板栗殼黃酮結構分析及其對胰脂肪酶活力的抑制作用

黃雪薇，雷嗣超，涂 芬，謝辰陽，李 杰，楊 芳,2,3,*

（1.武漢工程大學環境生態與生物工程學院，湖北 武漢 430205；2.武漢工程大學 綠色化工過程教育部重點實驗室，湖北 武漢 430205；3.武漢工程大學 新型反應器與綠色化學工藝湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430205）

肥胖和超重會引發各種慢性疾病[1]，其中最常見的慢性疾病包括高血壓、心血管疾病以及糖尿病[2]，嚴重影響人體的健康。胰脂肪酶（pancreatic lipase，PL）作為人體腸道內的關鍵酶，可催化食物中攝入的大部分脂肪水解成甘油和脂肪酸[3]，利用胰脂肪酶抑制劑抑制其活力可有效減少人體對脂肪的吸收[4]，達到控制和預防肥胖及超重引發慢性疾病的目的。目前，臨床上使用最廣泛的胰脂肪酶抑制劑為奧利司他[5]，但患者服用后會產生腹瀉、脹氣、脂肪性大便等副作用[6]。因此，從低毒性、來源廣泛的植物中提取胰脂肪酶抑制劑成為目前的研究熱點[7]。黃酮類化合物具有抗氧化[8]、抗病毒[9]、抗炎[10]、抗血管舒張等活性[11-12]，研究表明，板栗殼中含有大量的黃酮類化合物[13]，其降脂減肥的機理鮮見報道。本實驗以野生板栗殼為原料，提取板栗殼黃酮，并結合超高效液相色譜（ultra-performance liquid chromatography，UPLC）-四極桿/靜電場軌道阱質譜（quadrupole/electrostatic field orbitrap mass spectrometry，Q-Orbitrap MS）[14]對提取得到的板栗殼黃酮進行結構鑒定和組成分析，并且研究其在不同條件下對胰脂肪酶活力的影響及其對胰脂肪酶的抑制特性，為進一步將板栗殼黃酮開發為預防和抑制肥胖的功能因子提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生板栗采摘于山東省沂蒙山，采摘時間為2020年9月；蘆丁標準品（純度98%）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、乙醇（色譜純）、對硝基苯丁酸酯（p-nitrophenyl butyrate，PNPP）（分析純）、Triton X-100（分析純）、硝酸鋁九水合物（分析純）、亞硝酸鈉（分析純）、0.22 μm濾膜 上海麥克林生化科技有限公司；對硝基苯酚（p-nitrophenol，PNP）（分析純）、牛胰腺胰脂肪酶、N,N-二甲基甲酰胺（生物技術級）、二甲基亞砜（分析純） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氫氧化鈉（分析純） 鄭州派尼化學試劑廠；AB-8型大孔吸附樹脂 北京索萊寶科技有限公司；奧利司他膠囊 山東新時代藥業有限公司。

1.2 儀器與設備

FW80型高速萬能粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司；DZKW-D-2型電熱恒溫水浴鍋 北京永光明醫療儀器有限公司；THZ-100型恒溫培養搖床 上海一恒科學儀器有限公司；RE-2000A型旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；TG16-WS型臺式高速離心機 武漢志海科技有限公司；層析柱（φ1.6 cm×50 cm）、HL-2型恒流泵、HD-3型紫外檢測儀、BSZ-100型自動部份收集器上海滬西分析儀器廠有限公司；UV-1800PC型紫外-可見分光光度計 上海翱藝儀器有限公司；LGJ-10普通實驗型真空冷凍干燥機 北京松源華興科技發展有限公司；Q-Exactive型Q-Orbitrap MS儀、Hypersil GOLD C18型色譜柱 美國賽默飛世爾科技有限公司；Ultimate 3000型UPLC儀 美國Dionex公司。

1.3 方法

1.3.1 板栗殼黃酮的提取與純化

醇提取法：按照本實驗室前期建立的板栗殼黃酮提取工藝，將板栗殼去雜、洗凈、烘干并粉碎，過20 目篩，按料液比1∶15（板栗殼粉末與70%的乙醇溶液），置于恒溫培養搖床中，55 ℃恒溫振蕩提取90 min，冷卻后真空抽濾并于40 ℃旋轉蒸發，再冷凍干燥即得板栗殼黃酮粗提物凍干粉。

純化：取0.5 g板栗殼黃酮凍干粉，用蒸餾水溶解配制質量濃度為10 mg/mL，真空抽濾后過AB-8大孔樹脂層析柱[15]，用體積分數70%的乙醇溶液進行洗脫，將洗脫液收集后再次旋蒸、凍干，得到純化后的板栗殼黃酮粉末，低溫保存，備用。

1.3.2 板栗殼黃酮含量和提取得率的測定

采用分光光度計法[16]測定提取物中的總黃酮含量。蘆丁標準曲線的繪制：稱取蘆丁標準品0.01 g，用體積分數70%乙醇溶液定容至50 mL，配制成質量濃度為0.20 mg/mL的母液。分別吸取母液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL及3.5 mL于10 mL具塞比色管中，用體積分數70%乙醇溶液補充至5 mL，加入質量分數5%的亞硝酸鈉溶液0.30 mL并放置6 min，加入質量分數10%的硝酸鋁溶液0.30 mL，并搖勻靜置6 min，再加入質量分數4%的氫氧化鈉溶液4.00 mL，用體積分數70%乙醇溶液補充至10 mL，靜置15 min，于510 nm波長處測定吸光度，以蘆丁質量濃度為橫坐標，對應吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程為y＝11.54x-0.093 1，R2＝0.999 4。

板栗殼黃酮中總黃酮含量的測定：稱取0.01 g板栗殼黃酮凍干粉，用體積分數70%乙醇溶液定容至50 mL，配制成質量濃度為0.20 mg/mL的板栗殼黃酮溶液，吸取2.00 mL于10 mL具塞比色管中，按上述方法測定510 nm波長處吸光度，代入蘆丁標準曲線即得板栗殼黃酮溶液中總黃酮質量濃度。按式（1）計算黃酮含量，按式（2）計算板栗殼黃酮提取得率。

式中：ρ為代入蘆丁標準曲線計算出的板栗殼黃酮溶液總黃酮質量濃度/（mg/mL）；V為待測樣品溶液的體積/mL；m為稱取的板栗殼黃酮凍干粉的質量/g；n1為板栗殼黃酮凍干粉到測定樣品的稀釋倍數。

式中：ρ為代入蘆丁標準曲線計算出的板栗殼黃酮溶液中總黃酮質量濃度/（mg/mL）；V為待測樣品溶液的體積/mL；m為板栗殼的質量/g；n2為1.3.1節總板栗殼質量到測定樣品的稀釋倍數。

1.3.3 板栗殼黃酮結構分析

樣品溶液制備：稱取1.3.1節中純化后的板栗殼黃酮凍干粉末0.10 g，用體積分數70%甲醇溶液溶解并定容至100 mL，經0.22 μm濾膜過濾后備用。

色譜條件：使用Ultimate 3000型UPLC（配有Hypersil GOLD C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm））對板栗殼黃酮類化合物進行分離[17]，色譜柱溫度35 ℃，樣品盤溫度5 ℃，在進樣前后，用200 μL體積分數70%甲醇溶液洗滌自動進樣器，洗滌2 次；液相流動相：A相乙腈，B相體積分數0.1%甲醇溶液，進樣體積5 μL，流速0.4 mL/min；梯度洗脫：0～5 min，A：15%～50%，B：85%～50%；5～25 min，A：50%～95%，B：50%～5%；25～30 min，A：95%～5%，B：5%～95%；30～50 min，A：5%～95%，B：95%～5%。

質譜條件：使用Q-Orbitrap MS儀對板栗殼黃酮進行分析。質譜分析條件[18-19]：離子源為電噴霧電離源（electrospray ionization，ESI），負離子掃描，電壓-3 kV；一級質譜分辨率設置為RP＝70 000、m/z200；二級質譜分辨率設置為35 000，m/z200；電探頭蒸發器溫度350 ℃；掃描質量為m/z100～1 000；MS1阱填充時間為250 ms，自動增益控制設置為1 000 000；MS2阱填充時間設置為120 ms，自動增益控制設置為200 000；標準化碰撞能量25 eV，階梯能量設置為40%；根據MS1的離子強度，進行MS1-MS2的切換。

1.3.4 胰脂肪酶活力的測定

參考王遠等[20]的方法繪制PNP標準曲線。稱取0.07 g PNP用磷酸緩沖液（0.20 mol/L、pH 7.4，下同）溶解并定容至100 mL，配制成濃度為5 mmol/L的母液，分別吸取0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 mL于10 mL具塞比色管中，補加磷酸緩沖液稀釋成0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07 mmol/L的PNP溶液，于405 nm波長處測定吸光度，以PNP濃度為橫坐標，對應吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程為y＝11.268x+0.006 4，R2＝0.999 7。

胰脂肪酶活力的測定參照Mcdougall等[21]報道的方法并加以改進。稱取0.10 g胰脂肪酶，用磷酸緩沖液定容至50 mL，8 000 r/min離心10 min，取上清液，得到2 mg/mL的胰脂肪酶液母液；吸取131.09 μL PNPP溶解于0.25 mLN,N-二甲基甲酰胺，用磷酸緩沖液定容至100 mL，加Triton X-100 25 滴，即得11.2 mmol/L的PNPP溶液（底物溶液）；取胰脂肪酶液2 mL于10 mL具塞比色管中，加入4 mL磷酸緩沖液，37 ℃保溫10 min后，加入2 mL底物溶液，于水浴鍋中37 ℃避光反應20 min后，于405 nm波長處測定吸光度。代入PNP標準曲線即得胰脂肪酶催化底物產生的PNP濃度。胰脂肪酶活力的計算如公式（3）所示，37 ℃下保溫10 min，以每分鐘內催化底物產生1 μmol PNP定義為1 個胰脂肪酶活力單位（U）。

式中：n為稀釋倍數；V為待測樣品溶液的體積/mL；c為代入PNP標準曲線計算得出的PNP濃度/（mmol/L）；t為反應時間/min；0.004為反應體系中胰脂肪酶的質量/g。

1.3.5 不同反應條件下板栗殼黃酮對胰脂肪酶活力影響的測定

1.3.5.1 不同濃度的板栗殼黃酮下胰脂肪酶活力的測定

稱取0.02 g板栗殼黃酮凍干粉，用磷酸緩沖液定容至20 mL，即得1.00 mg/mL板栗殼黃酮溶液；稱取奧利司他粉末，用少量二甲基亞砜溶解，加磷酸緩沖液水浴加熱配制成20 mL 1.00 mg/mL奧利司他溶液。將板栗殼黃酮溶液、奧利司他用磷酸緩沖液分別稀釋為0.10、0.20、0.50、0.80、1.00 mg/mL得到不同質量濃度的抑制劑溶液。按照1.3.4節方法，在各反應體系中加入0.50 mL抑制劑溶液，在pH 7.4、37 ℃下避光反應20 min后，于405 nm波長處測定吸光度，按式（4）計算胰脂肪酶活力抑制率。

式中：A1為不加抑制劑反應體系的吸光度；A2為加入抑制劑反應體系的吸光度。

1.3.5.2 不同pH值下胰脂肪酶活力的測定

按1.3.5.1節方法，在各反應體系中加入1.00 mg/mL板栗殼黃酮溶液0.50 mL即為實驗組；在各反應體系中加入0.50 mL磷酸緩沖液即為空白組。將空白組和實驗組各體系在溫度為37 ℃，pH值分別為6.8、7.1、7.4、7.7、8.0條件下反應20 min，于405 nm波長處測定吸光度，計算胰脂肪酶活力抑制率。

1.3.5.3 不同反應溫度下胰脂肪酶活力的測定

按1.3.5.1節方法，在各反應體系中加入1.00 mg/mL 0.50 mL板栗殼黃酮溶液即為實驗組；在各反應體系中加入0.50 mL磷酸緩沖液即為空白組。將空白組和實驗組各體系在pH值為7.4，溫度分別為30、33、37、40、43 ℃條件下反應20 min，于405 nm波長處測定吸光度，計算胰脂肪酶活力抑制率。

1.3.5.4 不同反應時間下胰脂肪酶活力的測定

按1.3.5.1節方法，在各反應體系中加入0.50 mL 1.00 mg/mL板栗殼黃酮溶液即為實驗組；在各反應體系中加入0.50 mL磷酸緩沖液即為空白組。將空白組和實驗組各體系在pH 7.4、37 ℃條件下分別反應10、15、20、25 min及30 min，于405 nm波長處測定吸光度，計算抑制率。

1.3.6 抑制作用類型的測定

固定酶質量濃度為0.67 mg/mL，測定不同質量濃度板栗殼黃酮（0、0.5、1 mg/mL）在不同底物濃度（0.93、1.87、2.80、3.73 mmol/L）條件下的反應速率。取胰脂肪酶液2 mL于10 mL具塞比色管中，加入0.50 mL抑制劑溶液，補加磷酸緩沖液至6 mL，37 ℃保溫10 min后，加入2 mL底物溶液，每分鐘測量一次405 nm波長處的吸光度，測量總時長20 min，按Lineweaver-Burk雙倒數作圖法[22]，以底物濃度的倒數（1/[S]）為橫坐標，反應速率的倒數（1/V）為縱坐標，繪制雙倒數曲線圖。

1.4 數據處理與分析

所有數據均為3 組平行實驗數據取平均值得到；采用Origin Pro 9軟件進行數據處理；采用SPSS 19.0軟件中的t檢驗進行顯著性分析，P＜0.05表示組間差異顯著。

2 結果與分析

2.1 板栗殼黃酮的提取得率和含量

采用醇提法，將提取得到的樣品經AB-8樹脂純化得到板栗殼黃酮提取物，經計算，板栗殼黃酮提取得率為（5.66±0.05）%，其含量為（107.50±1.00）mg/g。可用于后續結構分析及胰脂肪酶抑制活性研究。

2.2 板栗殼黃酮結構分析結果

板栗殼黃酮總離子流圖如圖1所示。結合高分辨質譜信息和相關研究結果[23-28]，本研究共鑒定出9 種酚類化合物，其中8 種屬于黃酮類化合物，具體分析如下。

圖1 板栗殼黃酮的總離子流圖Fig. 1 Total ion current chromatogram of flavonoids from chestnut shells

由圖1、表1可知，當保留時間為17.7、26.8 min時，1、7號峰分子離子峰m/z577，可確定化合物1、7的相對分子質量為678，二級質譜峰為m/z425、289、451、407[23]。B型原花青素二聚體是2 個原花青素單體通過C4—C8或C4—C6相連并在C2和C7或者C2和C5之間形成C—O—C鍵的化合物，在ESI-模式下失去一個氫原子得到m/z578，以m/z578為母體離子進行碰撞誘導分離，主要的裂解碎片離子為m/z289、407、425、451，可鑒定該物質為B型原花青素二聚體[24]。m/z289為QM cleavage分子間斷裂失去1 個聚合單元（兒茶素或表兒茶素）得到；m/z407是分子離子先發生逆狄爾斯-阿爾德反應，再失去一分子H2O得到；m/z425則由分子離子發生逆狄爾斯-阿爾德反應得到；m/z451是由分子離子發生雜環裂變反應失去間苯三酚得到；m/z578分子離子失去一分子水得到m/z560。

表1 板栗殼黃酮結構分析鑒定結果Table 1 Structural identification and analysis of flavonoids from chestnut shells

當保留時間為19.2 min時，3號峰分子離子峰m/z865可確定化合物3的相對分子質量為866，二級質譜得到的碎片離子峰m/z695、577、575、289、287，可知為B型兒茶素三聚物[25]。

當保留時間為21.1 min時，4號峰分子離子峰m/z289，可確定化合物4的相對分子質量為290，二級質譜得到的碎片離子峰為m/z245、205、179，與參考文獻[25]中m/z245.14、205.22、179.26的結果一致，因此可鑒定此化合物為表兒茶素。

當保留時間為21.6 min時，5號峰分子離子峰m/z635可確定化合物5的相對分子質量為636，二級質譜得到的碎片離子峰m/z465，章麗等[26]的報道，可進一步推斷此化合物為三沒食子酰葡萄糖。

當保留時間為28.5、31.6、37.9 min時，8、10、13號峰分子離子峰m/z575，可確定化合物8、10、13的相對分子質量為576，A型原花青素二聚體是2 個原花青素單體通過C4—C8或C4—C6相連并在C2和C7或者C2和C5之間形成C—O—C鍵的化合物，在ESI-模式下失去一個氫得到m/z576，以m/z576為母體離子進行碰撞誘導分離，主要的裂解碎片離子為m/z289、407、423、449、539、557。且因為A型原花青素二聚體比相應的B型原花青素二聚體在結構上多1 個C—O—C連接鍵，分子離子少兩個質子，相較于1號化合物，此化合物為A型原花青素二聚體。

當保留時間為32.3 min時，11號峰分子離子峰m/z863，可確定化合物11的相對分子質量為864，與董麗紅[25]報道的結果一致，可判斷此化合物為A型原花青素三聚體。

當保留時間為38.6 min時，14號峰分子離子峰m/z463，可確定化合物14的相對分子質量為464，與文獻[27]中異槲皮苷的相對分子質量一致，二級質譜得到的碎片離子峰m/z301，推測該化合物為異槲皮苷（槲皮素-3-O-葡萄糖苷），分子離子碎片m/z463失去m/z162的葡萄糖基生成槲皮素苷元（m/z301），由此可知，14號峰化合物中存在葡萄糖基，且裂解規律符合異槲皮苷的特點。

當保留時間為41 min時，15號峰分子離子峰m/z477可確定化合物15的相對分子質量為478，二級質譜得到的碎片離子峰m/z459、357、315、314符合甲基鞣花酸己糖的裂解規律。

當保留時間為42.6 min時，17號峰分子離子峰m/z609，可確定化合物17的相對分子質量為610，二級質譜得到的碎片離子峰m/z301、271、179、151，與文獻[28]中報道蘆丁相對分子質量一致，在二級質譜圖中，分子離子碎片m/z609失去質量數為308的葡萄糖基碎片生成苷元槲皮素碎片m/z301，m/z301分子離子碎片1、2處斷裂轉移兩個氫，失去質量數為122的中性碎片生成m/z179的離子；m/z301分子離子碎片發生逆狄爾斯-阿爾德反應生成m/z151的離子，故可判斷化合物17為蘆丁。

2.3 不同反應條件下板栗殼黃酮對胰脂肪酶活力的影響

2.3.1 不同質量濃度的板栗殼黃酮對胰脂肪酶活力抑制率的影響

采用對硝基苯酚法測定胰脂肪酶活力，在405 nm波長處測得待測樣品吸光度，由標準曲線計算得胰脂肪酶催化PNPP產生的PNP濃度為48.46 mmol/mL，經計算得胰脂肪酶活力為0.019 4 U。

以奧利司他為陽性對照，研究板栗殼黃酮對胰脂肪酶的抑制作用。由圖2可知，在0～0.062 5 mg/mL范圍內，板栗殼黃酮對胰脂肪酶的抑制效果明顯弱于陽性對照奧利司他對胰脂肪酶的抑制效果，而在較高質量濃度0.062 5～0.125 mg/mL范圍內，板栗殼黃酮對胰脂肪酶的抑制效果逐漸接近奧利司他對胰脂肪酶的抑制效果，當板栗殼黃酮質量濃度高于0.062 5 mg/mL時，抑制效果趨于平緩，說明在此質量濃度時，板栗殼黃酮與胰脂肪酶的結合達到飽和。根據實驗數據進行擬合得到板栗殼黃酮及奧利司他對胰脂肪酶的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分別為0.074 mg/mL和0.064 mg/mL。由此可知，在0.012 5～0.125 0 mg/mL范圍內，板栗殼黃酮對胰脂肪酶的抑制率與抑制劑濃度存在劑量效應關系，與相同劑量的陽性對照奧利司他對胰脂肪酶的抑制率接近。

圖2 抑制劑質量濃度對胰脂肪酶活力抑制率的影響Fig. 2 Effect of inhibitor concentration on pancreatic lipase activity

2.3.2 不同pH值下板栗殼黃酮對胰脂肪酶活力的抑制作用

酶的活力與pH值密切相關，酶在催化反應中都有其最適pH值，過酸或過堿都會改變酶的結構，使酶喪失活力，因此pH值的改變會影響酶對底物的催化作用[29]。由圖3A可知，胰脂肪酶的最適pH值在7.4，這是因為胰脂肪酶的等電點為5.0，在PNPP、磷酸緩沖液、N,N-二甲基甲酰胺及Triton X-100形成的pH 7.4的體系中的油-水界面發生反應時帶負電荷，與Triton X-100帶負電的羥基形成的親水端發生互斥作用，更易與底物接觸發揮更大活性。加入板栗殼黃酮后胰脂肪酶的最適pH值向堿性條件發生偏移，變更為7.7，初步推斷板栗殼黃酮的加入使胰脂肪酶活性部位的基團離子化發生變化，因而產生最適pH值的微小偏移；在pH 7.4時，空白組與樣品組的酶活力有顯著性差異（P＜0.05）。由圖3B可知，板栗殼黃酮對胰脂肪酶的抑制率最大，為62.23%，與人體小腸部位的pH值（約6.8）相近[30]，說明板栗殼黃酮在小腸部位能對胰脂肪酶發揮較理想的抑制效果。

圖3 不同pH值下板栗殼黃酮對胰脂肪酶活力的抑制作用Fig. 3 Inhibitory effect of chestnut shell flavonoids on pancreatic lipase activity at different pHs

2.3.3 不同反應溫度下板栗殼黃酮對胰脂肪酶活力的抑制作用

溫度對酶有雙重影響，既可能在最適溫度使酶活力達到最大，也能在高溫時使酶失去活力。由圖4可知，未加抑制劑時，胰脂肪酶活力在30～37 ℃溫度范圍內呈現逐漸升高的狀態，到達臨界溫度37 ℃時，胰脂肪酶活力達到最高，隨即在37～43 ℃胰脂肪酶活力逐漸降低，因此判斷胰脂肪酶的最適反應溫度為37 ℃，這與人體內溫度一致。人體內大多數酶的最適反應溫度在35～40 ℃[31]，如果繼續升高溫度可能破壞了胰脂肪酶的共價鍵結構使其結構發生改變失去活性；而加入板栗殼黃酮，胰脂肪酶活力在30～43 ℃溫度范圍內差異較小，最大差異為0.003 U/g，胰脂肪酶的最適反應溫度發生改變，在高于37 ℃時更耐受，說明板栗殼黃酮的加入影響了胰脂肪酶的空間構象，改變了胰脂肪酶的熱穩定性。板栗殼黃酮對胰脂肪酶的抑制在33 ℃即開始發揮較好的作用，在37 ℃時，空白組與樣品組的酶活力有顯著性差異（P＜0.05），抑制效果最佳，抑制率為65.20%；抑制效果在37～43 ℃范圍內抑制效果逐漸減弱，這與升高溫度破壞胰脂肪酶的共價鍵結構有關。由結果進一步推測板栗殼黃酮可在體內對胰脂肪酶發揮理想的抑制效果。

圖4 不同反應溫度下板栗殼黃酮對胰脂肪酶活力的抑制作用Fig. 4 Inhibitory effect of chestnut shell flavonoids on pancreatic lipase activity at different reaction temperatures

2.3.4 不同反應時間下板栗殼黃酮對胰脂肪酶活力的抑制作用

不同反應時間下板栗殼黃酮對胰脂肪酶活力的抑制作用結果如圖5所示，在10～20 min時，胰脂肪酶活力隨著時間的延長迅速增加，在20 min之后活力變化較不明顯，呈現略微下降趨勢，隨著時間延長，PNP的生成趨于穩定；加入板栗殼黃酮，胰脂肪酶活力在20 min時最大，為0.022 U/g，而20 min之后的抑制效果強于20 min之前，證明隨著時間的延長，板栗殼黃酮與胰脂肪酶的結合逐漸增強。反應時間大于20 min時，樣品組的酶活力顯著低于對照組（P＜0.05），表明板栗殼黃酮對胰脂肪酶的抑制效果隨時間延長而增強。

圖5 不同反應時間下板栗殼黃酮對胰脂肪酶活力的抑制作用Fig. 5 Inhibitory effect of chestnut shell flavonoids on pancreatic lipase activity at different reaction times

2.4 板栗殼黃酮對胰脂肪酶的抑制作用類型

如圖6所示，以1/[S]和1/V進行雙倒數作圖，當底物物質的量濃度為0.93～3.73 mmol/L時，改變抑制劑的濃度，直線的斜率發生改變，在x軸上的截距不變，即加入抑制劑，最大反應速率（Vmax）降低，米氏常數（Km）不變，這是非競爭性抑制作用的特性，由此可以看出，板栗殼黃酮對胰脂肪酶的抑制作用類型為非競爭性抑制，根據圖6計算可得抑制常數（Ki）為53.19 mg/mL，0 mg/mL板栗殼黃酮的Vmax為5.19 μmol/（L·min），0.5 mg/mL板栗殼黃酮的Vmax為3.55 μmol/（L·min），1 mg/mL板栗殼黃酮的Vmax為2.03 μmol/（L·min）。非競爭性抑制的程度僅取決于抑制劑的濃度，板栗殼黃酮與胰脂肪酶活性中心外的必需基團產生結合，與底物之間不存在競爭關系。因此，底物濃度的增加并不影響抑制劑的抑制效果，這為有效地將板栗殼黃酮開發為胰脂肪酶抑制劑提供了理論依據。

圖6 板栗殼黃酮對胰脂肪酶作用的雙倒數曲線圖Fig. 6 Lineweaver-Burk plots of flavonoids from chestnut shells against pancreatic lipase

3 結 論

用醇提法提取板栗殼黃酮，提取物經AB-8大孔樹脂純化，得到的黃酮含量為（107.50±1.00）mg/g，提取得率為（5.66±0.05）%。通過UPLC-Q-Orbitrap MS對提取得到的板栗殼黃酮進行結構分析，鑒定出9 種酚類化合物，分別為B型原花青素二聚體、B型兒茶素三聚體、兒茶素/表兒茶素、三沒食子酰葡萄糖、A型原花青素二聚體、A型原花青素三聚體、異槲皮苷、甲基鞣花酸己糖及蘆丁，其中8 種為黃酮類化合物。板栗殼黃酮對胰脂肪酶具有較好的抑制作用，IC50為0.074 mg/mL，在37 ℃、pH 7.4條件下具有較好抑制效果（抑制率為65.20%），證明板栗殼黃酮在小腸部位能對胰脂肪酶發揮較理想的抑制作用。板栗殼黃酮改變胰脂肪酶活性部位的基團，使其最適pH值向堿性偏移。用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法證明板栗殼黃酮對胰脂肪酶的抑制類型為非競爭性抑制，即板栗殼黃酮是與胰脂肪酶活性中心外的必需基團產生結合，與底物之間不存在競爭關系。胰脂肪酶是腸道內脂肪水解過程中的關鍵酶，抑制胰脂肪酶活力可減少食物中攝入脂肪的水解和吸收，降低肥胖和超重引發各種慢性病的風險。