免疫抑制性細胞在免疫性血小板減少癥中的作用

陸 皓，陳海琳，鮑計章，周永明

（上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院血液科，上海 200437）

免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）又稱為特發性血小板減少性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP）是一種由抗體和細胞介導的血小板破壞增多所引起的自身免疫綜合征，該病患者比正常人群更具出血傾向[1]。關于ITP 的發病率，國內尚無確切的資料，來自國外的研究估計成人ITP 的年發病率約5/100,000～10/100,000[2-4]；而我國臺灣地區以及美國、法國的研究都發現在在幼兒和老年人中ITP 的發病率更高[3-5]，同時美國及法國的研究數據顯示，總體而言女性的發病率略高于男性[3，4]。導致抗血小板自身免疫的最初事件尚不清楚。在非病理條件下，免疫系統受體液和細胞成分的精細調節。目前已經發現，ITP 患者的T 細胞異常，輔助性T 細胞Th1/Th2 比值失衡，T 細胞對自體血小板的細胞毒性增強。ITP 又存在由B 細胞產生主要針對血小板表面蛋白的自身抗體增強，對患者血小板上表達的自身抗原失去免疫耐受。而自體反應性T 細胞的異常增殖導致對血小板抗原免疫耐受性的破壞，可能是產生自身抗體B 細胞增殖上調的原因[6]。越來越多的研究表明，包括調節性T 細胞（Tregs）、調節性B 細胞（Bregs）、骨髓來源抑制性細胞（MDSCs）、間充質基質細胞（MSCs）等在內的免疫抑制性細胞在ITP 發病過程中發揮著重要作用，了解其相關機制有望為ITP 的靶向治療提供新的途徑。

1 調節性T 細胞

Tregs 存在于健康人外周血和脾臟中，占單個核細胞1%～2%，CD4+T 淋巴細胞的5%～10%，在自身免疫性疾病的發生和發展中起重要作用[7]。Tregs 是限制免疫和保證免疫耐受的關鍵檢查點，目前研究較多的是檢測CD4+CD25+Treg 細胞。與正常對照相比，ITP 患者，尤其是活動性ITP 患者和未緩解ITP患者，其外周Treg 數量明顯減少[8-10]，而治療有效的ITP 患者，Treg 數量會增高[11-15]。

此外，濾泡輔助性T 細胞（follicular helper T cell，Tfh）為新近發現的效應性T 細胞亞群，是輔助生發中心B 細胞產生抗體的主要細胞，其作用可被濾泡調節性T 細胞（follicular regulatory T cell，Tfr）所抑制。梁興林等[16]研究發現，ITP 患者CD4+T 細胞中Tfh 細胞比例高于健康對照組，Tfr 細胞比例、Tfr/Tfh 比值低于健康對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。因此認為，Tfr/Tfh 比值失衡在ITP 發病過程中可能起到重要的作用。

目前已發現有些藥物在改善ITP 患者療效的同時可提升Treg 細胞水平。如新診斷為ITP 的成人患者CD39+Treg 細胞不僅數量減少，而且CD39 酶活性受損。大劑量地塞米松治療后，上述兩種缺陷均見逆轉[17]。有研究[18]對72 例ITP 患者分別采用常規劑量和大劑量地塞米松治療7～14 d 后，結果顯示患者血小板計數提高，同時CD4+CD25+Treg 細胞水平明顯提高，且大劑量地塞米松療效及Treg 細胞水平均明顯優于常規劑量組。

目前，以Treg 為靶標的ITP 治療取得了不小進展。然而，Treg 功能的恢復是緩解疾病的直接原因，或僅僅是免疫耐受恢復的一個標志尚不清楚。因為，也有研究表明ITP 患者外周血中CD4+CD25-Foxp3+水平表現為升高[19]；另外還有研究表明，ITP 患者在外周血中以CD4+CD25highFoxp3+定義的Treg 細胞與正常對照無差異[20-22]，但在其他組織如骨髓和脾臟中Treg 數量也是減少的[20，21]。出現以上不同的研究結果，可能在于ITP 患者的發病機制具有異質性，也可能與所述研究的樣本量大小、疾病活動程度、年齡、種族差異性等因素有關。值得強調的是，Treg 細胞有不同標志物不容忽視，目前為止，檢測到的Treg 細胞的標記物不同，包括CD4+CD25+、CD4+Foxp3+、CD4+Foxp3+CD25+、CD4+Foxp3+CD127low/–、CD4+CD25+CD127low/–等不同表型[23]。

迄今大多數研究表明，Treg 的數量和功能的異常在ITP 發病中起到了一定的作用，較低的Treg 頻率導致自我耐受性的下降，據此可以為開發特異性免疫調節療法奠定基礎。此外，Treg 頻率對兒童慢性ITP 的自然過程和長期結局具有預后意義[11]。

2 調節性B 細胞

Breg 是B 細胞的一種亞型，Wolf SD 等[24]首次提出了B 細胞在自身免疫性疾病具有負性調節作用。Mizoguchi A 等[25，26]將其命名為調節性B 細胞，并認為Breg 可以通過產生負向細胞因子（如IL-10與TGF-β）參與免疫調節或通過細胞與細胞間的直接接觸而發揮負向免疫調節作用。目前Breg 細胞表面標志物報道眾，Claudia M 等[27]統計人類Breg細胞免疫分型包括CD19+CD24hiCD38hi、CD19+CD24hiCD27+、CD19+CD38+CD1d+IgM+CD147+、CD25hiCD71hiCD73lo、CD27intCD38hi、CD39+CD73+等。目前認為[28，29]，Breg 在ITP 患者外周血中明顯低于正常對照組，Breg 可通過分泌細胞因子IL-10 及TGF-β 抑制反應性T 細胞的活性及抑制B 細胞產生抗體，并能促進Treg 的分化與增殖而介導機體免疫耐受，其功能失調及數量減少可能導致自身免疫病的發生。

ITP 患者體內存在Breg 的免疫缺陷，探討針對Breg 靶向治療，抑制ITP 的發生發展，可望為ITP 的治療提供新的思路。Fang J 等[30]研究發現，49 例ITP患兒CD19+CD24highCD38high Breg 的頻率明顯低于正常對照組，經甲基強的松龍加靜脈注射免疫球蛋白治療后，CD19+CD24highCD38high Breg 水平基本恢復正常。韓曉丹等[31]給予ITP 患者利妥昔單克隆抗體、地塞米松、環磷酰胺治療2 周，結果發現12例患者中6 例（50.00%）獲得完全緩解，4 例（33.33%）部分緩解，總有效率達83.33%；此外，患者的血小板計數和外周血中Breg 細胞、Treg/Th17 比值較治療前升高，差異均有顯著統計學意義（P＜0.05）。

總之，以Breg 細胞為靶標的研究雖取得了一定進展，但是在一個復雜的分子網絡中，Breg 細胞作為一個調節細胞和效應細胞在多大程度上發揮作用仍具有很大深入探索空間。

3 骨髓來源的抑制性細胞

MDSCs 是一群來源于髓系，且未分化成熟的異質性免疫抑制細胞，其特點是能夠顯著抑制T 細胞應答，并在腫瘤、炎癥和感染等狀態下擴增[32]。MDSCs 的表型是異質的，但這些細胞大多是人類的CD33+/CD11b+/HLA-DR-未成熟髓樣細胞[33]。MDSC通過分泌精氨酸酶、一氧化氮合酶（iNOS）和活性氧（ROS）抑制T 細胞異常活化[34]，與Treg 細胞具有相似的功能。此外，MDSC 對Treg 細胞的分化和成熟至關重要[35]。由于Treg 細胞在ITP 發病機制中具有重要作用，因此推測MDSCs 也可能參與ITP 的免疫失調機制。大量研究表明[36-38]，經糖皮質激素治療后完全緩解的ITP 患者的MDSCs 數量明顯高于對照組；同時新診斷的ITP 患者的MDSCs 明顯高于復發的ITP 患者，同時低于完全緩解組。但目前針對MDSCs 為靶標的ITP 療效相關性研究數量尚有限。有關MDSCs 在ITP 發生發展中的作用有待進一步深入研究，期待有新的發現。

4 間充質基質細胞

MSCs 是一種間充質來源、非造血的干細胞，具有自我更新的能力。骨髓源性間充質干細胞（BMMSCs）是造血微環境中的重要組成部分，分泌多種細胞因子，包括白細胞介素6（IL-6）、白細胞介素10、白介素11、前列腺素、干細胞因子（SCF）和白血病抑制因子，可誘導巨核細胞的生物發生和成熟。而巨核細胞生成的任何階段的改變都會影響血小板的產生。MSCs 可通過改變樹突狀細胞、效應T 細胞（Th1 和Th2）和自然殺傷細胞的細胞因子分泌功能，在生理條件下誘導免疫抑制或耐受表型。這些細胞最重要的特性之一是它們的免疫抑制功能，包括適應性和先天性免疫反應。在不同的自身免疫性疾病中觀察到MSCs 的功能損害。MSCs 缺陷在ITP 的發病機制中也起著作用[6]。研究表明[39]，ITP 患者的MSCs 的特點是凋亡細胞數量增加，抑制活化T 細胞增殖的能力降低。有缺陷的骨髓間充質干細胞目前正在被探索作為治療ITP 的潛在靶點。有報道稱血小板衍生生長因子（PDGF-BB）對MSCs 具有保護作用。PDGF-BB 具有抗細胞凋亡、衰老和免疫調節功能紊亂的作用。一項臨床研究顯示[40]，4 例ITP 患者接受人臍帶間充質干細胞（hUC-MSCs）治療，其中3 例患者在12 個月內達到完全緩解，1 例患者在24 個月內達到完全緩解。hUC-MSC 移植至產生效應的中位時間為12.5 d。首次hUC-MSCs 移植后未使用其他免疫抑制藥物，hUC-MSC 移植期間及術后（中位隨訪期17 個月）均無嚴重不良反應，因而hUC-MSC 移植是治療慢性難治性ITP 的一種合理的搶救性治療方法。

MSCs 具有免疫調節特性。Ping Z 等[41]對ITP 小鼠采用BM-MSC 移植治療發現，ITP 小鼠血小板（PLT）計數顯著升高；與此同時，BM-MSC 組細胞因子（TGF-1、IL-10）、Treg 細胞比例、Foxp3 mRNA 表達水平均明顯增高。該研究結果表明，BM-MSCs 主要通過分泌抑制細胞因子和上調Treg 來提高PLT計數，這可能為人類ITP 治療提供新的方案。另一些研究也有類似發現，陶艷玲的研究顯示[42]，BM-MSCs治療可以升高ITP 小鼠血小板水平，對ITP 小鼠治療具有一定的效果；其有效的治療機制可能與調節Treg 水平和抑制Th1 細胞分泌促炎細胞因子，促進Th2 細胞分泌抗炎細胞因子有關。體外實驗發現[43，44]，MSCs 可顯著上調ITP 患者及正常人T 淋巴細胞中CD4+CD25+T 淋巴細胞比例及CD4+CD25+/CD4+比值，下調ITP 患者CD8+T 淋巴細胞增殖，抑制ITP 患者Th1 類細胞因子的表達。

5 耐受性樹突狀細胞

樹突狀細胞（DC）在免疫系統中扮演免疫應答和免疫耐受兩個角色，其免疫應答功能主要包括抗原提呈（主要由imDC 執行）和免疫激活（主要是mDC 發揮作用）。而發揮免疫耐受功能的DC，被稱之為耐受性樹突狀細胞（tDC）或DCreg。tDC 通過參與中樞耐受期間胸腺中自反應T 細胞的陰性選擇來促進免疫耐受[45-47]。DC 還通過各種機制，包括如細胞因子IL-10、IL-27 和TGFβ 的表達，限制吲哚胺2，3-雙加氧酶（IDO）的表達，并控制細胞外水平的三磷酸腺苷（ATP）和腺苷[48-54]，限制效應T 細胞并促進外周血Treg 分化。有研究證實[55]，在ITP 小鼠模型中，tDC 可抑制血小板計數的下降和血清IFN-γ 水平的升高。樹突狀細胞（DCs）可與Tregs 相互作用，誘導耐受性表型。研究發現，DCs 除了具有免疫原性外，通過表達免疫調節酶吲哚胺2，3-二加氧酶1（IDO1）誘導Treg 來維持自身抗原耐受性也至關重要；反過來，Treg 會調節DCs 的成熟度和/或功能。ITP 患者顯示成熟DCs 將T 細胞轉化為Treg 的能力降低。此外，Treg 產生IL-10 能力降低。總之，ITP患者Tregs 和DCs 之間的交互作用受到阻礙,并起到致病作用[54，55]。動物實驗發現[56]：耐受性樹突狀細胞可以經尾靜脈遷移至脾臟并發揮作用，從而明顯升高ITP 小鼠的血小板數目、降低體內IFN-γ 的水平；耐受性樹突狀細胞緩解ITP 小鼠癥狀的治療機制可能是通過上調小鼠體內Treg 細胞的比例實現。

6 自然殺傷細胞

NK 細胞是一類在宿主防御和免疫監視中發揮著重要作用的天然淋巴細胞[57]。既往認為NK 細胞的主要作用是殺傷細胞，但是越來越多的研究表明NK細胞不僅是重要的固有免疫細胞，同時也具有調控適應性免疫的作用。NK 細胞不是單一功能的同源性細胞群，而是具有多種不同功能的亞群。局部微環境和特定的細胞間接觸可以決定NK 細胞的發育和功能。在病理過程微環境中，NK 細胞在接觸局部炎癥因子后誘導程序性分化和增殖，最終產生具有不同功能的亞群。魏海明等[58]按照功能將這些亞群分為NKtolerant、NKcytotoxic 和NKregulatory 等。近年有研究發現，NK 細胞作為一種免疫調節細胞，在ITP患者外周血中數量減少，發育障礙、功能降低[59-61]。張玉嬌研究[62]發現，ITP 患者體內NK 細胞數量及功能下降，其分化發育過程亦存在異常，且ITP 患者外周血中NK 細胞比例與血小板計數呈正相關，與殺傷T細胞及B 細胞呈負相關。因此認為ITP 患者外周血NK 細胞數量及活性的下降導致其對自身反應性B 細胞及殺傷T 細胞抑制功能下降，從而導致疾病的發生和發展。但也有研究發現，原發性ITP 患者外周血CD3-CD56+NK 細胞均在正常范圍內，未觀察到明顯抑制或激活NK 細胞受體的表達發生重大變化，相比之下，ITP 患者NK 細胞產生IFNγ 的水平低于健康對照組[63]。雖然不同研究結果存在差異可能基于ITP 發病機制存在異質性，但NK 細胞在ITP 發生發展中是否起作用，如何起作用有待進一步論證。

7 巨噬細胞

巨噬細胞源自單核細胞，而單核細胞又來源于骨髓中的前體細胞。因此，巨噬細胞也可看作一種髓原性細胞。巨噬細胞是具有多種作用的異質性細胞，在先天性免疫和適應性免疫中起著關鍵作用。根據外界不同的刺激，巨噬細胞可以向不同的方向極化，主要分為M1 型巨噬細胞，亦稱為經典活化的巨噬細胞，以及M2 型巨噬細胞，也稱為替代活化的巨噬細胞，分別與T 細胞亞群中Th1 型和Th2 型細胞的功能相對應，具有不同的免疫功能。M1 型巨噬細胞為促炎型，主要分泌TNF-α、IL-1β 等炎癥因子；M2型巨噬細胞為抑炎型，主要分泌IL-10，TGF-β 等細胞因子，可以誘導Tregs 細胞的生成[64]。近年許多研究發現，ITP 患者的單核細胞源性巨噬細胞M1 標記物表達增加，免疫抑制功能受損，即M1 標記的巨噬細胞極化異常，M1/M2 失衡參與了ITP 的發病機制。有實驗表明，促進M1 型巨噬細胞凋亡，上調M2型巨噬細胞表達，有可能促使原發性ITP 使疾病得到緩解[65]。地塞米松（HD-DXM）已被公認為ITP 患者的一線治療用藥[66，67]，全反式維甲酸（ATRA）也具有廣泛的免疫調節作用，也被應用于多種藥物治療無效的ITP 患者中[67]。臨床觀察發現，與健康對照組相比，ITP 患者的巨噬細胞具有更高的吞噬能力。在ITP 患者中，單核細胞和巨噬細胞中檢測到TNF-α的分泌增加，巨噬細胞可以直接破壞血小板。HDDXM 或ATRA 治療，通過降低M1 標記表達和增加M2 標記表達可糾正M1/M2 失衡。此外，HD-DXM或ATRA 調節的巨噬細胞抑制CD4+和CD8+T 細胞增殖，并擴增CD4+CD49+LAG3+1 型T 調節細胞，使T 細胞因子向Th2 方向移動，即使用HD-DXM 或ATRA 治療后，應答者表現出明顯誘導出巨噬細胞M2 樣表型和免疫抑制功能[33，68]。這些發現揭示了ITP 的新機制，為ITP 的治療提供了新的策略。

8 總結

ITP 的發病機制非常復雜，患者對不同治療的反應非常不一致，但ITP 是一組具有共同特征的疾病，即對血小板抗原免疫耐受喪失和原發凝血功能障礙，免疫失調是其本質。隨著研究的深入，調節性免疫細胞的負性調節作用越來越受到重視。其中Treg 無疑在免疫抑制中扮演了重要的角色，對于ITP 的發病與治療都有十分重要的意義。雖然免疫抑制性細胞在ITP 發病過程作用的研究還有待深入，但是現有的研究已充分顯示包括調節性B 細胞、骨髓來源的抑制性細胞、間充質基質細胞、耐受性樹突狀細胞、NK 細胞、巨噬細胞等細胞所起的作用也不可忽視。大量研究表明，ITP 的發病不是單單一類或幾類免疫細胞數量或功能發生異常而導致的，圍繞著Treg、Breg 及各種細胞共同參與織就了一張免疫失調的“大網”。理清這些細胞間的關系及相互作用有助于更好的探索ITP 的真正病機，尤其是探明這些細胞的共同通路以及細胞因子相互作用有助于提高對ITP 發病機制的認識，從而提高臨床對該病的治療。