基于網絡藥理學和分子對接探析健脾丸治療慢性胃炎的作用機制

盧啟明，胡小英

1.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院兒科，廣東廣州 510405

前言

慢性胃炎是有害因子長期反復作用于胃黏膜引起損傷的結果［1］，隨著年齡的增加，慢性胃炎的患病率逐漸上升［2］，目前，我國基于內鏡診斷的慢性胃炎患病率接近90%［3］。慢性胃炎屬于中醫“胃痛”、“痞滿”、“呃逆”等范疇［4］，中醫治療慢性胃炎有一定的療效［5-9］，臨床上具有廣闊的前景。健脾丸出自《醫方集解》中“消導之劑”，由白術、陳皮、麥芽、山楂、太子參、枳實組成，具有健脾和胃，消積導滯之功，主治“脾虛血弱、飲食不消”。在臨床上運用此方進行加減治療慢性胃炎具有較好療效［10］，然而其作用機制尚不明確，且傳統的研究方法難以全面闡述中藥通過多成分、多靶點、多途徑治療疾病的作用機制。本研究擬通過網絡藥理學及分子對接技術分析健脾丸治療慢性胃炎的作用機制，為臨床應用提供依據并為后期實驗及臨床研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 健脾丸藥物的成分篩選及靶點預測

本研究首先通過中藥系統藥理學技術平臺（TCMSP）（http://tcmspw. com/tcmsp. php）以“Herb name”為檢索詞分別檢索白術、陳皮、麥芽、太子參、枳實的有效化學成分。根據成分毒藥動力學（ADME）中的參數進行篩選，以口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%，藥物相似性（Drug Likeness, DL）≥0.18 為基準，篩選出對應中藥材的主要活性成分，并對主要活性成分進行靶蛋白預測，通過Universal Protein 數據庫（UniProt）（https://www.uniprot.org/）將靶蛋白轉換成與之對應的靶基因。通過化學專業數據庫［11］（http://www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp）檢索與山楂相關的化學成分，利用其CAS 號在PubChem 數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載結構文件，將對應的結構文件導入SwissADME平臺（http://www.swissadme.ch/）并運行，根據成分毒藥動力學參數進行篩選，以Pharmacokinetics 中GI absorption 結果為High，并且Druglikeness 中的 Ghose、Egan、Veber、Lipinski、Muegge 存在3 項或以上結果為“Yes”作為基準，篩選出關于健脾丸組方之一的山楂的主要活性成分，在SwissTargetPrediction平臺（http://www.swisstargetprediction.ch/）中導入結構文件進行靶點預測。最后將配對好的成分、靶基因一起導入Cytoscape（3.7.2）軟件中，構建健脾丸成分-靶點網絡并進行分析。

1.2 慢性胃炎靶標基因的檢索

在GeneCards 數據庫（https://www. genecards.org/）中輸入“chronic gastritis”作為關鍵詞進行檢索，選擇“export to excel”選項將靶標基因導出為Excel格式，選取Relevance score≥中位數的靶標基因，獲得慢性胃炎的主要靶標基因。

1.3 構建PPI網絡

將健脾丸的靶基因導入STRING 平臺（https://string-db.org/），構建健脾丸各個靶點間相互作用的網絡關系圖（Protein Protein Interaction network，PPI network）。將慢性胃炎的靶標基因導入STRING 平臺，構建慢性胃炎靶點PPI network。將健脾丸和慢性胃炎的PPI network 導入Cytoscape 軟件處理分析并取交集，得到健脾丸治療慢性胃炎核心靶點的PPI network。

1.4 KEGG 通路的富集分析以及構建成分-靶點-通路網絡系統

將篩選出來的健脾丸的核心靶點導入Metascape平臺（https://metascape.org/），選擇KEGG 富集分析（P<0.01），結合相關文獻，選擇與慢性胃炎可能存在聯系的通路，將存在關聯性的成分以及靶點一起導入Cytoscape 軟件中，構建出健脾丸治療慢性胃炎的成分-靶點-通路網絡系統。

1.5 分子對接

利用Cytoscape 軟件對健脾丸的成分-靶點網絡進行分析，從而篩選出其中的關鍵活性成分，利用PubChem 數據庫下載化合物3D 結構文件，通過Openbable 軟件將其轉化為.pdb 格式，未能檢索到相應3D 結構的活性成分則依據2D 結構，利用ChemDraw 軟件得到對應的3D 結構，通過PDB 數據庫（https://www.rcsb.org/）下載已驗證的與慢性胃炎相關的BBC3、IL-17A［12-15］的蛋白結構，導入分子對接軟件Autodock Vina 中，操作健脾丸關鍵活性成分的結構分子與BBC3、IL-17A 分子對接，得到多個構象，將其中結合能絕對值最高的構象導入Pymol 軟件中進行可視化分析。

2 結果

2.1 健脾丸成分-靶點網絡

通過TCMSP 數據平臺、化學專業數據庫及SwissADME 平臺篩選出健脾丸的主要成分，通過UniProt 數據庫及SwissTargetPrediction 平臺對主要成分進行靶點預測，剔除冗余的成分，得到主要活性成分共56 個，見表1。將成分、靶基因導入Cytoscape軟件，構建健脾丸成分-靶點網絡，見圖1，通過Cytoscape 軟件對健脾丸成分-靶點網絡進行分析，該網絡中共有465個節點，1 090條邊，以Degree≥6倍中位數，篩選出共健脾丸的7 種關鍵活性成分，分別是12-senecioyl-2E,8E,10E-atractylentriol、Obacunone（黃柏酮）、quercetin（槲皮素）、epicatechin（表兒茶素）、luteolin( 木犀草素)、naringenin（柚皮素）、betasitosterol（beta-谷甾醇）。

圖1 健脾丸成分-靶點網絡圖Fig.1 Component-target network diagram of Jianpiwan

表1 健脾丸主要活性成分Tab.1 Main active components of Jianpiwan

2.2 慢性胃炎靶標基因及數據處理

通過GeneCards 數據庫檢索“chronic gastritis”，共檢索到1 095 個靶點，根據“Relevance score”進行排序，以Relevance score≥中位數選取靶標基因共553個，部分基因見表2。

表2 慢性胃炎部分基因Tab.2 Partial genes of chronic gastritis

2.3 構建PPI網絡，篩選核心靶點

通過STRING 平臺分別構建健脾丸靶點PPI network 和慢性胃炎靶標基因PPI network，導入Cytoscape 軟件利用“Merge”功能對兩個PPI network取交集，得到健脾丸治療慢性胃炎核心靶點的PPI network 并進行分析，慢性胃炎核心靶點的PPI network 中共有節點88 個，邊1 372 條，見圖2。圖中靶點由小到大表示Degree 值由小變大，即該靶點與其他靶點相互作用的機會越多，邊由細到粗表示Combined score 由小變大，即靶點間的相互作用關系越強。

圖2 健脾丸治療慢性胃炎核心靶點Fig.2 Core targets of Jianpiwan in treating chronic gastritis

2.4 KEGG通路富集分析及構建成分-靶點-通路網絡

運用Metascape 網絡平臺對健脾丸治療慢性胃炎的88 個核心靶點進行KEGG 富集分析，得到KEGG 相關通路共295 條，經查閱文獻，與慢性胃炎相關的通路主要有17 條，使用微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）富集氣泡圖對17 條主要通路進行數據處理，得到圖3，圖中縱軸代表KEGG 分析的通路，橫軸代表每個通路的富集程度，點的大小代表88 個核心靶點中富集到該通路的靶點個數，點的顏色由綠色到紅色代表P值由大到小。經查閱相關文獻，健脾丸治療慢性胃炎的關鍵信號通路主要是細胞凋亡信號通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、C 型凝集素受體信號通路、PI3K-Akt 信號通路、IL-17 信號通路、TNF 信號通路、JAK-STAT 信號通路、MAPK 信號通路、幽門螺桿菌感染中的上皮細胞信號傳導、Th17細胞分化，提示健脾丸是通過多個信號通路而起到治療慢性胃炎的效果，這也體現了中醫治療疾病的整體觀念。將篩選出的7 種關鍵活性成分、10 條關鍵信號通路及這些通路上的關鍵靶點導入Cytoscape軟件中構建健脾丸治療慢性胃炎的關鍵成分-靶點-通路網絡，見圖4。

圖3 KEGG富集氣泡圖Fig.3 KEGG enrichment bubble diagram

圖4 健脾丸治療慢性胃炎的關鍵成分-靶點-通路網絡圖Fig.4 Key component-target-pathway network diagram of Jianpiwan in treating chronic gastritis

2.5 分子對接

利用PubChem 數據庫下載健脾丸Obacunone（黃柏酮）、quercetin（槲皮素）、epicatechin（表兒茶素）、luteolin（木犀草素）、naringenin（柚皮素）、betasitosterol（beta- 谷甾醇）的化合物結構，使用Openbable 軟件將化合物結構信息轉化為.pdb 格式，利用ChemDraw 軟件畫出12-senecioyl-2E,8E,10Eatractylentriol的結構，以.pdb 格式輸出。將關鍵活性成分的蛋白結構與BBC3、IL-17A 的蛋白結構導入Autodock Vina 軟件進行分子對接，將結合能絕對值最高的構象導入Pymol軟件進行可視化分析，結果見表3和圖5。圖5中紫色條狀物為蛋白質，綠色棍狀物為關鍵活性成分，淺藍色棍狀物為蛋白質與關鍵活性成分相結合的結構，黃色虛線為結合鍵，深藍色球狀物為水分子。

圖5 健脾丸部分關鍵活性成分與BBC3、IL-17A分子對接圖Fig.5 Molecular docking diagram of some core active components of Jianpiwan with BBC3 and IL-17A

表3 健脾丸關鍵活性成分與BBC3、IL-17A分子對接結合能（kcal?mol-1）Tab.3 Molecular docking binding energy of core active components of Jianpiwan with BBC3 and IL-17A(kcal?mol-1)

3 討論

本研究根據網絡藥理學理論及分子對接技術，聯合多個數據庫，利用數據分析、高通量篩選、生物網絡構建、網絡拓撲結構分析等技術，對健脾丸治療慢性胃炎多成分、多靶點、多途徑進行科學有效的預測及分析，探討健脾丸治療慢性胃炎的作用機制。

根據健脾丸成分-靶點網絡，健脾丸的主要活性成分共 56 個，其中 12-senecioyl-2E, 8E, 10Eatractylentriol、Obacunone（黃柏酮）、quercetin（槲皮素）、epicatechin（表兒茶素）、luteolin（木犀草素）、naringenin（柚皮素）、beta-sitosterol（beta-谷甾醇）的Degree 值最高，并且通過分子對接技術，均對慢性胃炎發生發展過程中的關鍵蛋白具有較好的親和力。其中，木犀草素、柚皮素、黃柏酮、槲皮素、beta-谷甾醇均可通過多個通路促進細胞凋亡，能夠不同程度地抑制慢性胃炎的進展，特別是慢性萎縮性胃炎向胃癌的進一步惡化，并且可以通過多個途徑抑制癌細胞［16-22］。如Pu 等［23］和Lu 等［24］通過研究發現在胃癌細胞中木草犀素可以通過AKT、ERK、P13K 和p38等多個信號通路，調節一系列miRNAs 表達，表明其具有作為人類胃癌治療藥物的潛力。有研究指出黃柏酮和柚皮素還具有抗炎作用，并且柚皮素還能在一定程度上緩解炎癥引起的疼痛，另外，黃柏酮還具有調節消化道微生物群的作用，并能抵抗某些消化道病毒［25-28］。槲皮素除了可以調節胃細胞的增殖和凋亡的平衡，還可以保護胃上皮細胞免受氯化物的損傷并調節胃平滑肌舒張功能，因此在治療慢性胃炎和功能性胃消化不良及其他輕微胃肌肉運動障礙方面均具有潛在的價值［29-30］。Rozza等［31］通過研究發現表兒茶素可以加強胃黏膜屏障，并能一定程度地中和胃液，從而起到保護胃黏膜的作用。

在健脾丸治療慢性胃炎核心靶點PPI network中，Degree 值最高的3 個靶點分別是IL-6、VEGFA、TP53，為潛在的關鍵核心靶點。IL-6 是機體炎癥反應急性期的誘導成分之一，對B細胞的分化以及輔助T 細胞的發育均必不可少［32］。在幽門螺旋桿菌感染的慢性胃炎患者中，機體受到幽門螺旋桿菌的刺激后可促使IL-6 基因表達，并且其表達水平與慢性胃炎的分級具有相關性［33-34］。VEGFA 是一種具有重要促血管生成活性的因子，通過維護血管內皮細胞的形態，可調節血管內皮張力，維持血管的正常功能［35］。VEGFA 具有誘導內皮細胞增殖、促進細胞遷移、抑制細胞凋亡等作用。陳聰英等［36］通過研究發現VEGFA 在健康人、胃炎患者、胃潰瘍患者和胃癌患者的陽性表達率分別為37.6%、52.38%、78.33%、90.38%（P<0.05），可見VEGFA 的表達水與胃相關疾病的進展具有較大的相關性。TP53分子是迄今為止在人體內發現的最重要的抑癌基因，根據機體的生理情況而產生不同功能。當細胞處于正常狀態時，TP53蛋白不干擾正常細胞運行；當細胞受損時，TP53蛋白降解被阻斷，TP53水平升高，迅速激活并啟動對細胞的修復功能；當細胞DNA 損傷嚴重而不能完全修復時，TP53 蛋白將抑制細胞生長，促使其凋亡［37］。有報道指出在胃癌發展早期，TP53的改變就發生了，甚至可能在非腫瘤性黏膜病變中也存在，并且其改變的頻率隨著疾病進展逐漸增加［38］。

通過富集分析及查閱相關文獻，健脾丸治療慢性胃炎的關鍵信號通路主要有細胞凋亡信號通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE 信號通路、C 型凝集素受體信號通路等多個通路。其中，細胞凋亡信號通路排第一。細胞凋亡是一個高度調節的死亡過程［39］，通過基因編程消除受損或多余的細胞，以獲得更大利益，是在多細胞生物中常規進行的正常生理過程［40］。細胞凋亡是細胞死亡的信號通過多個途徑傳遞，最終促使負責細胞壞死的半胱天冬酶激活而發揮作用［41］。慢性萎縮性胃炎的發展過程中就會出現細胞凋亡的顯著增加，由Fas 和Fas 配體相互作用引起胃腺細胞凋亡［42］。也有報道指出，IL-17A 在此過程中起主要作用，促進胃壁細胞的凋亡進而引起胃黏膜的萎縮［43］。研究顯示在正常的胃黏膜中，被覆上皮和腺上皮僅檢測到少量的凋亡細胞，而在幽門螺旋桿菌胃炎的胃竇和胃體的被覆上皮以及胃竇的腺上皮中凋亡細胞的數量明顯增高，在其胃體的腺上皮中，凋亡細胞的數量再次增加［44］，這說明胃黏膜細胞的缺失與細胞凋亡有密切聯系。糖尿病并發癥中的AGE-RAGE 信號傳導涉及NADPH 氧化酶、蛋白激酶C 和MAPK 等多個細胞內信號途經的激活，從而促使NF-κB 激活。有研究指出將年齡作為一個因素，可能通過AGE/RAGE/NF-κB 通路下調平滑肌收縮蛋白的表達，從而導致胃動力障礙［45］。C型凝集素受體信號通路是由C 型凝集素受體介導的信號通路，C 型凝集素受體是一個大型蛋白質家族，當其與配體結合后，刺激細胞內的信號傳導級聯反應，從而誘導炎性細胞因子及趨化因子產生，介導先天性及適應性免疫。但在幽門螺旋桿菌感染患者中，幽門螺旋桿菌的代謝產物可以通過C 型凝集素受體信號通路進一步加重胃炎［46］。此外，通過KEGG 富集分析還提示PI3K-Akt 信號通路、IL-17 信號通路、TNF 信號通路、JAK-STAT 信號通路等多個通路均與慢性胃炎有一定聯系，這也體現了中醫是從整體觀出發，通過多個途徑而達到治病的目的。

本研究通過網絡藥理學和分子對接技術對健脾丸治療慢性胃炎的多個成分、多個靶點、多條通路及其之間的相互關系及作用進行分析，然而考慮到本研究主要依托網絡數據庫信息，并且研究過程中尚未考慮到藥物的劑量、劑型、煎煮、服用方法等問題，本研究仍處于理論探討水平，需進一步行實驗室和臨床試驗進一步論證。