膽道閉鎖的表觀遺傳學研究進展

詹 鏞 綜述 鄭 珊 審校

膽道閉鎖(biliary atresia,BA)是兒童最常見的膽汁淤積性疾病，以肝內外膽管進行性炎癥和纖維性梗阻為主要特征，臨床上多表現為出生后數周內的持續性黃疸以及進行性膽汁淤積，是導致兒童肝移植最常見的原因[1,2]。中國臺灣的BA發病率為1/5 000，歐洲地區為1/18 000，美國為1/12 000[3]，中國大陸尚無BA發病率的準確統計數據。目前BA的標準治療方法為盡早行Kasai手術(肝門空腸吻合術)，但手術治療后僅有部分患者能夠達到自體肝存活，其余仍需接受肝移植才能長期存活。因此，對BA發病機制以及治療的探索尤為重要。

表觀遺傳學是研究在核苷酸序列不發生改變的情況下，基因的激活和失活或基因表達水平變化引起遺傳改變的遺傳學分支學科。近年來對BA的遺傳學研究層出不窮，而其中表觀遺傳學研究逐漸增多，極大豐富并完善了BA的發生機制學說。由于這些表觀遺傳學上的改變在BA中頻繁發生，因此被認為是早期發現BA、預測其預后和治療反應的潛在生物標志物。此外，這些表觀遺傳學上的改變是潛在可逆的，因此也可能作為潛在的治療靶點。本文就表觀遺傳學中的小分子核糖核酸、DNA甲基化等在BA中的相關研究進展進行綜述。

一、小分子核糖核酸(miRNA)

miRNA是一個龐大的小分子調控RNA家族，在轉錄后水平對基因表達進行調控。編碼miRNA的基因通過RNA聚合酶Ⅱ/Ⅲ轉錄出初級產物pri-miR。pri-miR經過切割修飾形成發夾型結構的pre-miR，并且在細胞質中被加工為成熟的雙鏈miRNA。最終miRNA雙鏈體中的一條鏈被降解，而另一條鏈通過兩種途徑發揮作用：一是參與形成RNA誘導的沉默復合物(RNA-induced silencing complex,RISC)，二是通過與AGO蛋白或高密度脂蛋白/低密度脂蛋白結合后被釋放到細胞外[4]。

(一)miRNA參與BA發病的可能機制

BA的發病機制尚未明確，目前較被接受的觀點是多種病理過程相互作用，最終導致肝纖維化的發生，如感染、母體接觸毒物等因素引起免疫炎癥及膽管上皮損傷等病理過程，并且膽管上皮損傷引起更嚴重的炎癥反應，而炎癥反應會繼續加重膽管損傷，最終導致BA的發生[1]。近年來，許多研究提示miRNA在膽道閉鎖發病過程中可能發揮著重要作用，給未來BA的治療方案帶來了新的思路。

1. miRNA與膽管上皮細胞 miRNA可能通過調控膽管上皮的狀態及功能參與BA的發生。在BA小鼠模型中，Hand等[5]研究發現miR-29表達水平升高，且miR-29能夠通過下調胰島素樣生長因子受體，增加膽管上皮細胞死亡的可能性。而另一項研究也提出，行膽道結扎后小鼠肝臟組織中的miR-124表達明顯下降，并伴有miR-200表達增加，而這一現象也在BA患者肝組織中得到了驗證[6]。這兩種miR的表達變化，能夠通過白介素-6/信號轉導激活轉錄因子3(interleukin-6/signal transducer activator of transcription 3,IL-6/STAT3)通路促進膽道細胞的增殖。這些研究均表明，miRNA可能對膽管上皮細胞的功能及狀態具有重要的調控作用。此外，Bessho等[7]還檢測了小鼠模型中肝外膽管與膽囊的miRNA表達水平，發現miR-30b/c、-133a/b、-195、-200a、-320和-365等8種miRNA相關靶基因的表達量顯著增加，與免疫應答及器官發育過程具有關聯性，這也可能與BA的發生有著重要的聯系。

2. miRNA與免疫炎癥反應 目前認為，BA中的免疫反應是由病毒或毒素等啟動因素對膽管上皮細胞造成損傷，導致抗原變異或表達新的抗原，并由抗原提呈細胞呈遞給初始T細胞，進而引發一系列免疫炎癥反應所致。其中一種學說認為，γ干擾素(IFN-γ)可以降低T淋巴細胞激活所需的抗原閾值，促進T淋巴細胞自身反應性激活，并促使其向Th1類細胞分化，活化的CD4+Th1細胞分泌更多的IFN-γ，最終誘導嚴重的免疫應答，引起肝內外膽管損傷[8]。而其中miRNA能夠參與免疫細胞分化以及細胞因子釋放等多種過程的調節，為研究BA的機制及治療手段提供了幫助[3]。

Hsu[9]與Zhao[10]先后發表文獻報道,小鼠BA模型受γ干擾素刺激后，miR-55的表達水平升高，隨后促進MHC Ⅰ、MHC Ⅱ、CXCL9等細胞因子表達，最終通過Jak通路活化了炎癥因子以及STAT1，從而增強了免疫炎癥的作用，這可能是miR-155參與IFN-γ免疫反應誘導BA發生的機制之一。2007年有研究指出，miR-181a的表達上調能夠增加T細胞對抗原的親和力，并且調控CD4+T細胞的增殖[11]。因此miR-181能夠通過調控CD4+T細胞，參與免疫反應的調節。這些研究表明，對miRNA與免疫炎癥反應機理的進一步研究有望成為未來治療BA的有效方法之一。

3. miRNA與肝纖維化 肝纖維化是BA的重要病理改變之一，成功應用Kasai手術的患者中最終仍有70%會發展為肝硬化。而肝星狀細胞被認為是肝臟中最主要的導致纖維化的細胞，它們的活化是纖維化過程中的重要環節。靜止的肝星狀細胞在炎癥和細胞因子的作用下被激活后，遷移至受損部位轉化為肌成纖維細胞。而肝內細胞也可通過上皮間質轉化這一過程轉化為肌成纖維細胞[12]。目前研究已發現部分miRNA與肝纖維化的形成相關。

研究表明，BA患者肝組織中的miRNA表達水平與肝纖維化形成相關。Shen等[13]通過檢測發現BA患者中miR-21表達水平升高，并且能夠通過miR-21/PTEN/AKT軸提高α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達水平，進而促進肝纖維化的進展。與此同時，Ye等[14]研究表明miR-145表達水平明顯降低，可能通過高表達聚攏蛋白3(adducin3，ADD3，已被鑒定為BA易感基因)來促進BA患者的肝纖維化。Dong等[15]也證實了BA組織中miR-222表達水平的增高，并且LX2人肝星狀細胞系驗證了miR-222能夠通過B組蛋白磷酸酶2A和Akt蛋白激酶的作用，顯著提升星狀細胞的增殖能力，從而促進肝纖維化的形成。此外，miR-222促進肝纖維化的功能也在小鼠BA模型中得到了驗證[16]。除miR-222外，也有研究報道miR-200b能夠增強Akt的磷酸化，顯著增強LX-2細胞的增殖和遷移能力，從而可能在肝纖維化中發揮調節作用[17]。Shen等[18]在活化的肝星形細胞中發現miR-19b的表達水平降低，且miR-19b能夠影響下游的轉化生長因子表達，進一步影響前膠原的合成，因而認為miR-19b可能參與了BA相關的纖維化。此外，Wang等[19]證實了miR-29c的表達水平升高或miR-129-5p的表達水平降低都能夠通過調節上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)通路的相關蛋白阻止小鼠BA模型中EMT的發生，延緩肝纖維化進程，為治療BA的新靶點提供了參考依據。

(二)miRNA診斷BA預后的價值

近年來研究發現，部分miRNA可以穩定存在于血清或血漿中，因而能夠通過一定手段進行檢測，作為BA診斷或預后的評價指標之一。Zahm等[20]通過與膽汁淤積患者比較發現，BA患者血清中miR-200b/429簇顯著升高，有望成為未來的臨床診斷指標之一。且miR-200b/429簇的功能可能與肝外膽管的破壞相關。前文中談及miR-21與肝纖維化的關系，然而在Goldschmidt等[21]的研究中，BA患者的循環miR-21雖然顯著升高，但與肝纖維化并無密切關系。

Dong等[22]研究表明，BA患者血清中miR-4429表達水平明顯降低，受試者曲線下面積(area under the curve，AUC)為0.789，靈敏度、特異度分別達83.33%及80%；血清miR-4689的表達水平升高，AUC為0.722，靈敏度、特異度分別達66.67%和80%。Peng等[23]證實,與非BA膽汁淤積病人比較，BA患者miR140-3p表達顯著降低，AUC為0.75，靈敏度和特異度分別達66.7%和79.1%。Shan等[24]發現miR499 的rs3746444 A>G多態性可能是肝移植后BA患者疾病風險增高以及更長恢復期的基因決定因素，能夠作為判斷預后的指標之一。

二、DNA甲基化

DNA甲基化是哺乳動物基因組中常見的表觀遺傳機制，主要通過DNA甲基化酶(例如DNMT家族等)使得特定基因的CpG位點甲基化，從而抑制其轉錄活性，影響基因表達[25]。近年來與BA相關的DNA甲基化研究大多與免疫炎癥反應與肝纖維化研究相關。

(一)DNA甲基化參與BA發病的可能機制

1. T細胞相關機制 既往研究認為，CD4+T細胞在BA發生發展中發揮重要作用，而Dong等[26]研究發現，與健康對照相比，從BA患者身上提取的CD4+T細胞的基因組DNA表現出了低甲基化。在BA患者CD4+T細胞中，除DNA甲基轉移酶DNMT1和DNMT3a的mRNA水平均顯著降低外，甲基-DNA結合域蛋白(methyl-DNA-binding domain proteins，MBD1)的表達水平也顯著降低，這證實了其基因組DNA的低甲基化水平。此外，γ干擾素的mRNA水平也顯著增加，且其基因啟動子區也呈低甲基化，說明IFN-γ的表達與DNA甲基化水平呈負相關。這表明CD4+T細胞中基因組甲基化水平的變化可能通過調節相關細胞因子(如IFN-γ等)的表達，從而造成BA的發生及進展。

研究表明，CD11a在BA患者的CD4+T細胞上呈現明顯的低表達，這與CD11a啟動子區域的超甲基化是相關的[27]。運用DNA甲基化抑制劑可以降低CD11a啟動子的甲基化，并提高CD11a的mRNA水平。因此，可以證明CD11a基因座的DNA超甲基化導致了CD4+T細胞上CD11a的低表達。

Li等[28]報道了在BA患者及小鼠模型提取的調節性T細胞(Treg細胞)中，Foxp3啟動子區域內CpG島的甲基化水平均升高，并且注射了DNA甲基化抑制劑藥物的BA小鼠出現了BA表型的緩解。因而Foxp3啟動子的甲基化狀態異常可能導致Treg抑制免疫炎癥的功能受損，進而加劇BA中的炎癥性損傷。這些研究表明在免疫細胞方向上，關于DNA甲基化的研究能夠進一步揭露BA的發病機制。

2. 細胞因子相關機制 如前文所述，IFN-γ在BA發病過程中發揮著重要的調節作用。Mattgews等[29]在斑馬魚中發現，由基因或藥物抑制引起的DNA甲基化能夠造成肝內膽管缺損及肝內γ干擾素通路基因的高表達。并且，與其他膽汁淤積性患者相比，從BA患者提取的膽管細胞中DNA甲基化顯著減少。由此可以推斷，γ干擾素信號通路的表觀遺傳學活化是BA肝內膽管缺損的普遍病因機制。在Cui等[30]的另一項研究中，他們在斑馬魚中驗證通過抑制DNA甲基化能夠增加γ干擾素的表達，并且給發育中的斑馬魚注射γ干擾素可以造成膽管缺損，而這些缺損與膽管細胞增生的減緩相關。在最近的研究中，Yang等[31]發現，miRNA-29b/142-5p的表達水平升高，能夠靶向抑制DNMT1表達，從而降低全基因甲基化的水平，進一步導致了甲基化敏感的γ干擾素基因表達水平升高，最終升高了γ干擾素的水平。由此提示細胞因子相關的DNA甲基化在BA的發生發展過程中起著重要作用。

3. 其他相關研究 Cofer等[32]利用甲基化芯片技術，證實了BA組織中血小板源性生長因子A(platelet derived growth factor A，PDGFA)基因座是最顯著的低甲基化區域，同時也發現了PDGFA蛋白特異分布于人的膽管細胞中。他們將PDGFA蛋白二聚體注入斑馬魚體內，發現DGFA蛋白二聚體能夠引起發育性和功能性的膽管缺損。此外，在斑馬魚中Hedgehog通路的激活也能引起PDGFA的表達增加，提示DNA去甲基化是一個能夠調節BA相關基因過表達的特異因素，也提示PDGFA可能促進BA的發展。

(二)DNA甲基化與BA的診斷預后

Udomsinprasert等[33]通過對外周血白細胞的重復元件的甲基化水平測量，證明了全基因甲基化、8-OHdG以及相對端粒長度之間的關系，并報道了BA患者中Alu和LINE-1(long interspersed nuclear element-1)存在顯著的低甲基化，且甲基化降低與患者的預后不良相關。隨后他們又通過對外周血白細胞及肝組織的分析發現，BA患者中autotaxin(ATX)啟動子可見特異性CpG甲基化減少，并且晚期患者ATX啟動子甲基化的水平低于早期患者[34]。此外與對照組相比，BA患者的ATX表達明顯升高。因此，外周血ATX以及啟動子甲基化的水平能夠用來評估術后BA患者肝纖維化的進展，且ATX的高水平表達以及啟動子的低甲基化可能參與了BA肝纖維化的進展。

三、表觀遺傳學研究的其他方面

除miRNA及DNA甲基化以外，表觀遺傳學研究較多的方向還有組蛋白修飾、環狀RNA(circle RNA,circ-RNA)以及長鏈非編碼RNA(long-noncoding RNA,LncRNA)等，但目前研究中，這些方向上關于BA的研究較前述為少。

(一)組蛋白修飾

組蛋白修飾是指組蛋白N端的共價修飾，包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、ADP核糖基化等。通過相對應的酶類進行修飾后，組蛋白可能參與了轉錄阻遏調節等途徑，對基因的表達進行調節。其中組蛋白乙酰化及組蛋白甲基化是組蛋白修飾研究的重要組成部分[35,36]。Barbier等[37]研究表明prohibitin-1(PHB1)在膽汁淤積性肝損傷中起著重要的調節作用。PHB1通過調節組蛋白去乙酰化酶4(histone deacetylase 4，HDAC4)的活性來控制特異的表觀遺傳學標記，最終促進肝損傷以及纖維化。而組蛋白甲基化修飾的BA相關研究目前尚未見報道，但組蛋白修飾在BA的病理進程中應該起著一定的作用。

(二)LncRNA

LncRNA是指核苷酸數量超過200個的RNA，不具備編碼蛋白質的功能。LncRNA能夠通過增強或阻遏轉錄因子、增強子、沉默子等以及調節蛋白質的翻譯及修飾等途徑，在轉錄及轉錄后水平對基因表達進行調節[38]。Nuerzhati等[39]研究發現BA患者肝組織中LncRNA膜聯蛋白A2假基因3(Annexin A2 pseudogene 3，ANXA2P3)表達升高，并證實ANXA2P3能夠通過膜聯蛋白A2(ANXA2)減少肝細胞凋亡，這可能對BA患者的肝損傷進展具有保護作用。

LncRNA H19在人類肝臟疾病和多個膽汁淤積性肝損傷動物模型中被報道上調，包括CCl4誘導的肝臟損傷、BDL誘導的膽汁淤滯損傷等模型，這說明H19在膽汁淤積性肝損傷疾病進展中具有重要作用[40,41]。而Xiao等[42]通過研究LncRNA H19在BA發生發展中的調節作用，表明H19能夠通過調節S1PR2/SphK2和let-7/HMGA2信號通路，促進膽管細胞的增殖和肝纖維化。

(三)其他

近年來表觀遺傳學研究熱點還包括6-甲基腺瞟吟(N6-methyladenosine，m6A)，這是真核細胞生物中信使RNA (messenger RNA，mRNA)最為常見的一種RNA轉錄后修飾，在mRNA剪接、穩定性、出核轉運及RNA與蛋白質相互作用等方面有重要作用[43,44]。另一熱點是環狀RNA(circular RNA，circ RNA)，它能夠通過對miRNA的調控進而影響細胞功能[45]。雖然m6A甲基化及circ RNA很有可能在BA的發生發展中起著作用，但目前的研究中尚未報道二者在BA中有何功能。

四、小結

近年來表觀遺傳學是生物醫學領域的研究熱點，其相關方面均可能在BA的發生、發展中起著重要作用。表觀遺傳學的改變可以在特定的方法下測出，因而能夠在BA的診斷以及預后評價方面發揮重要作用，例如miRNA以及DNA甲基化水平未來可能成為BA臨床診斷及預后評價的有效指標。表觀遺傳學的某些改變具有可逆性，能夠通過特定方式進行改變，這為表觀遺傳學在治療學上的應用提供了極大的可能[46-48]。

表觀遺傳學涉及多方面的基因調控環節，而各方面的調控并非各自獨立，如肝纖維化機制中LncRNA、miRNA及DNA甲基化之間的相互作用。也有文獻報道，RNA之間也存在競爭性內源RNA調控機制：LncRNA/circRNA能夠通過競爭性結合miRNA，從而調控miRNA對mRNA的抑制作用[49]。雖然目前BA關于組蛋白修飾、LncRNA、circ RNA和m6A甲基化的研究較少，但其可能與miRNA、DNA甲基化等相互交叉發揮作用。因此，進一步深入研究并構建BA的表觀遺傳調控網絡，將會是接下來的研究重點。表觀遺傳學的深入研究將為BA的診斷、預后評估以及治療帶來新的希望。