體和MSC移植聯合治療AMI不僅為外泌體的臨床應用奠定了基礎，也為AMI的治療開辟了新道路。

當外泌體最大程度地作用于AMI心臟時才能充分發揮作用。為提高MSC源外泌體對心臟的靶向性，Wang等[41]將缺血性心肌靶向肽基序CSTSMLKAC裝載到外泌體表面，使其靶向作用于缺血性心肌細胞，結果發現，載有缺血性心肌靶向肽的外泌體作用于缺血性心肌細胞的數量較空白外泌體顯著增多；并證實在心肌梗死小鼠中MSC衍生的缺血性心肌靶向肽外泌體可顯著抑制炎癥反應和心肌細胞凋亡、增強血管生成、縮小心肌梗死面積并改善心臟功能[41]。Vandergriff等[42]的研究顯示，心臟歸巢肽與外泌體結合可增加心臟外泌體的含量，進而增強外泌體對心肌損傷的修復作用。Kim等[43]通過在外泌體膜上表達心臟靶向肽的基因修飾，顯著增加了外泌體的心臟遞送。以上研究顯示，外泌體與靶向肽的結合可顯著提高心臟組織中外泌體的含量，增強外泌體對心臟的保護作用。

外泌體具有特異性、靶向性和穩定性，但其在體內的運輸仍受到多種因素的干擾，如單核吞噬細胞系統對外泌體的內吞作用阻礙外泌體到達相應靶器官(包括心臟)。有研究發現，輸注到動物體內的外泌體優先聚集在肝臟和脾臟，主要是因為這兩個器官存在大量的巨噬細胞[44]。網格蛋白重鏈作為一種由CLTC基因編碼的蛋白質,在巨噬細胞中高表達，并介導巨噬細胞發揮內吞作用。Wan等[45]采用兩步外泌體遞送策略，先向阿霉素誘導的心肌毒性模型輸注網格蛋白重鏈抑制劑(如氯丙嗪)，顯著阻斷脾臟和肝臟中單核吞噬細胞系統的內吞作用，再注入裝載miR-21的外泌體，與未輸注網格蛋白重鏈抑制劑組相比，裝載miR-21的外泌體對心肌的保護作用顯著增強。通過阻止單核吞噬細胞系統對外泌體的攝取，再遞送治療性外泌體的策略是一種有前途的治療方法。外泌體在體內移植后的低保留率也是臨床的一大難題。有研究顯示，用功能性肽水凝膠封裝外泌體后植入大鼠梗死心肌可增加外泌體的保留率和穩定性，顯著改善心肌功能[46]。另外，將超聲微泡與外泌體同時輸注到小鼠體內，然后在心臟組織中特異性誘導超聲靶向微泡破壞，結果顯示外泌體在心臟組織中的含量顯著增加[47]。這項研究強調了超聲靶向微泡破壞技術促進外泌體運輸到心臟的潛力，此方法有望成為一種新的AMI治療方式。

4 結 語

外泌體近年備受關注，其膜表面有靶向信號，具有較強的器官特異性，可用于疾病的靶向治療。干細胞源外泌體可通過抗凋亡、抗炎、抗纖維化、促進血管生成等作用修復心肌細胞、縮小心肌梗死面積、改善心臟功能，改良后的外泌體可顯著提高其對心臟的保護作用。目前外泌體在心血管治療方面的研究還處于起步階段，其內容物的作用及其介導信息傳遞通路的作用仍有待進一步探究。另外，外泌體的分離需大量原材料且產出不高，未來還需進一步研究外泌體的分離提純技術。盡管在動物實驗和細胞實驗方面外泌體治療AMI的研究取得了一定的進展，但如何應用于臨床還需要深入研究。