循環腫瘤細胞在胰腺癌診療中的應用

程浩，仇毓東

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）是一種預后極差的消化系統惡性腫瘤，2020年全球癌癥數據顯示：PC的死亡病例數與新發病例數相當［1］。2021年最新數據顯示，其5年生存率僅為10%［2，3］。但一組來自日本的研究數據顯示，小于2 cm的Ia期PC預后良好，5年生存率可達到68.7%，原位癌的5年生存率更是高達85.8%［4］。因此，提高早期診斷率對于改善PC不良預后至關重要［5］。另一方面，即使接受了根治性切除，許多PC患者仍然死于術后早期復發和轉移，可能的原因是術前評估沒有辦法確定是否已經存在微轉移病灶［6］。當前，PC的術前可切除性主要根據影像學，迫切需要研發真正的生物學指標［7］。近年來，以化療為主的系統治療、輔助治療以及新輔助治療水平的進步在改善PC預后中發揮了重要的作用［8-10］。但目前仍缺乏合適的生物標志物來評估療效，指導方案的優化。

循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）作為從原發灶或轉移灶進入血循環的少量腫瘤細胞，在包括PC在內的多種腫瘤的早期診斷、預后評估、療效監測等方面受到了廣泛的關注［11］。本文擬對CTCs在PC精準診療中的作用及意義，做一個系統綜述和評價。

1 CTCs與PC的早期診斷

PC起病隱匿，早期診斷十分困難［12］。影像學和血清標志物是臨床上最常用的診斷工具［13］。當前，PC的早期診斷尚缺乏有效的生物標志物。血清CA19-9有較高的敏感性，但其在多種非PC的疾病中均會有升高（如胃腸道腫瘤、合并黃疸的膽道疾病等）。約10%的患者因Lewis抗原陰性而不表達CA19-9，因此單獨依靠CA19-9對于PC早期診斷價值有限［14-16］。

近年來，CTCs在PC早期診斷中的價值日益受到重視。Rhim等［17］在PC癌前病變（導管內上皮內瘤變，PanIn）的小鼠外周血中已經可以檢測到單個突變細胞。隨后的臨床驗證性研究中發現［18］，33%胰腺導管內乳頭狀腫瘤（intraductal papillary mucinous neoplasms，IPMN）和黏液性囊腺瘤（mucinous cystic neoplasm，MCN）患者的外周血中可檢測到CTCs，73%胰腺導管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）患者的外周血中可檢測到CTCs。而正常對照組健康受試者的外周血中均未檢測到CTCs。Liu等［19］對95例PDAC患者和48例健康患者的外周血進行CTCs檢測，結果顯示PDAC患者的CTCs總數和亞型的數目均顯著增加，CTCs亞型在PC早期診斷中的潛在價值。Ankeny等［20］對72例確診為PDAC患者的外周血進行CTCs檢測，其中54例檢測到了CTCs（敏感性為75.0%，特異性為96.4%）。Sefrioui等［21］發現CTCs診斷胰腺良惡性疾病的敏感性和特異性分別為67%和80%，而當CTCs聯合CA19-9時，敏感性和特異性可提高到78%和91%，表明CTCs聯合其它標志物可用于PC的早期診斷。Wei等［22］也發現Vimentin陽性的CTCs聯合CA19-9可提供良好的PC診斷效能，受試者曲線下面積可達到0.968。而筆者所在中心的研究也得出了類似的結果［23］。盡管缺乏更大樣本的前瞻性研究，但現有的結果已經證實了CTCs作為新型診斷標志物應用于臨床的可行性。

2 CTCs與PC的療效監測

當前，新輔助化療和輔助化療在PC的綜合治療中發揮著重要的作用。隨著CTCs富集及檢測技術的不斷進步，于PC患者化療前后檢測CTCs，可以從細胞水平進行實時評價，動態地監測腫瘤的進展和藥物的療效［24］。在一項PDAC的PDX小鼠隨機接受安慰劑或磷脂酰肌醇-3-激酶抑制劑BKM120治療的臨床前研究中，BKM120組治療后CTCs計數下降明顯且與腫瘤生長抑制相關，而安慰劑組則無明顯變化。表明CTCs可作為一種較為理想的監測治療反應的生物標志物［25］。一項前瞻性的臨床研究納入了37例接受吉西他濱聯合白蛋白紫杉醇化療的晚期PDAC患者，在治療前、后兩個月以及疾病進展時富集外周血CTCs，并檢測其基因表達結果顯示治療后SMAD4的表達上調提示更好的治療效果以及更長的無進展生存期［26］。Wei等［22］檢測了患者采用改良的FOLFIRINOX方案或者吉西他濱聯合白蛋白紫杉醇化療前后的外周血CTCs，結果顯示腫瘤縮小或穩定的患者CTCs計數下降或保持不變，而腫瘤進展患者的CTCs計數并沒有下降，提示CTCs可監測化療療效。Ren等［27］比較了41例Ⅲ、Ⅳ期PDAC患者經5-FU化療前后外周血CTCs的差異，結果顯示治療后CTCs的檢出率和數目均明顯下降，并可以檢測到凋亡的CTCs，提示凋亡的CTCs可預示PC的化療療效。對于PC新輔助和轉化治療中，常規的影像學檢查只能對原發病灶進行評估，而不能反映全身腫瘤負荷的變化，然而通過動態監測CTCs，有望對化療療效進行監測，從而確定最佳手術時間［28］。

3 CTCs與PC的預后評估

CTCs是從原發腫瘤組織進入血循環的腫瘤細胞，少數的CTCs可以導致微轉移，極少數的CTCs最終可以形成轉移病灶，因此CTCs可作為PC預后評估和復發監測的潛在生物標志物［29］。Court等［30］采用微流控納米技術檢測CTCs，并研究其在預后評估中的價值，結果顯示24.5%的可切除PC患者術中發現了隱匿性轉移灶。術前CTCs可有效診斷隱匿性轉移灶患者，且與術后無復發生存率相關。Song等［31］在一項前瞻性研究中發現，對于可切除PDAC術前外周血中CTCs計數少于1個的患者總生存期（overall survival，OS）可達到35.5個月，而1個以上CTCs的患者只有16個月，提示CTCs計數可作為可切除PDAC的生存預后指標。最新的一項薈萃分析納入了19項研究和1320例患者，結果顯示CTCs陽性PC患者的OS和無進展生存期（progression free survival，PFS）均明顯縮短，以檢測方法、治療方法和TNM分期進行的亞組分析可得出同樣的結果［32］。循環腫瘤微栓子（circulating tumor microemoli，CTM）是CTCs的聚集體，與CTCs相比有著不同的表型和分子特征，表現出了更高的轉移潛能。因此，同樣可成為一種新的預后標志物［33］。一項納入63例PDAC患者的前瞻性研究中，81%患者的外周血中檢測到CTM。預后分析顯示治療前CTM數量是PDAC患者PFS和OS的獨立預測因子［34］。Wu等［35］同樣發現對于可切除PDAC，術前外周血中存在CTM提示預后不良，建議對此類患者進行術前評估時應全面考慮。

除計數之外，CTCs的表型和分子生物特征同樣可作為預測生存的標志物。在表型方面，上皮-間質轉化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）是一種表型改變，表現為上皮特征的喪失和侵襲性間質屬性的獲得，與腫瘤細胞的擴散有關［36］。EMT是一個動態的過程，促進腫瘤細胞從原發腫瘤組織脫落并進入血液循環系統［37］。因此，EMT現象使得PC的CTCs主要分為上皮表型和間質表型兩種亞型。有研究顯示，這兩種亞型的CTCs具備不同的分子生物學特征，與臨床預后的關系也不盡相同［38］。Poruk［39］等收集50例PDAC患者術前的外周和門靜脈血樣，先通過ISET系統富集CTCs，再通過免疫熒光法區分出cytokeratin陽性（上皮表型）和vimentin陽性（間質表型）的CTCs，結果顯示39例患者CTCs cytokeratin陽性。其中26例同時表達vimentin，cytokeratin陽性的CTCs提示患者生存期較短，是生存預后的重要獨立預測因子，vimentin和cytokeratin均為陽性的CTCs與術后較短的復發時間有關。因此，在運用CTCs評價預后時，應考慮CTCs的EMT現象，既不能僅分析上皮表型的CTCs，還應考慮間質表型的CTCs。而在分子生物特征方面，Amantini［40］等富集了20例局部晚期或轉移性PC患者化療前后的CTCs并采用數字PCR技術對CTCs進行基因表達譜分析，結果顯示以ALCAM、POU5F1B和SMO mRNAs高表達為特征的患者PFS和OS更短。Sergeant［41］等從10名手術PDAC患者中富集CTCs，RNA雙線性擴增后進行全基因組芯片分析，結果發現CTCs中表達率最高的是參與腫瘤細胞遷移的p38絲裂原活化蛋白激酶（P38MAPK）信號通路，而與細胞運動相關基因的高表達與OS和無病生存期（disease-free survival，DFS）相關。Poruk［42］等首先通過免疫熒光法鑒定表達cytokeratin、CD133、CD44和ALDH等不同表型的CTCs結果發現ALDH陽性、三重陽性（cytokeratin、CD133和CD44）和雙重陽性（cytokeratin和CD133）是腫瘤復發的獨立預測因子，并與DFS降低相關。

肝臟是PC最常見的轉移和術后復發的部位，而肝轉移也是導致PC預后較差的重要原因之一［43］。門靜脈直接回流胰腺的靜脈血至肝臟，理論上CTCs在門靜脈血中更易被檢出，可作為預測PC患者肝轉移和術后生存的潛在標志物［44］。White［45］等在一項前瞻性的臨床研究中，對于可切除PDAC患者于術前收集外周血以及腫瘤切除前后分別收集門靜脈血進行CTCs檢測，結果發現門靜脈血中的CTCs與患者術后的OS明顯相關，門靜脈血中未檢測到CTCs的患者術后18個月的總生存率可達到100%。Tao［46］等同樣發現基于流式細胞術檢測的門靜脈血CTCs可預測PC或壺腹部周圍癌術后肝轉移。隨著超聲內鏡技術的進步，門靜脈血CTCs的檢測進一步得到了推廣應用。2015年的一項單中心的隊列研究中，超聲內鏡技術已被證實應用于門靜脈血的采集以進行CTCs檢測是安全可行的，患者并無相關并發癥的發生［47］。最新的一項研究表明，經超聲內鏡獲得門靜脈血檢測的CTCs是胰膽管癌患者PFS和OS的顯著預測因子（cut-off值為185 CTCs/7.5 mL）［48］。而門靜脈血中CTCs的高數量和高活性則被證實與門靜脈血的免疫環境有關。Arnoletti［49］等發現，與外周血相比，PDAC手術前后的門靜脈血中CTCs均具有更高水平的KRASmut mRNA表達，且在腫瘤切除后并無明顯變化，同時門靜脈血中的免疫抑制細胞亞群（M-MDSC）數量也高于外周血。而CTCs數量也與K-RASmut mRNA表達和M-MDSC水平呈正相關，提示門靜脈血中免疫抑制環境可能促進CTCs的存活。該團隊進一步發現，門靜脈血中分離的CTCs經體外培養7天后，PDAC患者的CTCs招募了多種免疫細胞類型以形成橢圓形簇，并可促進CTCs的存活、生長。表明CTCs在門靜脈循環中的存活可能是由于它們與多細胞類型簇中的免疫細胞相互作用，同時多細胞類型簇可能代表局部復發和轉移進展的載體［50］。

CTCs作為“液體活檢”的重要組成部分，近年來受到越來越多的關注和重視，其對PC的早期診斷、療效監測及預后評估都有著顯著的臨床價值。隨著檢測技術的進步，將來有望利用循環血實時檢測CTCs來替代腫瘤組織活檢。且微量組織基因組和轉錄組測序技術的進步也使對CTCs的認識也從簡單的數量鑒定提高到對分子特征的研究。但目前CTCs在臨床上的推廣應用仍需對富集、檢測方法的標準性和功能性分析的可靠性進行更加深入和細致的探究，同時需要大樣本的前瞻性研究進行驗證。