GRHL3在腫瘤中作用的研究進展

譚林，王騫，陳維順

(中南大學湘雅醫學院附屬株洲醫院 株洲市中心醫院消化內科，湖南 株洲 412007)

GRHL(Grainyhead-like)家族是果蠅GRH(Grainyhead)家族在脊椎動物中的同源家族，在哺乳動物中的表達具有組織特異性和時間特異性，主要分布于上皮組織，對于保持上皮組織的完整性至關重要[1]。近年來，GRHL轉錄因子在癌癥中的作用已被學者廣泛研究。除了作為腫瘤抑制因子的作用外，在許多情況下GRHL還具有促進腫瘤生長的功能，這使它們成為潛在的藥物靶點[2]。GRHL3作為Grainyhead家族中的一員，最早被發現主要參與調控果蠅上皮的發育，后來的研究發現其在包括人類在內的哺乳動物的皮膚屏障形成和內皮細胞的遷移等生理過程中亦發揮重要作用[3]。GRHL3在人類的多種腫瘤中存在異常表達現象，且在腫瘤的發生發展過程中也具有一定的生理意義，特別是在腫瘤細胞的凋亡、遷移和侵襲過程中起重要作用[4]。因此，研究GRHL3在腫瘤中作用的具體分子機制有望為抗腫瘤治療提供新靶點。然而，GRHL3在不同類型腫瘤中的作用可能相互矛盾：在一些腫瘤中發揮促癌作用，而在某些腫瘤中又表現為抑癌效應，且GRHL3與多種腫瘤的預后密切相關，故導致近年其在腫瘤中的作用成為研究熱點。現就GRHL3的生理學功能及其在腫瘤發生發展中的作用予以綜述,以為進一步深入研究GRHL3提供參考。

1 GRHL3概述及其生物學功能

1.1概述 GRHL基因編碼一個高度保守的轉錄因子家族，最初在一個神經管未能完全閉合的果蠅突變體中發現，異常的頭部顆粒細胞會導致粒狀頭部表型，故由此命名該家族基因[5]。隨后該基因家族又相繼在線蟲以及包括人類在內的各種動物體內被發現[6]。GRHL轉錄因子屬于LSF(late SV40 factor)/GRH轉錄因子家族，該家族有兩個分支，其中GRH子族由GRHL1、GRHL2和GRHL3組成，LSF/CP2子族由TFCP2、LBP1a和LBP-9轉錄因子組成[7]。GRHL1、GRHL2和GRHL3具有顯著的序列同源性，表達模式上存在重疊，核心DNA結合位點亦有相同。此外，3個基因編碼的蛋白在N端、DNA結合結構域和C端二聚體上具有高度同源性的相互作用結構域。但3個轉錄因子的表達具有組織特異性[8]，生物學功能也存在差異[9]，且GRHL1和GRHL2無法代替GRHL3在生理過程中的作用[8]。GRHL3作為GRHL家族的成員之一，其在人體染色體中定位于1p36.11，互補DNA全長為1 665 bp，GRHL3蛋白含有555個氨基酸，分子量為70 000[10]。

1.2生物學功能 GRHL3可通過調控多種表皮分化基因的表達，在皮膚屏障形成過程中起重要作用。GRHL3的突變影響包括編碼結構蛋白、細胞黏附分子和脂質加工酶類等在內的表皮分化復合體基因以及多種與終末分化和屏障功能相關的基因表達，使表皮無法形成一個有效的滲透障礙，最終導致表皮水分流失過快和化學物質的透皮吸收增加，以及脆弱的皮膚質量[11]。有實驗表明，敲除GRHL3基因的小鼠出現表皮分化受限，同時存在嚴重的屏障功能障礙，且GRHL3-/-小鼠角質層的形成，顆粒層細胞外脂質成分的形成和細胞黏附均受到抑制，甚至因無法形成足夠的表皮屏障在出生時即出現嚴重脫水而死亡[12-13]。GRHL3可調控胚胎發育過程中表皮切口的愈合。哺乳動物切口愈合需要在上皮層平面協調細胞的運動，在此過程中GRHL3可通過調控Rho蛋白鳥苷酸交換因子19的表達影響肌動蛋白的聚合和細胞極性，進而調節切口愈合的過程和調控細胞骨架的重組和細胞遷移[14]。所以GRHL3表達缺失的小鼠會出現切口愈合障礙。

GRHL3通過調控上皮遷移影響哺乳動物發育過程中多種生理結構的閉合。GRHL3表達于神經管閉合中發育的神經褶，主要參與調節神經褶區域外胚層中上皮細胞的遷移和分化活動，進而影響神經褶的發育和神經管閉合過程。GRHL3在小鼠中表達缺失時，因神經管畸形而出現嚴重的脊柱裂和顱腦畸形[15]。GRHL3可通過調控F-肌動蛋白聚合、絲狀偽足形成以及細胞形態變化影響眼瞼前緣部分角質形成層細胞的遷移，故GRHL3基因敲除的小鼠還會出現眼瞼閉合障礙[16]。在GRHL3基因敲除的小鼠眼瞼中，因腫瘤壞死因子-α的表達受到抑制，降低了表皮生長因子受體和胞外信號調節激酶的磷酸化水平，導致小鼠角質形成層細胞無法遷移而不影響組織愈合[17]。

GRHL3是內皮細胞遷移所必需的分子，且其作用不需依賴血管內皮生長因子的參與[18]。有研究表明，轉染GRHL3后的人臍靜脈內皮細胞遷移能力得到提升。GRHL3可誘導蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)和內皮中一氧化氮合酶的磷酸化，且一氧化氮依賴性遷移完全取決于GRHL3的表達[19]。此外，因GRHL3可抑制內皮細胞的凋亡，內皮細胞的功能會由于GRHL3表達的缺失而紊亂[20]。

2 GRHL3在腫瘤發生發展中的作用

有研究表明，GRHL3在人類多種惡性腫瘤中存在異常表達現象，尤其在涉及惡性腫瘤的增殖、凋亡、轉移、侵襲等方面具有重要意義[4]。運用慢病毒轉染技術沉默GRHL3基因可以使細胞上皮的極性喪失并獲得間質特性，誘導上皮-間充質轉化的發生，進而促進腫瘤的侵襲和遷移。另有研究表明，運用DNA重組原理對小鼠進行GRHL3基因全面敲除后，小鼠表現出顯著的化學物質致癌易感性和表皮的過度增殖特性，表明GRHL3在某些惡性腫瘤中表現出比較明顯的抑癌作用[21]。可見，GRHL3在不同腫瘤中的作用不同。

2.1GRHL3在鱗狀細胞癌中的作用 Darido等[22]通過體內外實驗證實，在皮膚鱗狀細胞癌中GRHL3作為依賴微RNA(microRNA，miR)-21原致癌網絡的一個靶點，可以直接下調人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphates and tensin homologue deleted on chromosome ten gene，PTEN)的表達，導致磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號途徑的激活增加和細胞的過度增殖，而胞外信號調節激酶1/2的磷酸化受到抑制，起抑癌作用；且GRHL3基因敲除的小鼠表現出表皮過度增殖和對化學致癌作用的易感性以及自發性皮膚腫瘤形成，進一步驗證了GRHL3的抑癌特性[22]。而Bhandari等[23]研究顯示，GRHL3可結合并抑制miR-21的啟動子，說明這兩種因子可相互影響，參與形成了一個調節回路。Saffarzadeh等[24]采用TCGA(The Cancer Genome Atlas)數據庫分析得出，GRHL3在不同病理分期的頭頸部鱗狀細胞癌組織中的表達水平均低于正常組織；隨后應用實時熒光定量聚合酶鏈反應驗證得出，癌旁非腫瘤組織中GRHL3信使RNA表達水平為頭頸部鱗狀細胞癌組織的4.21倍，可作為該腫瘤的潛在生物標志物。但亦有研究表明，在頭頸部鱗狀細胞癌中GRHL3的缺失并沒有激活PTEN/PI3K/Akt/mTOR信號通路，而是誘發了糖原合成酶激酶-3β的減少，導致c-Myc表達的上調，進而增強鱗狀細胞癌的侵襲和轉移能力[25]，可見GRHL3/糖原合成酶激酶-3β/c-Myc信號軸是頭頸部鱗狀細胞癌發生發展的重要參與者。鄧慶梅等[26]研究也發現，GRHL3在皮膚鱗狀細胞癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織和正常皮膚組織，且與皮膚鱗狀細胞癌的TNM分期密切相關，過表達GRHL3可促進人皮膚鱗狀細胞癌A431的遷移和侵襲。進一步對GRHL3過表達的A431細胞基因表達譜進行分析發現，有128個差異表達基因與細胞的侵襲和遷移能力密切相關，而其中26個基因與染色質免疫共沉淀測序提示的GRHL3調控細胞侵襲和遷移相關的候選靶基因一致。可見，GRHL3不僅在不同類型的鱗狀細胞癌中的作用不同，而且在同一種類型的鱗狀細胞癌中的作用亦存在爭議。

2.2GRHL3在乳腺癌中的作用 在早期的報道中，有學者提出鋅指蛋白652在正常乳房上皮細胞中抑制GRHL3，但在癌細胞中抑制作用消失或減弱[27]。有研究者發現，低侵襲性的乳腺癌細胞系中過表達GRHL3可明顯增強細胞的遷移和侵襲能力，而敲低侵襲性較強的乳腺癌細胞系中的GRHL3時，腫瘤細胞的遷移和侵襲能力明顯受到抑制[28]。亦有研究發現，GRHL3在乳腺癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織，且在乳腺癌細胞中GRHL3對分揀連接蛋白16(sorting nexin 16，SNX16)的啟動子具有負調控作用，其可通過結合SNX16的啟動子抑制SNX16的表達，進而促進乳腺癌細胞的遷移和侵襲[29]。由此可見，轉錄因子GRHL3在乳腺癌中起促腫瘤作用。然而，Xu等[30]在臨床研究中發現GRHL3在非三陰性乳腺癌及早期乳腺癌組織中的表達水平明顯高于進展期乳腺癌組織，且在三陰性乳腺癌中的表達水平最低；同時，GRHL3的表達水平與患者臨床分期及組織學分級呈正相關，是乳腺癌的獨立預后因素。在另一項研究中，GRHL3表達陽性的乳腺癌患者總生存率高于GRHL3表達陰性的患者，且在有淋巴結轉移的情況下，GRHL3表達陽性的乳腺癌患者生存期相對較長，研究者推測以上機制可能涉及GRHL3直接調節上皮鈣黏素的表達水平而影響上皮-間充質轉化的發生[31]。可見，GRHL3在不同類型及分期的乳腺癌中發揮的作用不同，其中的具體分子機制仍需深入探討。

2.3GRHL3在食管癌中的作用 韓曉楠等[32]研究發現，在食管癌組織和細胞中GRHL3的表達水平顯著高于癌旁正常組織和細胞，且在食管癌組織中GRHL3的表達與腫瘤浸潤程度、淋巴結轉移、臨床分期、腫瘤分化程度呈正相關；進一步研究發現，在食管癌組織中GRHL3和c-Myc在信使RNA水平和蛋白水平的表達也呈顯著正相關，敲低GRHL3的表達后，食管癌細胞克隆形成能力、增殖活性、遷移及侵襲能力均顯著降低，同時伴隨上皮鈣黏素蛋白的表達水平升高以及神經鈣黏素蛋白和c-Myc蛋白的表達水平降低。提示GRHL3可能通過調控c-Myc通路誘導食管癌的惡性行為，其機制可能與促進上皮-間充質轉化的發生有關。然而，Liang等[33]通過分析Oncomine數據庫發現，與正常組織相比，食管癌組織中的GRHL3表達下調，miR-194可能通過靶向抑制GRHL3的表達激活PTEN/Akt信號通路，進而促進食管癌細胞的增殖和遷移。可見，GRHL3在食管癌中的作用仍存在爭議，有待進一步探討。

2.4GRHL3在彌漫大B細胞淋巴瘤中的作用 李麗美等[34]通過對168例彌漫性大B細胞淋巴瘤患者組織行免疫組織化學檢測得出：彌漫性大B細胞淋巴瘤非生發中心型組織中GRHL3的陽性表達率高于生發中心型，且在生發中心型彌漫性大B細胞淋巴瘤中的陽性表達率僅為14.28%。已有研究顯示，GRHL3-PTEN-PI3K-Akt-mTOR為重要抑癌途徑[22]；Pfeifer和Lenz[35]也已證實，在超過半數的生發中心型彌漫性大B細胞淋巴瘤病理組織中PTEN的表達缺失可激活PI3K-Akt通路導致腫瘤細胞增殖，故推測生發中心型彌漫性大B細胞淋巴瘤的發病機制可能是GRHL3蛋白的缺失引起PTEN的缺失，從而激活通路導致腫瘤發生；此外，在非生發中心型彌漫性大B細胞淋巴瘤中GRHL3蛋白的表達與腫瘤的Ann Arbor分期、乳酸脫氫酶水平、淋巴結外累及情況及國際預后指數評分呈正相關，提示GRHL3與非生發中心型彌漫性大B細胞淋巴瘤的發生、發展密切相關。Liu等[36]發現，GRHL3陽性表達的彌漫性大B細胞淋巴瘤患者5年生存率明顯低于GRHL3陰性表達患者，且GRHL3的表達是患者生存不良的獨立預測因子。因此，GRHL3在彌漫性大B細胞淋巴瘤中起促癌作用，且可能作為判斷患者預后的潛在生物標志物。

2.5GRHL3在結直腸癌中的作用 Wang等[37]通過對進展期結直腸癌患者的癌組織和癌旁組織行微陣列分析顯示，GRHL3在結直腸癌中占主導地位，且GRHL3在結直腸癌細胞株中的表達水平明顯高于人正常腸黏膜細胞株，下調GRHL3的表達可抑制結直腸癌細胞的體外增殖、侵襲和遷移及使細胞在G0/G1期細胞周期阻滯，誘導細胞凋亡。Yuan等[38]基于GEPIA和HPA數據庫分析得出：GRHL3信使RNA和蛋白在癌組織中的表達水平均顯著高于正常結腸組織，且其表達量與腫瘤的TNM分期呈正相關，與患者的生存期呈負相關；而下調GRHL3的表達可抑制結腸癌細胞的增殖能力。綜上可知，GRHL3在結直腸癌中高表達，且與結直腸癌的發生發展、侵襲轉移以及預后密切相關，其有望成為治療結直腸癌的新靶點及判斷患者預后的分子標志物。

2.6GRHL3在胃癌中的作用 許易誠等[39]研究發現，GRHL3在胃癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織，且GRHL3蛋白的陽性表達與胃癌患者的TNM分期呈明顯正相關，GRHL3高表達胃癌患者的術后5年生存率明顯低于GRHL3低表達患者，GRHL3高表達是影響胃癌患者預后的獨立危險因素，提示GRHL3可能參與了胃癌細胞的遷移、侵襲和轉移。故推測檢測胃癌組織中GRHL3基因的表達水平有助于分辨腫瘤的惡性程度以及預測患者的預后。

2.7GRHL3在肝癌中的作用 蔡文文[40]發現，GRHL3在肝癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織和正常肝組織，且與患者的血清甲胎蛋白水平、TNM分期、病理分化程度密切相關；同時，GRHL3與肝癌多藥耐藥基因1(multidrug resistance gene 1，MDR1)在肝癌組織中的表達呈正相關；進一步研究發現，肝癌耐藥細胞系中GRHL3和MDR1的表達量明顯高于敏感株細胞系，且過表達GRHL3的敏感株細胞中MDR1的表達水平明顯升高，而下調GRHL3的耐藥細胞株中MDR1的表達水平明顯下降。這表明GRHL3在肝癌中高表達，且可能通過對MDR1表達的正向調控在肝癌耐藥的發生發展中起至關重要的作用。

3 小 結

GRHL3作為GRHL家族成員之一，因其具有促進某些細胞的凋亡、變形、運動和遷移等重要生理學功能，故在人體正常生長發育過程中發揮重要作用。由于GRHL3在這些方面的功能與腫瘤細胞的凋亡、遷移和侵襲具有高度的相似性，或兩者是一致的，導致其在腫瘤中的作用成為近年研究熱點。然而，GRHL3在不同類型惡性腫瘤中發揮的作用不同，甚至在同一種類型腫瘤中的作用亦存在爭議，所以對GRHL3在腫瘤中的作用及其分子機制的研究仍有待進一步深入，以期未來使其成為一種新的生物學標志物以指導臨床診斷和治療。