血小板膜受體脫落的研究進展

顧亞娟，孟照輝

(昆明醫科大學第一附屬醫院心內科分子心血管病研究室，昆明 650032)

血小板在維持血管壁完整性以及生理止血過程中發揮重要作用。當血管受損時，內皮下的膠原暴露，血小板黏附至血管損傷部位，進一步發生血小板活化、聚集以及釋放凝血因子，最終形成血小板血栓[1]。血小板黏附、聚集的發生主要通過其表面的膜蛋白實現。血小板膜上有多種具有受體功能的糖蛋白(glycoprotein，GP)，這些膜受體主要在信號轉導通路中發揮接受和轉導信息的作用。血小板膜蛋白作為受體與血管性血友病因子、凝血酶或膠原、層粘連蛋白等結合，將一系列信號轉導至細胞內，刺激血小板發生形態改變、分泌釋放各種因子以及促進血小板聚集[2]。因此，血小板膜受體功能異常很大程度上會影響血小板的信號轉導。近年來，血小板膜受體從膜表面脫落的現象引起了人們的關注。研究表明，脫落是蛋白水解酶對膜受體的酶切作用，血小板膜受體有特定的“脫落酶”[3]。血小板膜受體的脫落會使血小板的黏附、聚集、釋放等特性發生改變。檢測膜受體脫落下來的片段一定程度上可以反映血小板的功能變化。目前已發現多種膜受體會發生脫落，其中包括黏附受體、整合素以及黏附分子等[4]，現就血小板膜受體脫落的研究進展進行綜述。

1 脫落與脫落酶

受體脫落是指跨膜受體在細胞膜表面發生不可逆的降解。在生理、病理因素作用下，蛋白水解酶作用于膜表面受體，產生可溶性的胞外片段和膜上殘余片段[5]。血小板膜受體脫落能調節表面受體的表達，降低受體的表面密度，導致受體與配體結合喪失，影響信號轉導，從而調控血小板功能。

受體脫落是一種蛋白水解過程，這個過程需要酶的參與，稱這種酶為“脫落酶”。目前 “脫落酶”主要包含解整合素金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase，ADAM)家族成員、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)家族成員以及鈣蛋白酶，其中ADAM與MMP主要在細胞外對血小板膜蛋白受體發揮水解作用，鈣蛋白酶則是在細胞內參與調節血小板表面受體的脫落[3]。ADAM負責大部分跨膜蛋白的脫落，屬于Zn2+依賴的跨膜金屬蛋白酶超家族，由多個結構域復合而成，包括N端信號序列、前結構域、金屬蛋白酶結構域、崩解素結構域、富含半胱氨酸的區域、類表皮生長因子結構域(ADAM10和ADAM17除外)、跨膜結構域和細胞質尾[6]。人類基因組共鑒定出22個ADAM家族成員，其中有12個(ADAM8、9、10、12、15、17、19、20、21、28、30和33)編碼蛋白活性酶，目前研究較多的是ADAM10和ADAM17[7]。ADAM10和ADAM17能切割具有不同功能的底物，其中ADAM10至少有40種底物[8-9]。血小板上的ADAM10底物包括GPⅥ、GPⅤ、CD44、CD84、淀粉樣前體蛋白和表皮生長因子，ADAM17的底物主要是GPⅠbα和GPⅤ[7]。ADAM切割膜蛋白的過程中，四跨膜蛋白(tetraspanins，Tspan)作為“伴侶”分子發揮了調節作用[10]。研究證實，Tspan14在人和小鼠的血小板中表達，Tspan14過表達抑制了ADAM10的切割，保護靜息血小板上GPⅥ免受ADAM10的切割而不脫落[11]。Tspan5能促進CD44脫落，而Tspan15則抑制淀粉樣前體蛋白脫落[12]。除Tspan會影響膜蛋白受體的脫落外，ADAM的自身活性也有重要作用。雖然對于ADAM活性的調控機制尚不清楚，但快速激活ADAM10和ADAM17依賴于跨膜結構域而不是細胞質尾，其活性可因細胞內Ca2+水平的升高而上調[13]。也有證據表明，ADAM10可能通過改變底物的細胞內信號介導膜受體的脫落，黏附分子CD44的磷酸化可導致其胞外結構域發生構象變化，使之更容易脫落[14-15]。

2 多種血小板膜受體的脫落

2.1GPⅠb-Ⅸ-Ⅴ GPⅠb-Ⅸ-Ⅴ復合物由4個跨膜糖蛋白(GPⅠbα、GPⅠbβ、GPⅨ和GPⅤ)組成，4個亞基均屬于富含亮氨酸重復序列的蛋白質家族[16]。GPⅠbα通過二硫鍵與GPⅠbβ連接形成GPⅠb，然后GPⅠb再以非共價方式與GPⅨ和GPⅤ相連，最終形成復合物[17]。GPⅠbα是該受體復合物的主要配體結合亞基，由1個球形N端配體結合結構域、1個唾液酸核心、1個跨膜結構域和1個細胞質尾組成[18]。GPⅠbα能夠結合多種配體，與血管性血友病因子結合介導血小板黏附的發生。此外，GPⅠbα的胞外域還能與FⅪ、FⅫ、凝血酶、高分子量激肽原、血小板反應蛋白、白細胞整合素αMβ2和P-選擇素等多種配體結合，在凝血和免疫調節中發揮重要作用[19]。因此，GPⅠbα胞外結構域的完整性對其功能的正常發揮至關重要。GPⅠbα膜近端序列包含血小板脫落酶的切割位點，ADAM17是其主要脫落酶[20]。將GPⅠbα的膜近端序列(Lys450-Phe483)合成肽與ADAM17作用后進行質譜分析發現，ADAM17能在Gly464/Val465位點切割GP Ⅰ bα[21]。在脫落酶的作用下，GPⅠbα的N端斷裂釋放出可溶性的GPⅠbα片段。免疫印跡可在靜息狀態的洗滌血小板上檢測到完整的GPⅠbα、GPⅠbα的N端脫落片段以及殘存的C端片段[21]。

2.2GPⅥ GPⅥ屬于免疫球蛋白超家族成員，由2個胞外免疫球蛋白結構域、1個短黏蛋白結構域、1個膜近端序列、1個跨膜結構域和1個細胞質尾組成[1]。GPⅥ通過與FcRγ結合形成復合物發揮作用，FcRγ含有免疫受體酪氨酸激活基序，免疫受體酪氨酸激活基序激活Syk激酶并啟動下游信號通路，導致血小板分泌ADP等激動劑，進一步使血小板活化、聚集[22]。膠原、膠原相關肽、驚厥蛋白等與GPⅥ結合后活化血小板，激活蛋白水解通路，導致GPⅥ的胞外域脫落。研究表明，GPⅥ胞外膜近端序列包含一個脫落酶切割位點，參與GPⅥ蛋白水解的脫落酶是ADAM10，免疫受體酪氨酸激活基序激活導致GPⅥ被ADAM10切割[22]，切割后產生一個約55 kDa的可溶性GPⅥ片段和約10 kDa的膜相關殘余片段[21]。由于GPⅥ的脫落具有金屬蛋白酶依賴性，激活或抑制金屬蛋白酶的活性會影響GPⅥ脫落。變性劑N-乙基馬來酰胺可直接激活ADAM10誘導GPⅥ脫落，也可通過鈣調蛋白抑制劑抑制鈣調蛋白對金屬蛋白酶的調控作用，誘導GPⅥ脫落；而乙二胺四乙酸、廣譜的金屬蛋白酶抑制劑GM6001、腫瘤壞死因子以及磷脂酰肌醇激酶、Syk激酶等GPⅥ信號轉導相關的抑制劑則會阻斷GPⅥ的脫落[23]。

2.3整合素 整合素是血小板膜上的黏附受體，主要發揮作用的是αⅡbβ3，通過與血管性血友病因子、纖維蛋白原或其他配體結合介導血小板聚集，從而在血栓形成過程中發揮關鍵作用。目前發現，在血小板內，鈣蛋白酶對整合素β3有水解作用[24]。鈣蛋白酶能切割β3的細胞質尾部，即水解NXXY基序，這段基序對于配體結合、雙向信號的轉導以及細胞骨架的連接有重要作用[25]。關于血小板表面整合素的脫落尚未被廣泛探討，但在其他細胞表面發現存在整合素脫落現象，對白細胞整合素αLβ2的研究表明，一個未確定的蛋白酶既能切割β2的膜近端區域，又能切割αL釋放一個可溶性的胞外片段[26]；在巨噬細胞中，MMP-9能使整合素β2亞基脫落[27]。因此推測血小板表面可能也存在整合素脫落，但發揮作用的脫落酶以及脫落后對血小板功能有無影響有待深入研究。

2.4血小板內皮細胞黏附分子-1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1) PECAM-1是在血小板和血管內皮細胞上表達的糖蛋白受體，具有黏附和信號轉導的特性。PECAM-1由胞外免疫球蛋白結構域、跨膜結構域和細胞質尾組成，胞質結構域含有一個免疫受體酪氨酸抑制基序，承擔信號轉導的作用[28]。PECAM-1的脫落在內皮細胞和血小板中均有發生。在內皮細胞中，PECAM-1在細胞凋亡過程中被caspase和MMP切割[28]；在血小板中，高剪切應力下血小板上表達的PECAM-1發生裂解脫落，鈣蛋白酶切割PECAM-1的免疫受體酪氨酸抑制基序的上游，從而使受體失活[29]。PECAM-1的脫落受鈣調蛋白調節，在細胞質尾部的近膜區域含有一個鈣調蛋白結合序列，鈣調蛋白抑制劑可誘導PECAM-1的水解脫落[30]。PECAM-1的脫落對血小板功能的影響仍有待深入研究。有研究表明，PECAM-1能負性調控血小板-膠原的相互作用，PECAM-1缺陷小鼠的血小板對膠原蛋白刺激的血栓形成反應增強[31]，推測PECAM-1脫落可能也會影響血栓的形成。

2.5癌胚抗原相關細胞黏附分子1(carcinoembryonic antigen related cell adhesion molecule 1，CEACAM1) CEACAM1是癌胚抗原超家族的一員，屬癌胚抗原相關細胞黏附分子類，是廣泛表達于免疫細胞、血液細胞、上皮細胞以及內皮細胞的Ⅰ型跨膜受體，主要介導細胞間的同質黏附和異質黏附[32]。Wong等[33]發現，與野生型相比，CEACAM1-/-小鼠的血小板Ⅰ型膠原介導的血小板聚集、顆粒黏附和分泌增加；在膠原和腎上腺素誘導的小鼠急性肺血栓模型中，CEACAM1-/-小鼠較野生型小鼠更易發生肺血栓栓塞。以上研究表明，CEACAM1是血小板-膠原相互作用的負調節因子，缺乏CEACAM1會影響血小板的功能，進而影響血栓形成。既往研究發現，細胞凋亡可導致CEACAM 1胞內段和胞外段雙脫落，caspase-1、3、7介導凋亡細胞CEACAM1的脫落[34-35]。此外，MMP可能也介導CEACAM1脫落。研究表明，人血小板表達MMP-12，MMP-12可在幾個位點切割CEACAM1胞外段并產生若干短肽，在這些片段中，WYKG可促進Ⅰ型膠原誘導血小板α顆粒分泌[36]。進一步研究發現，MMP-12切割CEACAM1后產生的另一個短肽QLSN能抑制GPⅥ介導的血小板活化，顯著減輕膠原誘導的血小板黏附、聚集[37]。上述研究表明，脫落產生的片段仍然可能具有活性，在調控血小板功能上發揮重要作用。

2.6其他膜蛋白受體的脫落 循環系統中的CD40L主要存在于血小板中，活化的血小板表面表達CD40L，裂解后可產生可溶性CD40L片段。與CD40L脫落直接相關的酶尚未被清楚地識別出來，但研究發現，MMP-2與整合素αⅡβ3相互作用后能使CD40L脫落，并且增強血小板的活化[38]。人血小板表達的免疫細胞受體信號素4D(semaphoring 4D，Sema4D)參與調控血栓形成，在動脈血栓模型中，缺乏Sema4D的小鼠表現出閉塞性血栓減少，表明在佛波酯、膠原或其他激動劑激活的血小板上，Sema4D的表達增加，促進血栓形成；隨后在MMP的介導下，Sema4D脫落釋放一個可溶性胞外片段，影響了血栓的繼續形成[39]。另外，G蛋白偶聯受體也可能受MMP依賴的細胞外蛋白水解途徑的調節，蛋白激活受體-1是凝血酶的G蛋白偶聯受體，N端胞外結構域在ADAM17介導下脫落[40]，但其生理作用目前尚不確定。

3 血小板膜受體脫落的臨床意義

血小板膜受體的脫落可下調血小板表面受體的密度，進而影響血小板的生理功能，在血栓形成、血小板衰老及清除中起重要作用，脫落的胞外片段可能成為潛在的血小板特異性生物標志物。

血小板膜受體的表面密度與血栓形成和出血風險相關，血小板膜受體的脫落可能導致血栓形成風險降低、出血風險增加。GPⅥ與膠原和層粘連蛋白結合，介導血小板的釋放、聚集，GPⅥ缺失不利于血栓形成[41]。血小板表面GPⅥ缺陷小鼠可能導致無法維持穩定的血管閉塞[42]。血栓穩定性降低的原因可能與膠原和纖維蛋白結合減少，以及產生凝血酶的能力降低有關。在血小板表面缺乏GPⅠbα胞外域表達的轉基因小鼠中，血栓形成明顯受損[43]，表明血小板表面GPⅠbα的脫落可能會對血栓形成產生一定的影響。研究表明，機械循環支持下的重癥患者血小板表面的GPⅠbα和GPⅥ減少，GPⅠbα和GPⅥ的脫落可通過抗血栓形成而增加出血風險，血漿可溶性胞外片段中GPⅥ的升高，有助于評估接受左心室輔助裝置治療心力衰竭患者的出血風險[44]。人血漿可溶性GPⅥ水平升高可由多種潛在原因造成，包括膠原暴露增加，炎癥、代謝紊亂或感染引起的血小板高反應性，動脈狹窄或其他原因引起血流動力學和剪切應力改變，凝血病以及抗血小板抗體相關的自身免疫性疾病[45]。在心腦血管疾病方面，血漿可溶性GPⅥ水平在動脈粥樣硬化性疾病中存在顯著差異，包括腦卒中、冠狀動脈疾病、心房顫動、合并單支血管狹窄的冠心病、彌散性血管內凝血和血栓形成性微血管病變[46-50]。可溶性GPⅥ可能成為反映個體血小板相關變化的更敏感的標志物。

此外，血小板膜受體的脫落與血小板的衰老、清除有關。正常循環中的血小板存在一定比例的GPⅠbα水解脫落，這些脫落的GPⅠbα片段在一定程度上反映了血小板功能。研究表明，GPⅠbα的脫落與冷藏血小板的清除機制有關，GPⅠbα的脫落影響受體的密度，進而影響血小板與吞噬細胞的相互作用，從而調節清除[51]。除冷藏血小板會發生GPⅠbα脫落外，實驗損傷或老化的血小板也會發生脫落[20,52]。因而GPⅠbα脫落可能是血小板老化的一個標志。與GPⅠbα不同，GPⅥ水平較穩定，在正常循環血小板中僅檢測到GPⅥ的完整形態，未檢測到GPⅥ的水解脫落片段[21]。但血小板在儲存過程中GPⅥ逐漸降低，與其脫落水平的增加有關[53]，GPⅥ的逐漸脫落減弱了血小板的黏附和聚集特性[54]。

4 結 語

血小板功能的發揮離不開膜受體，既往研究主要集中于血小板膜受體的激活及其對應的信號通路，這些受體的下調機制較少被關注。脫落是血小板膜受體的下調機制之一。膜受體在膜表面附近被脫落酶切割，隨后將脫落片段釋放入血漿。目前已發現多種血小板膜受體會發生脫落，這些受體的脫落導致受體水平失衡，導致血小板受體與其相應配體無法正常結合，不同程度地影響受體介導的血小板活化、黏附、釋放、聚集等過程，進而影響血小板的止血功能，表明血小板膜受體的脫落可能為抗血小板、抗血栓治療提供新的途徑。另外，受體脫落的結果是可溶性片段的生成，這意味著這些血漿可溶性片段很有可能作為調節因子發揮作用，或成為反映個體血小板狀態的特異性生物標志物。但目前對血小板膜受體的脫落機制及其影響仍缺乏全面認識，對其進一步深入研究有助于闡明血小板的病理生理變化。