呼吸代謝參與粉紅單端孢侵染厚皮甜瓜果實不同階段的防御反應

薛素琳，南米娜，龔 迪，王 斌，姜 紅，Dov PRUSKY,3，畢 陽,*，薛華麗

（1.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農業大學理學院，甘肅 蘭州 730070；3.以色列農業研究組織農產品采后科學部，以色列 里雄萊錫安 7505101）

粉紅單端孢（Trichothecium roseum）是主要的采后病原真菌[1]，不僅侵染杏[2]、甜瓜[3]和番茄[4]等多種果蔬，引起品質劣變，而且還會在果實體內積累單端孢霉烯族毒素，造成潛在的安全隱患[5]。該病原菌主要經由果實表面的傷口和自然孔口侵染[6]，通過堿化果實傷口環境激活胞外酶致病[7]。有報道表明，果蔬的呼吸代謝在病原菌侵染過程中具有重要作用[8]。三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環是重要的呼吸代謝途徑，在提供能量、還原力以及碳骨架方面具有核心作用[9]，磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway，PPP）是另一條重要的呼吸代謝途徑，除了提供還原力外，還是核苷酸、芳香族氨基酸、苯丙烷及其衍生物碳骨架的重要來源[10]。Zhang Shen等發現，焦腐病菌（Lasiodiplodia theobromae）侵染激活了龍眼果實的TCA循環，導致還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）顯著積累，而PPP受到抑制，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）含量減少[11]；在擬莖點霉菌（Phomopsis longanae）侵染龍眼果實期間也觀察到類似的現象[12]。也有報道表明，灰霉病菌（Botrytis cinerea）侵染活化了蘋果果實的PPP，促進了NADPH的合成[13]。同樣，擴展青霉（Penicillium expansum）侵染蘋果果實后激活了葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH），促進了NADPH合成[14]。盡管已有不同病原真菌侵染增強果實TCA循環和PPP的報道，但T. roseum侵染厚皮甜瓜后，果實TCA循環和PPP如何發生變化及其在不同侵染階段的差異鮮見報道。因此，本實驗用T. roseum接種厚皮甜瓜果實，觀察常溫條件下果實病斑直徑的變化，測定侵染期間果實病健交界處組織TCA循環和PPP關鍵酶活力以及中間產物含量的變化，分析不同侵染階段的差異，以期為揭示TCA循環和PPP在病原菌侵染果實中的作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與試劑

‘玉金香’厚皮甜瓜，于2017年6月14日（花后35 d）采自甘肅省蘭州市皋蘭縣什川鎮泥灣村。單果套發泡網袋后入包裝箱（30 個/箱），當天運抵實驗室，于（22±2）℃、相對濕度55%～60%下貯藏待用。

T. roseum為本實驗室保存菌種。

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP）美國西格瑪公司；植物NAD激酶（NAD kinase，NADK）、植物核酮糖-5-磷酸（ribulose-5-phosphate，Ru5P）酶聯免疫分析試劑盒 上海杏宜生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-2450型紫外分光光度計 日本島津公司；3K30型高速冷凍離心機 北京東訊天地醫療儀器有限公司；CX21FS1C型生物顯微鏡 日本奧林巴斯工業有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；SPX-30085H-II型恒溫培養箱 上海新苗醫療器械制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 果實損傷接種

孢子懸浮液的制備參考Bi Yang等[15]的方法。取25 ℃下培養7 d含有T. roseum的PDA培養基，加入含體積分數0.05% Tween 20的無菌水約10 mL，用玻璃棒刮下PDA培養基上的T. roseum孢子，然后轉入50 mL三角瓶中，在漩渦混合器上振蕩15 s，再用雙層紗布過濾，濾液用血球計數板計數算出孢子懸浮液的濃度，用無菌水稀釋至1×106spores/mL。

果實損傷接種參考Bi Yang等[15]的方法并修改。果實先用自來水沖洗干凈，然后用體積分數2%次氯酸鈉溶液浸泡1 min，再用自來水沖洗后常溫（22±2）℃下晾干。用體積分數70%乙醇溶液對果實接種點進行表面消毒后，用滅菌鐵釘（直徑3 mm）在果實赤道部位均勻打孔4 個（深3 mm）。孔內分別接入20 μL上述孢子懸浮液，以無菌水接種作對照組，晾干后于常溫下貯藏。分別在接種后0、12、24、48 h和72 h測量病斑直徑。每處理每一時間點用果實8 個，重復3 次。

1.3.2 生化指標測定取樣

參照Lü Liang等[16]的方法，分別于接種后0、12、24、48 h和72 h用直徑為10 mm的打孔器距離病斑邊緣1 cm內打孔，切取皮下2～5 mm處果肉組織3 g，鋁箔紙包裹，液氮速凍后于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于測定生化指標。

1.3.3 相關代謝酶活力測定

1.3.3.1 異檸檬酸脫氫酶和蘋果酸脫氫酶活力測定

參考Tang Mi等[17]的方法。取3 g冷凍組織，加入6 mL提取緩沖液（200 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L抗壞血酸、體積分數0.1% Triton X-100，pH 8.2）研磨。在4 ℃下勻漿，10 000 r/min離心30 min，上清液為粗酶液。

異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）活力測定反應體系：0.3 mL粗酶液、0.5 mL反應液（40 mmol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸、0.8 mmol/L NAD、0.2 mmol/L MnSO4，pH 8.2）、0.2 mL 2 mmol/L異檸檬酸鈉，混合后于340 nm波長處測定吸光度，以每克鮮組織每分鐘消耗1 mmol NAD表示1 個IDH活力，單位為mmol/（min·g）。

蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，MDH）活力測定反應體系：0.3 mL粗酶液、0.5 mL反應液（40 mmol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸、0.8 mmol/L NAD、0.2 mmol/L MnSO4，pH 8.2）、0.2 mL 2 mmol/L蘋果酸鈉溶液，混合后于340 nm波長處測定吸光度。以每克鮮組織每分鐘消耗1 mmol NAD表示1 個MDH活力，單位為mmol/（min·g）。

1.3.3.2 NADK活力測定

參照植物NADK酶聯免疫分析試劑盒的方法。取3 g冷凍組織，加入6 mL磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）研磨。在4 ℃下勻漿3 000 r/min離心20 min，上清液為粗酶液。NADK活力測定反應體系：40 μL樣品稀釋液（0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液、體積分數0.5%牛血清白蛋白溶液，pH 7.2）、10 μL粗酶液、100 μL酶標試劑。37 ℃溫育60 min，棄去液體，洗滌液清洗5 次，甩干后加入50 μL顯色劑A、50 μL顯色劑B混合，37 ℃避光15 min，加入50 μL終止液終止反應，于450 nm波長處測定吸光度。以每克鮮組織每分鐘產生1 nmol NADP表示1 個NADK活力，單位為nmol/（min·g）。

1.3.3.3 G6PDH和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶活力測定

參考Mateos等[18]的方法。取3 g冷凍組織，加入6 mL預冷的提取緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl、2.5 mmol/L MgCl2、1 mmol/L 乙二胺四乙酸、1 mmol/Lβ-巰基乙醇、5 g/100 mL聚乙烯吡咯烷酮，pH 8.0），在4 ℃條件下浸提20 min，勻漿液在10 000 r/min下離心20 min，上清液為粗酶液。

G6PDH活力測定反應體系：150 μL粗酶液、850 μL反應液（100 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L MgCl2、3 mmol/L NADP、3 mmol/L 葡萄糖-6-磷酸（glucose-6-phosphate，G6P），pH 8.0），混合后于340 nm波長處測定吸光度。以每克鮮組織每分鐘產生1 nmol NADPH表示1 個G6PDH活力，單位為nmol/（min·g）。

6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6-phosphogluconate dehy drogenase，6PGDH）活力測定反應體系：150 μL粗酶液、850 μL反應液（100 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L MgCl2、3 mmol/L NADP、3 mmol/L 6-磷酸葡萄糖酸（6-phosphogluconate，6PG），pH 8.0），混合后于340 nm波長處測定吸光度。以每克鮮組織每分鐘產生1 nmol NADPH表示1 個6PGDH活力，單位為nmol/（min·g）。

1.3.3.4 核糖-5-磷酸異構酶活力測定

參考Xiong Yuqing等[19]的方法。取3 g冷凍組織，加入6 mL提取緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L乙二胺四乙酸、1 mmol/Lβ-巰基乙醇，pH 7.4）研磨。在4 ℃下勻漿10 000 r/min離心5 min，上清液為粗酶液。核糖-5-磷酸異構酶（ribose-5-phosphate isomerase，RPI）活力測定反應體系包括0.1 mL粗酶液、0.3 mL提取緩沖液、0.1 mL 30 mmol/L核糖-5-磷酸，將試管短暫搖動并在室溫下放置5～15 min。后依次加入0.5 mL 30 mmol/ L半胱氨酸，2 mL體積分數75%硫酸溶液和0.2 mL體積分數0.1%咔唑溶液，37 ℃下水浴30 min后，再在冰水中冷卻2 min，540 nm波長處測定吸光度。以每克鮮組織每分鐘消耗1 nmol核糖-5-磷酸表示1 個RPI活力，單位為nmol/（min·g）。

1.3.4 相關代謝產物含量測定

1.3.4.1 G6P和Ru5P含量的測定

G6P含量測定參考Elisa等[20]的方法。取3 g冷凍組織，加入6 mL提取緩沖液（0.2 mol/L Tris-HCl、體積分數0.05% Triton X-100，pH 7.5）研磨，在4 ℃條件下浸提10 min，10 000 r/min離心10 min，上清液為待測液。G6P含量測定反應體系：1 mL待測液、20 μL 30 mmol/L NADP、20 μL 0.5 mol/L MgCl2、10 μL 700 U/mL G6PDH，混合后于340 nm波長處測定吸光度。G6P含量單位為ng/g，結果以鮮質量計。

核酮糖-5-磷酸（ribulose-5-phosphate，Ru5P）含量通過酶聯免疫吸附測定試劑盒測定。取3 g冷凍組織，加入5 mL生理鹽水研磨，在4 ℃下3 000 r/min離心10 min，上清液為待測液。設置標準品孔和樣品孔，標準品孔各加不同質量濃度（50、25、12.5、6.25、3.125 ng/mL）的50 μL標準品，樣品孔加入10 μL待測液、40 μL樣本稀釋液（0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液、體積分數0.5%牛血清白蛋白，pH 7.2）。標準品孔和樣品孔再加入100 μL辣根過氧化物酶標記的檢測抗體混合，37 ℃水浴鍋溫育60 min，棄去液體，加入洗滌液，靜置1 min，棄去洗滌液，如此重復5 次，加入試劑盒自帶底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min，加入50 μL終止液，混合后15 min內在450 nm波長處測定吸光度。Ru5P含量單位為ng/g，結果以鮮質量計。

1.3.4.2 NAD（H）和NADP（H）含量的測定

參考顧采琴等[21]的方法。取3 g冷凍組織，加入6 mL 0.1 mol/L HCl（對應NAD和NADP）或NaOH（對應NADH和NADPH）溶液研磨，在4 ℃條件下浸提10 min，10 000 r/min離心20 min，將上清液移至離心管中，用0.1 mol/L的NaOH（HCl）溶液調pH值至7.0，再在4 ℃條件下，10 000 r/min離心20 min，上清液為待測液。

NAD（H）和NADP（H）含量測定反應體系：待測液150 μL、200 μL混合液（含1 mol/L Tricine-NaH、40 mmol/L乙二胺四乙酸、4.2 mmol/L噻唑藍、16.6 mmol/L吩嗪硫酸甲酯、25 mmol/L G6P）、150 μL 100 mmol/L NaCl，混合后37 ℃水浴5 min，取出后進行冰浴，加入100 μL G6PDH（對應NADP和NADPH）（乙醇脫氫酶（對應NAD和NADH）），再在37 ℃水浴40 min，最終加入200 μL 6 mol/L NaCl溶液終止反應，于570 nm波長處測定吸光度。NAD（H）和NADP（H）含量單位均為μmol/g，結果以鮮質量計。

1.4 數據統計與分析

上述各項測定至少重復3 次。全部數據用Excel 2010軟件計算平均值和標準誤，并用SPSS 19.0軟件進行Duncan’s多重差異顯著性分析（P＜0.05表示差異顯著）。

2 結果與分析

2.1 接種T. roseum后厚皮甜瓜果實病斑直徑的變化

病斑直徑增大是果實感病的直接表現。由圖1可知，接種果實在接種后24 h內病斑直徑無明顯變化，接種后48 h接種果實與對照組病斑直徑均增大，接種后72 h果實病斑直徑顯著高于對照組（P＜0.05），是對照組的1.71 倍（圖1）。

2.2 T. roseum接種對果實IDH、MDH、G6PDH和6PGDH活力的影響

IDH和MDH是TCA循環的關鍵酶，分別催化異檸檬酸和蘋果酸生成α-酮戊二酸和草酰乙酸，同時合成NADH[22]。接種果實和對照組果實的IDH活力在接種后12 h迅速降低。接種果實的IDH活力之后緩慢上升，至48 h時達到峰值；對照組果實IDH活力在12 h后基本不變。接種果實的IDH活力在12 h時顯著低于對照組，但在24 h后顯著高于對照組（P＜0.05），48 h時是對照組的1.63 倍（圖2A）。接種果實的MDH活力在接種后呈現先升高后降低的趨勢，對照組果實則是先迅速降低后緩慢升高。接種果實的MDH活力始終高于對照組（P＜0.05），在12 h和24 h時分別是同期對照組的2.72 倍和2.14 倍（圖2B）。

G6PDH和6PGDH是PPP的關鍵酶，分別催化G6P和6PG生成6-磷酸葡萄糖酸酯和Ru5P，同時調控NADP生成大量的NADPH以作為供氫體參與多種代謝反應[10]。接種果實和對照組果實的G6PDH活力在接種后24 h內相對平穩，接種果實的G6PDH活力顯著高于對照組；24 h后接種果實的G6PDH活力迅速增加，在48 h和72 h時分別是同期對照組的1.83 倍和1.71 倍（P＜0.05）（圖2C）。接種果實和對照組果實的6PGDH活力在接種后迅速下降，接種果實的6PGDH活力在接種后24 h內顯著低于對照組（P＜0.05）；但接種果實的6PGDH活力在接種24 h后迅速升高，48 h和72 h時分別是同期對照組的2.51 倍和2.98 倍（圖2D）。

圖2 T. roseum接種對果實IDH（A）、MDH（B）、G6PDH（C）和6PGDH（D）活力的影響Fig. 2 Effect of inoculation with T. roseum on the activity of IDH (A),MDH (B), G6PDH (C) and 6PGDH (D) in muskmelon fruit

2.3 T. roseum接種對厚皮甜瓜果實NAD（H）和NADP（H）含量的影響

NAD（H）和NADP（H）在能量形成和維持細胞的氧化還原平衡中具有核心作用[23]。在貯藏過程中，接種果實的NAD和NADH含量均先升高后降低，對照組果實這兩種物質含量逐步升高，且接種果實的NAD和NADH含量總體顯著高于對照組（P＜0.05），在24 h時分別高出對照組50.37%和50.31%（圖3A、B）。接種果實的NADP含量接種后48 h內基本穩定，但顯著低于對照組（P＜0.05）；接種果實的NADP含量在48 h后含量迅速增加，在72 h時與對照組果實相比無顯著差異；對照組果實的NADP含量逐漸升高，接種果實的NADPH含量在48 h內緩慢增加，且顯著低于對照組，48 h后迅速增加，且在72 h時顯著高于對照組（P＜0.05）（圖3C、D）。

圖3 T. roseum接種對果實NAD（A）、NADH（B）、NADP（C）和NADPH（D）含量的影響Fig. 3 Effect of inoculation with T. roseum on the contents of NAD (A),NADH (B), NADP (C) and NADPH (D) in fruits

2.4 T. roseum接種對厚皮甜瓜果實G6P和Ru5P含量的影響

G6P和Ru5P是PPP的重要中間產物，G6PDH催化G6P生成6-磷酸葡萄糖內酯，6PGDH催化6PG而產生Ru5P，這兩個反應過程均伴有NADPH合成[24]。接種后果實的G6P含量呈現先略升高后降低再升高的趨勢，雖然12 h和72 h時接種果實G6P含量高于對照組果實，但24 h和48 h時卻顯著低于對照組（P＜0.05）（圖4A）。接種果實和對照組果實的Ru5P含量在接種后48 h內逐漸降低，且接種果實的Ru5P含量顯著低于對照組；接種果實Ru5P含量在接種48 h后有所升高，且在72 h時與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）（圖4B）；說明接種顯著降低了早中期果實Ru5P含量。

圖4 T. roseum接種對果實G6P（A）和Ru5P（B）含量的影響Fig. 4 Effect of inoculation with T. roseum on the contents of G6P (A)and Ru5P (B) in muskmelon fruit

2.5 T. roseum接種對厚皮甜瓜果實NADK和RPI活力的影響

NADK通過催化NAD（H）與ATP或無機多聚磷酸提供的磷酰基生成NADP（H），維持生物體內的氧化還原平衡，保護組織免受氧化損傷[25]。接種果實的NADK活力在貯藏過程中先升高后降低，在48 h內顯著高于對照組（P＜0.05），12 h時是對照組的1.17 倍（圖5A）。接種果實和對照組果實的RPI活力均呈先升高后降低的趨勢，接種果實在48 h內顯著低于對照組；48 h后接種果實的RPI活力有所上升，在72 h時與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）（圖5B）；說明接種顯著降低了早中期果實RPI活力。

圖5 T. roseum接種對果實NADK（A）和RPI（B）活力的影響Fig. 5 Effect of inoculation with T. roseum on the activity of NADK (A)and RPI (B) in muskmelon fruit

3 討 論

呼吸代謝增強是病原真菌侵染植物后的典型反應[11]。但不同的呼吸途徑在不同的侵染階段表現各異，L. theobromae侵染龍眼早期誘導NAD（H）合成，促進TCA循環[11]；P. longanae侵染荔枝果實后期會提高NADP（H）含量，提高PPP代謝強度[26]。

TCA循環除了能提供碳骨架外，還能合成ATP和NADH[22]。NAD和NADH是吡啶核苷酸的主要類型，起調節輔因子和電子轉移的作用，參與鈣信號轉導[27]；NAD和NADH通過多聚ADP核糖基化和蛋白質去乙酰化參與修復DNA[28]。隨著質子跨線粒體膜轉運，通過TCA循環將NAD轉化為NADH[29]。NADH可通過氧化磷酸化進一步氧化為NAD，并伴隨ATP的生成[30]。本研究發現，T. roseum侵染早期甜瓜果實的NAD和NADH含量大幅度升高。前人研究發現，大麥感染白粉病后，葉片中NAD含量增加了2 倍[31]；NAD可誘導擬南芥PR基因的表達和對丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）的抗性[32]。IDH是TCA循環中的關鍵酶，催化琥珀酸生成α-酮戊二酸，同時產生NADH[33]。α-酮戊二酸是谷氨酸合成前體[34]，谷氨酸在植物抵御病原菌侵染過程中具有重要作用[35]。本研究發現，T. roseum侵染早期甜瓜果實的IDH活力在早期（12 h）顯著低于對照組。前人研究發現，過量ATP的產生可抑制TCA循環[11]，T. roseum侵染12 h時，能誘導厚皮甜瓜大量ATP合成[16]。因此，認為IDH活力在侵染早期的降低可能受到ATP大量合成的影響。MDH是TCA循環中的另一關鍵酶[36]，催化蘋果酸生成草酰乙酸，促進細胞質和亞細胞器之間代謝物的交換和NADH的再生，且與能量代謝密切相關[37]。本研究發現，T. roseum侵染早期大幅度提高了甜瓜果實的MDH活力，該結果與Fusarium oxysporum侵染豌豆后導致的早期MDH活力升高的結果[38]基本一致。由此表明，通過TCA循環形成的能量和碳骨架在厚皮甜瓜果實抵御病原物侵染的早期發揮了重要作用。

PPP不僅能提供碳骨架，同時也是NADPH的主要來源途徑[10]，同時其中間產物如赤蘚糖-4-磷酸是合成可溶性酚酸的前體，酚酸能夠激活植物細胞體內信號參與對病原菌的抗性[39-40]。葡萄糖經己糖激酶催化生成的G6P是PPP的初始底物，G6P可為蔗糖、淀粉和細胞壁的合成提供前體物質[41]。NADPH可在NADPH氧化酶的作用下轉移電子將O2催化還原為超氧陰離子，參與活性氧產生[42]。NADPH還是谷胱甘肽還原酶的輔酶，以維持還原型谷胱甘肽的正常水平，在清除活性氧的過程中發揮作用，以保護酶、硫氧還蛋白以及細胞膜免受氧化損傷[43]。RPI可催化PPP的非氧化階段中Ru5P和R5P之間相互轉化，在核苷酸、芳香族氨基酸、苯丙烷及其衍生物合成中具有重要作用[44]，苯丙烷及其衍生物除具有直接的抑菌作用外，還積極參與了寄主的抗病反應[45]。本研究發現，T. roseum侵染厚皮甜瓜后期顯著提高了G6PDH和6PGDH的活力，促進了G6P和NADPH的積累。NADPH含量在侵染的前期和中期顯著低于對照組，而在后期顯著高于對照組，可能是由于在前期和中期TCA循環旺盛，抑制了PPP[37-38]。后期接種甜瓜果實NADPH含量增加的原因與PPP激活相關[11,24]。由此表明，通過PPP形成的碳骨架和NADPH在厚皮甜瓜果實抵御病原菌侵染的后期發揮了重要作用。

NADK是生物體內唯一能夠催化NAD+生成NADP+的酶，該酶以ATP作為磷酰基供體催化NAD（H）反應生成NADP（H）[46]。NADK的激活可提高或維持組織中NADPH水平，以發揮NADPH在抗病中的作用[11]。本研究發現，T. roseum侵染厚皮甜瓜果實后NADK活力先急劇升高后逐步降低，但始終高于對照組。由此表明，NADK催化的NAD+轉化為NADP+在果實抗病的不同階段均發揮了作用，但詳細機制有待進一步揭示。

接種果實由于早期能量供應短缺導致病斑出現，為了彌補能量供應短缺，果實的TCA循環被激活，在一定程度上抑制了PPP[11]。接種后期由于防御反應需要大量的碳骨架，因此PPP增強，TCA循環受到了一定程度的抑制[14]。

綜上，T. roseum侵染早期能誘導厚皮甜瓜果實大幅度提高TCA循環關鍵酶MDH的活力，促進NAD和NADH的積累；侵染的后期激活了果實的PPP，增加了G6PDH和6PGDH活力以及G6P、NADH含量。由此表明，TCA循環和PPP在病原菌侵染果實的不同階段發揮作用，TCA循環更多參與了果實早期的抗病防御，而PPP在后期的寄主防御反應中發揮了更大的作用。