加載PEDF的多聚體超聲微泡研制及其特性

胡劼，焦明克，劉立潔，張鵬，牛盈盈

1.新疆醫科大學第四附屬醫院心臟超聲科，新疆烏魯木齊 830000；2.重慶市渝北區人民醫院超聲科，重慶 400000；3.新疆軍區總醫院醫學工程科，新疆烏魯木齊 830000

前言

作為一種新興藥物載體，攜載藥物的靶向超聲微泡相對其他載體具有不具免疫性、可實現靶向爆破、穩定、減少藥物副作用等優勢，能夠實現在超聲波輔助下進行藥物靶向無創治療［1-2］。血管新生類疾病，如癌癥、動脈斑塊等對機體造成病理侵蝕的疾病，是損害健康的無形殺手［3-4］，采用抑制血管形成因子、打破血管形成等血管新生阻斷療法是治療血管新生類疾病的研究熱點［5-6］。色素上皮源因子（Pigm Entepithelium-Derived Factor,PEDF）被證實在所有抗新生血管因子中作用最強，且能在體內拮抗多種血管新生因子, 并完全抑制它們活性的發揮［7-8］，但PEDF無法直接有效地作用于病灶［9］。為實現新生血管抑制因子PEDF 在有效直達病灶治療血管新生類疾病的同時，降低其不良反應，本實驗首次將多聚體超聲微泡與PEDF 相結合，制備最大藥物結合率的靶向超聲微泡，并進一步研究該超聲微泡的理化特性，以期為新生血管類疾病的治療提供合適的藥物載體，為形成靶向、無創、有效的新治療方法奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 主要材料及設備

本實驗主要材料包括表面活性劑Span 60、Tween 80、PBS、PEG、HPC、六氟化硫氣體（SF6）、PED抗體（C1224MSDS,Sigma-Aldrich,USA）、氯仿、膽固醇和（NH4）2SO4緩沖液。設備包括高強度超聲處理器（VCX-750, Sonix, USA）、分光光度計（AquaMate 8000, Thermo-Fisher, USA）、庫爾特粒度儀（Multisizer III, Bechman-Coulter, USA）、流式細胞儀及熒光顯微鏡等。

1.2 多聚體微泡的制備及保存

將Span 60 和Tween 80 混合表面活性劑與不同聚合度的PEG 溶于PBS 中，在磁力攪拌器上加熱至60 ℃，待完全溶解后，將所得溶液置于高壓蒸氣內進行消毒，進而再置于磁力攪拌器上持續攪拌，冷卻至室溫。設定高強度超聲處理器功率為400 W，采用聲振法處理上述冷卻后的非離子表面活性劑溶液1 min，同時在溶液上方通入SF6，最終得到乳白色微泡懸浮液。用50 mL的PBS稀釋10 mL的原始微泡，將微泡稀釋液移入分液漏斗中靜置20 min，然后采用上浮法對微泡稀釋液進行分級分離。在零下4 ℃及室溫下的不同時間段對微泡進行觀察，并將制得的微泡在4 ℃下分裝于不同玻璃小瓶進行恒溫保存。

1.3 包裹不同濃度PEDF脂質體的制備

以3：1的質量比將膽固醇與HSPC（氫化卵磷脂）混合溶于氯仿中，制得20 mg/mL 濃度的混合液。氯仿在容器底部形成一層脂質膜，通過旋轉蒸發去除；然后用300 mmol/L 的（NH4）2SO4緩沖液進行水合得到脂質乳狀液，進而依次用800、400、200 和100 nm的擠出膜對乳狀液進行擠出；最后將脂質體通過葡聚糖凝膠柱層析，得到跨膜銨梯度脂質體。將濃度分別為0.4、2.0、10.0 和50.0 μg/mL 的PEDF 與跨膜銨梯度脂質體以8：5 的體積比進行混合，在65 ℃進行孵育25 min，冰浴45 min。

1.4 多聚體超聲微泡-藥物復合體的制備及最大結合率檢測

分別將熒光和生物素標記的包裹不同濃度PEDF 的脂質體與制備好的微泡進行混合，因微泡表面活性物質中含有具有一定粘附作用的PEG，因此可以將脂質體黏附在其表面，從而形成多聚體超聲微泡-藥物復合體。采用Multisizer III 對復合體的粒徑進行測量，測量使用30 μm 的小孔管和300 通道。通過Photoshop 圖像分析軟件對復合體濃度進行測定。應用熒光顯微鏡及流式細胞儀檢測測定藥物的有效加載情況，并確定藥物與微泡的結合率。

1.5 脂質體對PEDF的包封率測定

針對測得具有最大超聲微泡結合率的PEDF 脂質體，取其混合液200 μL 直接進行破乳，采用AquaMate 8000 分光光度計進行吸光度檢測，測得吸光度為A0；同時再取200 μL上述混合液上樣置于G-50離心柱上，離心洗脫得到包裹有PEDF 的脂質體，收集洗脫液破乳，測得吸光度為A1；最后通過式（1）得到脂質體對藥物PEDF的包封率。

1.6 PEDF多聚體超聲微泡體外釋藥特性

精密稱取50 mg 載藥多聚體微泡懸浮于10 mL 0.1 mol/L的PBS 中，并將該溶液置于透析袋內密封，在保持37 ℃的情況下，應用超聲體外擊破微泡，在預定時間間隔15、30、45、60、75、90、105 s及5、7、10 min，取出1 mL 溶液，通過分光光度法測定PEDF 的含量，同時補加等量的PBS。

1.7 統計學分析

采用SPSS 16.0 軟件進行統計學分析，計量數據采用均數±標準差表示，兩組均數間比較采用t檢驗，多組均數間比較采用單因素方差分析和SNK-Q 檢驗，以P<0.05作為顯著性檢驗標準。

2 結果

2.1 多聚體超聲微泡-藥物復合體的粒徑

應用Multisizer III 和Photoshop 圖像分析軟件得到該新型多聚體微泡的平均直徑為（3.17±0.13）μm，濃度為（3.00±0.11）×109/mL。

2.2 不同濃度PEDF在多聚體超聲微泡上的加載及結合率

在熒光顯微鏡下觀察各組不同濃度PEDF 與微泡結合情況，初步明確結合率與藥物濃度的相關性。由圖1可觀察到0.4 μg/mL 濃度實驗組PEDF 與超聲微泡未見明顯結合，2.0 μg/mL 濃度實驗組可觀察到少量PEDF 與微泡結合，10.0 μg/mL 濃度實驗組可見中量PEDF 與微泡結合，50.0 μg/mL 實驗組可見大量密集PEDF與微泡結合。因此可基本判斷PEDF與超聲微泡的結合率隨PEDF濃度的增加而逐漸增大。

圖1 熒光顯微鏡觀察不同濃度PEDF與超聲微泡結合情況Fig.1 The binding of different concentrations of PEDF to ultrasound microbubbles was observed by fluorescence microscope

進而，為定量描述PEDF 與超聲微泡的結合特性，本研究采用流式細胞儀檢測多聚體超聲微泡-藥物復合體的載藥量結合率。流式細胞儀檢測結果的分布統計以單參數直方圖的方式自動顯示（圖2）。0.4 μg/mL 濃度實驗組PEDF 與微泡的結合率為0%，2.0 μg/mL 濃度實驗組PEDF 與微泡的結合率為（10.58±0.61）%，10.0 μg/mL濃度實驗組PEDF與微泡的結合率為（54.94±0.83）%，50.0 μg/mL 濃度實驗組PEDF 與微泡的結合率達到（96.14±1.21）%。隨著PEDF 濃度的繼續升高，藥物將不再與超聲微泡相結合，藥物濃度已達到飽和狀態。

圖2 不同濃度PEDF與微泡結合情況單參數直方圖Fig.2 Single parameter histogram of different concentrations of PEDF binding to ultrasound microbubbles

2.3 脂質體對PEDF的包封率及體外釋藥特性

根據吸光度A0與A1以及包封率計算公式，測得PEDF 多聚體超聲微泡的包封率為（79.20±2.31）%。表明該PEDF 超聲微泡具有良好的載藥包封特性，可以作為載藥系統運載PEDF。超聲作用下，在預定時間間隔15、30、45、60、75、90、105 s 及5、7、10 min，對取出的等份PEDF 多聚體微泡懸浮溶液，通過分光光度法測定PEDF 的含量，繪制其體外釋藥特性曲線（圖3）。從圖中可以看到從微泡被超聲擊破后第15 s開始觀察到PEDF 釋放，在45～60 s 藥物濃度達到峰值（65±3）%，而在剩余的時間內，藥物濃度略有升高，持續觀察10 min 后濃度開始顯著降低，該結果說明PEDF超聲微泡在短時間內具有連續釋藥特性。

圖3 PEDF多聚體超聲微泡藥物釋放率Fig.3 In vitro drug release rate of PEDF-loaded polymer ultrasound microbubbles

3 討論

針對癌癥、頸部動脈斑塊等血管新生類疾病，研究表明直接在病變部位注射可以使藥物表達效率提高，但該方法具有有創性，應用受到一定的局限［10-11］。病毒載體是公認的高效轉染的載體，但有免疫原性和潛在藥物突變的危險［12-13］。本實驗首次將PEDF對新生血管因子的有效抑制作用與多聚體超聲微泡載藥靶向治療的特性相結合，研制性能優異的PEDF 多聚體超聲微泡，利用微泡在超聲介導下的空化效應，靶向傳輸藥物，達到安全有效治療的目的［14-15］。

多聚體超聲微泡與其他載體相比，其構成成分多為脂類、糖類以及可生物降解的多聚體，不具有免疫原性，體積小且較穩定，在不經受一定強度的超聲聲能照射的情況下可以在體內保持穩定，僅在超聲照射區域內，即觀測的病變部位破裂，從而可實現靶向釋藥，同時，超聲介導微泡破壞還可促進其攜帶藥物通過血管內膜屏障，釋放到靶向組織和器官的血管外間質，增加靶細胞的藥物濃度［16-17］。本實驗研制的多聚體微泡為人工合成醫用多聚體高分子材料，其生物相容性好，在體內能自然降解成水和二氧化碳，對人體無任何毒副作用，免疫原性低，可通過腎臟排出體外，在體內不會有積累。

PEDF是重要的新生血管抑制因子［18］，本實驗針對多項疾病由于新生血管形成影響疾病轉歸的問題，首次提出應用超聲微泡作為載體，并結合新生血管抑制因子制備形成一個新型的藥物復合體，且明確了PEDF與新型超聲微泡載體的結合特性，并研制了具有最大藥物結合率的超聲微泡。對PEDF超聲微泡包封率和釋藥特性的檢測結果表明，PEDF超聲微泡與其他已知性能優異的載藥微泡具有相似的理化特性，如HCPT超聲微泡、舒尼替尼超聲微泡等［19-20］。本研究雖然為實現采用多聚體微泡攜帶藥物靶向治療血管新生類疾病的研究奠定了基礎，然而現仍處于基礎階段，多聚體微泡到達病灶部位在超聲輔助下釋放藥物的療效、作用機理以及相應的其他不可預知作用尚需進一步的研究驗證。