呼吸代謝參與粉紅單端孢侵染厚皮甜瓜果實(shí)不同階段的防御反應(yīng)

薛素琳，南米娜，龔 迪，王 斌，姜 紅，Dov PRUSKY,3，畢 陽,*，薛華麗

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；3.以色列農(nóng)業(yè)研究組織農(nóng)產(chǎn)品采后科學(xué)部，以色列 里雄萊錫安 7505101）

粉紅單端孢（Trichothecium roseum）是主要的采后病原真菌[1]，不僅侵染杏[2]、甜瓜[3]和番茄[4]等多種果蔬，引起品質(zhì)劣變，而且還會在果實(shí)體內(nèi)積累單端孢霉烯族毒素，造成潛在的安全隱患[5]。該病原菌主要經(jīng)由果實(shí)表面的傷口和自然孔口侵染[6]，通過堿化果實(shí)傷口環(huán)境激活胞外酶致病[7]。有報(bào)道表明，果蔬的呼吸代謝在病原菌侵染過程中具有重要作用[8]。三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環(huán)是重要的呼吸代謝途徑，在提供能量、還原力以及碳骨架方面具有核心作用[9]，磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway，PPP）是另一條重要的呼吸代謝途徑，除了提供還原力外，還是核苷酸、芳香族氨基酸、苯丙烷及其衍生物碳骨架的重要來源[10]。Zhang Shen等發(fā)現(xiàn)，焦腐病菌（Lasiodiplodia theobromae）侵染激活了龍眼果實(shí)的TCA循環(huán)，導(dǎo)致還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）顯著積累，而PPP受到抑制，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）含量減少[11]；在擬莖點(diǎn)霉菌（Phomopsis longanae）侵染龍眼果實(shí)期間也觀察到類似的現(xiàn)象[12]。也有報(bào)道表明，灰霉病菌（Botrytis cinerea）侵染活化了蘋果果實(shí)的PPP，促進(jìn)了NADPH的合成[13]。同樣，擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）侵染蘋果果實(shí)后激活了葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH），促進(jìn)了NADPH合成[14]。盡管已有不同病原真菌侵染增強(qiáng)果實(shí)TCA循環(huán)和PPP的報(bào)道，但T. roseum侵染厚皮甜瓜后，果實(shí)TCA循環(huán)和PPP如何發(fā)生變化及其在不同侵染階段的差異鮮見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)用T. roseum接種厚皮甜瓜果實(shí)，觀察常溫條件下果實(shí)病斑直徑的變化，測定侵染期間果實(shí)病健交界處組織TCA循環(huán)和PPP關(guān)鍵酶活力以及中間產(chǎn)物含量的變化，分析不同侵染階段的差異，以期為揭示TCA循環(huán)和PPP在病原菌侵染果實(shí)中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與試劑

‘玉金香’厚皮甜瓜，于2017年6月14日（花后35 d）采自甘肅省蘭州市皋蘭縣什川鎮(zhèn)泥灣村。單果套發(fā)泡網(wǎng)袋后入包裝箱（30 個(gè)/箱），當(dāng)天運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室，于（22±2）℃、相對濕度55%～60%下貯藏待用。

T. roseum為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP）美國西格瑪公司；植物NAD激酶（NAD kinase，NADK）、植物核酮糖-5-磷酸（ribulose-5-phosphate，Ru5P）酶聯(lián)免疫分析試劑盒 上海杏宜生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；3K30型高速冷凍離心機(jī) 北京東訊天地醫(yī)療儀器有限公司；CX21FS1C型生物顯微鏡 日本奧林巴斯工業(yè)有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；SPX-30085H-II型恒溫培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 果實(shí)損傷接種

孢子懸浮液的制備參考Bi Yang等[15]的方法。取25 ℃下培養(yǎng)7 d含有T. roseum的PDA培養(yǎng)基，加入含體積分?jǐn)?shù)0.05% Tween 20的無菌水約10 mL，用玻璃棒刮下PDA培養(yǎng)基上的T. roseum孢子，然后轉(zhuǎn)入50 mL三角瓶中，在漩渦混合器上振蕩15 s，再用雙層紗布過濾，濾液用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)算出孢子懸浮液的濃度，用無菌水稀釋至1×106spores/mL。

果實(shí)損傷接種參考Bi Yang等[15]的方法并修改。果實(shí)先用自來水沖洗干凈，然后用體積分?jǐn)?shù)2%次氯酸鈉溶液浸泡1 min，再用自來水沖洗后常溫（22±2）℃下晾干。用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液對果實(shí)接種點(diǎn)進(jìn)行表面消毒后，用滅菌鐵釘（直徑3 mm）在果實(shí)赤道部位均勻打孔4 個(gè)（深3 mm）。孔內(nèi)分別接入20 μL上述孢子懸浮液，以無菌水接種作對照組，晾干后于常溫下貯藏。分別在接種后0、12、24、48 h和72 h測量病斑直徑。每處理每一時(shí)間點(diǎn)用果實(shí)8 個(gè)，重復(fù)3 次。

1.3.2 生化指標(biāo)測定取樣

參照Lü Liang等[16]的方法，分別于接種后0、12、24、48 h和72 h用直徑為10 mm的打孔器距離病斑邊緣1 cm內(nèi)打孔，切取皮下2～5 mm處果肉組織3 g，鋁箔紙包裹，液氮速凍后于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于測定生化指標(biāo)。

1.3.3 相關(guān)代謝酶活力測定

1.3.3.1 異檸檬酸脫氫酶和蘋果酸脫氫酶活力測定

參考Tang Mi等[17]的方法。取3 g冷凍組織，加入6 mL提取緩沖液（200 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L抗壞血酸、體積分?jǐn)?shù)0.1% Triton X-100，pH 8.2）研磨。在4 ℃下勻漿，10 000 r/min離心30 min，上清液為粗酶液。

異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）活力測定反應(yīng)體系：0.3 mL粗酶液、0.5 mL反應(yīng)液（40 mmol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸、0.8 mmol/L NAD、0.2 mmol/L MnSO4，pH 8.2）、0.2 mL 2 mmol/L異檸檬酸鈉，混合后于340 nm波長處測定吸光度，以每克鮮組織每分鐘消耗1 mmol NAD表示1 個(gè)IDH活力，單位為mmol/（min·g）。

蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，MDH）活力測定反應(yīng)體系：0.3 mL粗酶液、0.5 mL反應(yīng)液（40 mmol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸、0.8 mmol/L NAD、0.2 mmol/L MnSO4，pH 8.2）、0.2 mL 2 mmol/L蘋果酸鈉溶液，混合后于340 nm波長處測定吸光度。以每克鮮組織每分鐘消耗1 mmol NAD表示1 個(gè)MDH活力，單位為mmol/（min·g）。

1.3.3.2 NADK活力測定

參照植物NADK酶聯(lián)免疫分析試劑盒的方法。取3 g冷凍組織，加入6 mL磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）研磨。在4 ℃下勻漿3 000 r/min離心20 min，上清液為粗酶液。NADK活力測定反應(yīng)體系：40 μL樣品稀釋液（0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液、體積分?jǐn)?shù)0.5%牛血清白蛋白溶液，pH 7.2）、10 μL粗酶液、100 μL酶標(biāo)試劑。37 ℃溫育60 min，棄去液體，洗滌液清洗5 次，甩干后加入50 μL顯色劑A、50 μL顯色劑B混合，37 ℃避光15 min，加入50 μL終止液終止反應(yīng)，于450 nm波長處測定吸光度。以每克鮮組織每分鐘產(chǎn)生1 nmol NADP表示1 個(gè)NADK活力，單位為nmol/（min·g）。

1.3.3.3 G6PDH和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶活力測定

參考Mateos等[18]的方法。取3 g冷凍組織，加入6 mL預(yù)冷的提取緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl、2.5 mmol/L MgCl2、1 mmol/L 乙二胺四乙酸、1 mmol/Lβ-巰基乙醇、5 g/100 mL聚乙烯吡咯烷酮，pH 8.0），在4 ℃條件下浸提20 min，勻漿液在10 000 r/min下離心20 min，上清液為粗酶液。

G6PDH活力測定反應(yīng)體系：150 μL粗酶液、850 μL反應(yīng)液（100 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L MgCl2、3 mmol/L NADP、3 mmol/L 葡萄糖-6-磷酸（glucose-6-phosphate，G6P），pH 8.0），混合后于340 nm波長處測定吸光度。以每克鮮組織每分鐘產(chǎn)生1 nmol NADPH表示1 個(gè)G6PDH活力，單位為nmol/（min·g）。

6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6-phosphogluconate dehy drogenase，6PGDH）活力測定反應(yīng)體系：150 μL粗酶液、850 μL反應(yīng)液（100 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L MgCl2、3 mmol/L NADP、3 mmol/L 6-磷酸葡萄糖酸（6-phosphogluconate，6PG），pH 8.0），混合后于340 nm波長處測定吸光度。以每克鮮組織每分鐘產(chǎn)生1 nmol NADPH表示1 個(gè)6PGDH活力，單位為nmol/（min·g）。

1.3.3.4 核糖-5-磷酸異構(gòu)酶活力測定

參考Xiong Yuqing等[19]的方法。取3 g冷凍組織，加入6 mL提取緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L乙二胺四乙酸、1 mmol/Lβ-巰基乙醇，pH 7.4）研磨。在4 ℃下勻漿10 000 r/min離心5 min，上清液為粗酶液。核糖-5-磷酸異構(gòu)酶（ribose-5-phosphate isomerase，RPI）活力測定反應(yīng)體系包括0.1 mL粗酶液、0.3 mL提取緩沖液、0.1 mL 30 mmol/L核糖-5-磷酸，將試管短暫搖動并在室溫下放置5～15 min。后依次加入0.5 mL 30 mmol/ L半胱氨酸，2 mL體積分?jǐn)?shù)75%硫酸溶液和0.2 mL體積分?jǐn)?shù)0.1%咔唑溶液，37 ℃下水浴30 min后，再在冰水中冷卻2 min，540 nm波長處測定吸光度。以每克鮮組織每分鐘消耗1 nmol核糖-5-磷酸表示1 個(gè)RPI活力，單位為nmol/（min·g）。

1.3.4 相關(guān)代謝產(chǎn)物含量測定

1.3.4.1 G6P和Ru5P含量的測定

G6P含量測定參考Elisa等[20]的方法。取3 g冷凍組織，加入6 mL提取緩沖液（0.2 mol/L Tris-HCl、體積分?jǐn)?shù)0.05% Triton X-100，pH 7.5）研磨，在4 ℃條件下浸提10 min，10 000 r/min離心10 min，上清液為待測液。G6P含量測定反應(yīng)體系：1 mL待測液、20 μL 30 mmol/L NADP、20 μL 0.5 mol/L MgCl2、10 μL 700 U/mL G6PDH，混合后于340 nm波長處測定吸光度。G6P含量單位為ng/g，結(jié)果以鮮質(zhì)量計(jì)。

核酮糖-5-磷酸（ribulose-5-phosphate，Ru5P）含量通過酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒測定。取3 g冷凍組織，加入5 mL生理鹽水研磨，在4 ℃下3 000 r/min離心10 min，上清液為待測液。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同質(zhì)量濃度（50、25、12.5、6.25、3.125 ng/mL）的50 μL標(biāo)準(zhǔn)品，樣品孔加入10 μL待測液、40 μL樣本稀釋液（0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液、體積分?jǐn)?shù)0.5%牛血清白蛋白，pH 7.2）。標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔再加入100 μL辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體混合，37 ℃水浴鍋溫育60 min，棄去液體，加入洗滌液，靜置1 min，棄去洗滌液，如此重復(fù)5 次，加入試劑盒自帶底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min，加入50 μL終止液，混合后15 min內(nèi)在450 nm波長處測定吸光度。Ru5P含量單位為ng/g，結(jié)果以鮮質(zhì)量計(jì)。

1.3.4.2 NAD（H）和NADP（H）含量的測定

參考顧采琴等[21]的方法。取3 g冷凍組織，加入6 mL 0.1 mol/L HCl（對應(yīng)NAD和NADP）或NaOH（對應(yīng)NADH和NADPH）溶液研磨，在4 ℃條件下浸提10 min，10 000 r/min離心20 min，將上清液移至離心管中，用0.1 mol/L的NaOH（HCl）溶液調(diào)pH值至7.0，再在4 ℃條件下，10 000 r/min離心20 min，上清液為待測液。

NAD（H）和NADP（H）含量測定反應(yīng)體系：待測液150 μL、200 μL混合液（含1 mol/L Tricine-NaH、40 mmol/L乙二胺四乙酸、4.2 mmol/L噻唑藍(lán)、16.6 mmol/L吩嗪硫酸甲酯、25 mmol/L G6P）、150 μL 100 mmol/L NaCl，混合后37 ℃水浴5 min，取出后進(jìn)行冰浴，加入100 μL G6PDH（對應(yīng)NADP和NADPH）（乙醇脫氫酶（對應(yīng)NAD和NADH）），再在37 ℃水浴40 min，最終加入200 μL 6 mol/L NaCl溶液終止反應(yīng)，于570 nm波長處測定吸光度。NAD（H）和NADP（H）含量單位均為μmol/g，結(jié)果以鮮質(zhì)量計(jì)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

上述各項(xiàng)測定至少重復(fù)3 次。全部數(shù)據(jù)用Excel 2010軟件計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤，并用SPSS 19.0軟件進(jìn)行Duncan’s多重差異顯著性分析（P＜0.05表示差異顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種T. roseum后厚皮甜瓜果實(shí)病斑直徑的變化

病斑直徑增大是果實(shí)感病的直接表現(xiàn)。由圖1可知，接種果實(shí)在接種后24 h內(nèi)病斑直徑無明顯變化，接種后48 h接種果實(shí)與對照組病斑直徑均增大，接種后72 h果實(shí)病斑直徑顯著高于對照組（P＜0.05），是對照組的1.71 倍（圖1）。

2.2 T. roseum接種對果實(shí)IDH、MDH、G6PDH和6PGDH活力的影響

IDH和MDH是TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶，分別催化異檸檬酸和蘋果酸生成α-酮戊二酸和草酰乙酸，同時(shí)合成NADH[22]。接種果實(shí)和對照組果實(shí)的IDH活力在接種后12 h迅速降低。接種果實(shí)的IDH活力之后緩慢上升，至48 h時(shí)達(dá)到峰值；對照組果實(shí)IDH活力在12 h后基本不變。接種果實(shí)的IDH活力在12 h時(shí)顯著低于對照組，但在24 h后顯著高于對照組（P＜0.05），48 h時(shí)是對照組的1.63 倍（圖2A）。接種果實(shí)的MDH活力在接種后呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，對照組果實(shí)則是先迅速降低后緩慢升高。接種果實(shí)的MDH活力始終高于對照組（P＜0.05），在12 h和24 h時(shí)分別是同期對照組的2.72 倍和2.14 倍（圖2B）。

G6PDH和6PGDH是PPP的關(guān)鍵酶，分別催化G6P和6PG生成6-磷酸葡萄糖酸酯和Ru5P，同時(shí)調(diào)控NADP生成大量的NADPH以作為供氫體參與多種代謝反應(yīng)[10]。接種果實(shí)和對照組果實(shí)的G6PDH活力在接種后24 h內(nèi)相對平穩(wěn)，接種果實(shí)的G6PDH活力顯著高于對照組；24 h后接種果實(shí)的G6PDH活力迅速增加，在48 h和72 h時(shí)分別是同期對照組的1.83 倍和1.71 倍（P＜0.05）（圖2C）。接種果實(shí)和對照組果實(shí)的6PGDH活力在接種后迅速下降，接種果實(shí)的6PGDH活力在接種后24 h內(nèi)顯著低于對照組（P＜0.05）；但接種果實(shí)的6PGDH活力在接種24 h后迅速升高，48 h和72 h時(shí)分別是同期對照組的2.51 倍和2.98 倍（圖2D）。

圖2 T. roseum接種對果實(shí)IDH（A）、MDH（B）、G6PDH（C）和6PGDH（D）活力的影響Fig. 2 Effect of inoculation with T. roseum on the activity of IDH (A),MDH (B), G6PDH (C) and 6PGDH (D) in muskmelon fruit

2.3 T. roseum接種對厚皮甜瓜果實(shí)NAD（H）和NADP（H）含量的影響

NAD（H）和NADP（H）在能量形成和維持細(xì)胞的氧化還原平衡中具有核心作用[23]。在貯藏過程中，接種果實(shí)的NAD和NADH含量均先升高后降低，對照組果實(shí)這兩種物質(zhì)含量逐步升高，且接種果實(shí)的NAD和NADH含量總體顯著高于對照組（P＜0.05），在24 h時(shí)分別高出對照組50.37%和50.31%（圖3A、B）。接種果實(shí)的NADP含量接種后48 h內(nèi)基本穩(wěn)定，但顯著低于對照組（P＜0.05）；接種果實(shí)的NADP含量在48 h后含量迅速增加，在72 h時(shí)與對照組果實(shí)相比無顯著差異；對照組果實(shí)的NADP含量逐漸升高，接種果實(shí)的NADPH含量在48 h內(nèi)緩慢增加，且顯著低于對照組，48 h后迅速增加，且在72 h時(shí)顯著高于對照組（P＜0.05）（圖3C、D）。

圖3 T. roseum接種對果實(shí)NAD（A）、NADH（B）、NADP（C）和NADPH（D）含量的影響Fig. 3 Effect of inoculation with T. roseum on the contents of NAD (A),NADH (B), NADP (C) and NADPH (D) in fruits

2.4 T. roseum接種對厚皮甜瓜果實(shí)G6P和Ru5P含量的影響

G6P和Ru5P是PPP的重要中間產(chǎn)物，G6PDH催化G6P生成6-磷酸葡萄糖內(nèi)酯，6PGDH催化6PG而產(chǎn)生Ru5P，這兩個(gè)反應(yīng)過程均伴有NADPH合成[24]。接種后果實(shí)的G6P含量呈現(xiàn)先略升高后降低再升高的趨勢，雖然12 h和72 h時(shí)接種果實(shí)G6P含量高于對照組果實(shí)，但24 h和48 h時(shí)卻顯著低于對照組（P＜0.05）（圖4A）。接種果實(shí)和對照組果實(shí)的Ru5P含量在接種后48 h內(nèi)逐漸降低，且接種果實(shí)的Ru5P含量顯著低于對照組；接種果實(shí)Ru5P含量在接種48 h后有所升高，且在72 h時(shí)與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）（圖4B）；說明接種顯著降低了早中期果實(shí)Ru5P含量。

圖4 T. roseum接種對果實(shí)G6P（A）和Ru5P（B）含量的影響Fig. 4 Effect of inoculation with T. roseum on the contents of G6P (A)and Ru5P (B) in muskmelon fruit

2.5 T. roseum接種對厚皮甜瓜果實(shí)NADK和RPI活力的影響

NADK通過催化NAD（H）與ATP或無機(jī)多聚磷酸提供的磷酰基生成NADP（H），維持生物體內(nèi)的氧化還原平衡，保護(hù)組織免受氧化損傷[25]。接種果實(shí)的NADK活力在貯藏過程中先升高后降低，在48 h內(nèi)顯著高于對照組（P＜0.05），12 h時(shí)是對照組的1.17 倍（圖5A）。接種果實(shí)和對照組果實(shí)的RPI活力均呈先升高后降低的趨勢，接種果實(shí)在48 h內(nèi)顯著低于對照組；48 h后接種果實(shí)的RPI活力有所上升，在72 h時(shí)與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）（圖5B）；說明接種顯著降低了早中期果實(shí)RPI活力。

圖5 T. roseum接種對果實(shí)NADK（A）和RPI（B）活力的影響Fig. 5 Effect of inoculation with T. roseum on the activity of NADK (A)and RPI (B) in muskmelon fruit

3 討 論

呼吸代謝增強(qiáng)是病原真菌侵染植物后的典型反應(yīng)[11]。但不同的呼吸途徑在不同的侵染階段表現(xiàn)各異，L. theobromae侵染龍眼早期誘導(dǎo)NAD（H）合成，促進(jìn)TCA循環(huán)[11]；P. longanae侵染荔枝果實(shí)后期會提高NADP（H）含量，提高PPP代謝強(qiáng)度[26]。

TCA循環(huán)除了能提供碳骨架外，還能合成ATP和NADH[22]。NAD和NADH是吡啶核苷酸的主要類型，起調(diào)節(jié)輔因子和電子轉(zhuǎn)移的作用，參與鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[27]；NAD和NADH通過多聚ADP核糖基化和蛋白質(zhì)去乙酰化參與修復(fù)DNA[28]。隨著質(zhì)子跨線粒體膜轉(zhuǎn)運(yùn)，通過TCA循環(huán)將NAD轉(zhuǎn)化為NADH[29]。NADH可通過氧化磷酸化進(jìn)一步氧化為NAD，并伴隨ATP的生成[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，T. roseum侵染早期甜瓜果實(shí)的NAD和NADH含量大幅度升高。前人研究發(fā)現(xiàn)，大麥感染白粉病后，葉片中NAD含量增加了2 倍[31]；NAD可誘導(dǎo)擬南芥PR基因的表達(dá)和對丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）的抗性[32]。IDH是TCA循環(huán)中的關(guān)鍵酶，催化琥珀酸生成α-酮戊二酸，同時(shí)產(chǎn)生NADH[33]。α-酮戊二酸是谷氨酸合成前體[34]，谷氨酸在植物抵御病原菌侵染過程中具有重要作用[35]。本研究發(fā)現(xiàn)，T. roseum侵染早期甜瓜果實(shí)的IDH活力在早期（12 h）顯著低于對照組。前人研究發(fā)現(xiàn)，過量ATP的產(chǎn)生可抑制TCA循環(huán)[11]，T. roseum侵染12 h時(shí)，能誘導(dǎo)厚皮甜瓜大量ATP合成[16]。因此，認(rèn)為IDH活力在侵染早期的降低可能受到ATP大量合成的影響。MDH是TCA循環(huán)中的另一關(guān)鍵酶[36]，催化蘋果酸生成草酰乙酸，促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)和亞細(xì)胞器之間代謝物的交換和NADH的再生，且與能量代謝密切相關(guān)[37]。本研究發(fā)現(xiàn)，T. roseum侵染早期大幅度提高了甜瓜果實(shí)的MDH活力，該結(jié)果與Fusarium oxysporum侵染豌豆后導(dǎo)致的早期MDH活力升高的結(jié)果[38]基本一致。由此表明，通過TCA循環(huán)形成的能量和碳骨架在厚皮甜瓜果實(shí)抵御病原物侵染的早期發(fā)揮了重要作用。

PPP不僅能提供碳骨架，同時(shí)也是NADPH的主要來源途徑[10]，同時(shí)其中間產(chǎn)物如赤蘚糖-4-磷酸是合成可溶性酚酸的前體，酚酸能夠激活植物細(xì)胞體內(nèi)信號參與對病原菌的抗性[39-40]。葡萄糖經(jīng)己糖激酶催化生成的G6P是PPP的初始底物，G6P可為蔗糖、淀粉和細(xì)胞壁的合成提供前體物質(zhì)[41]。NADPH可在NADPH氧化酶的作用下轉(zhuǎn)移電子將O2催化還原為超氧陰離子，參與活性氧產(chǎn)生[42]。NADPH還是谷胱甘肽還原酶的輔酶，以維持還原型谷胱甘肽的正常水平，在清除活性氧的過程中發(fā)揮作用，以保護(hù)酶、硫氧還蛋白以及細(xì)胞膜免受氧化損傷[43]。RPI可催化PPP的非氧化階段中Ru5P和R5P之間相互轉(zhuǎn)化，在核苷酸、芳香族氨基酸、苯丙烷及其衍生物合成中具有重要作用[44]，苯丙烷及其衍生物除具有直接的抑菌作用外，還積極參與了寄主的抗病反應(yīng)[45]。本研究發(fā)現(xiàn)，T. roseum侵染厚皮甜瓜后期顯著提高了G6PDH和6PGDH的活力，促進(jìn)了G6P和NADPH的積累。NADPH含量在侵染的前期和中期顯著低于對照組，而在后期顯著高于對照組，可能是由于在前期和中期TCA循環(huán)旺盛，抑制了PPP[37-38]。后期接種甜瓜果實(shí)NADPH含量增加的原因與PPP激活相關(guān)[11,24]。由此表明，通過PPP形成的碳骨架和NADPH在厚皮甜瓜果實(shí)抵御病原菌侵染的后期發(fā)揮了重要作用。

NADK是生物體內(nèi)唯一能夠催化NAD+生成NADP+的酶，該酶以ATP作為磷酰基供體催化NAD（H）反應(yīng)生成NADP（H）[46]。NADK的激活可提高或維持組織中NADPH水平，以發(fā)揮NADPH在抗病中的作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，T. roseum侵染厚皮甜瓜果實(shí)后NADK活力先急劇升高后逐步降低，但始終高于對照組。由此表明，NADK催化的NAD+轉(zhuǎn)化為NADP+在果實(shí)抗病的不同階段均發(fā)揮了作用，但詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步揭示。

接種果實(shí)由于早期能量供應(yīng)短缺導(dǎo)致病斑出現(xiàn)，為了彌補(bǔ)能量供應(yīng)短缺，果實(shí)的TCA循環(huán)被激活，在一定程度上抑制了PPP[11]。接種后期由于防御反應(yīng)需要大量的碳骨架，因此PPP增強(qiáng)，TCA循環(huán)受到了一定程度的抑制[14]。

綜上，T. roseum侵染早期能誘導(dǎo)厚皮甜瓜果實(shí)大幅度提高TCA循環(huán)關(guān)鍵酶MDH的活力，促進(jìn)NAD和NADH的積累；侵染的后期激活了果實(shí)的PPP，增加了G6PDH和6PGDH活力以及G6P、NADH含量。由此表明，TCA循環(huán)和PPP在病原菌侵染果實(shí)的不同階段發(fā)揮作用，TCA循環(huán)更多參與了果實(shí)早期的抗病防御，而PPP在后期的寄主防御反應(yīng)中發(fā)揮了更大的作用。