單核細胞增生李斯特菌菌株分型與其致病潛力基因相關性研究進展

程 穎，董慶利，劉陽泰，李紅梅，王 園,2，王 翔,*

（1.上海理工大學健康科學與工程學院，上海 200093；2.上海中僑職業技術大學食品藥品學院，上海 201514）

單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是一種兼性厭氧的革蘭氏陽性菌，是常見的食源性致病菌之一[1]。LM廣泛存在于自然界中，具有侵襲性，可使人患李斯特菌病，主要包括腦膜炎、敗血癥、流產和單核細胞增多等，尤其對孕婦、老人、小孩、新生兒和免疫力缺陷病人危害嚴重[2]。從1964年到2010年40多年間我國共報道147 例LM感染病例[3]，隨著國家食源性疾病監測網在全國開展的LM專項監測的進行，僅2011年到2017年間就報道了562 例感染病例[4]，遠高于過去40多年所報告的病例數。2014年歐盟國家共報道2 161 例由LM引起的李斯特菌病[5]；美國疾病預防控制中心調查顯示每年約有1 600多人患李斯特菌病（https://www.cdc.gov/dotw/listeria/index.html）；2017年到2018年南非發生937 例由LM引發的病例，且死亡率高達27%[6]。

LM的致病能力與其抗性和毒力有關，抗性強的菌株在不利環境條件下的存活能力強，具有相對較高的存活水平；毒力強的菌株能夠在進入宿主體內后侵襲宿主細胞，更易導致宿主患病。菌株的抗性和毒力與其攜帶的相關基因有關，抗性基因和毒力基因決定了細菌的致病潛力，統稱為致病潛力基因。LM根據不同分型方式分為多種亞型，不同亞型LM的致病潛力不同，這與其致病潛力基因的差異有關。而目前關于LM的相關研究大多采用標準菌株進行，雖有部分研究采用了分離的野生菌株進行，但是對于不同分型之間致病潛力基因的差異尚未進行系統研究。

因此，本文對LM的主要分型方式進行介紹，并對不同分型菌株與其致病潛力基因之間的關系進行總結，以期為指導食品中LM的防控及致病機制研究提供理論參考。

1 LM的分型及流行特點

LM分型方法較多，包括血清分型、進化譜系分型、多位點序列分型（multi-locus sequence typing，MLST）和克隆復合體（clonal complexes，CC）分型等（表1）[7-10]。血清型分型可應用于流行病學調查中，但會出現假陰性和假陽性[7,9]；進化譜系分型可應用于LM的遺傳進化研究中，但分辨率較低。而MLST采用分子分型技術，具有分辨率高、重復性好、可實現數據共享等優點[10]。MLST根據管家基因abcZ、bglA、cat、dapE、dat、ldh和lhkA內部400～800 bp的核苷酸序列，給每個位點序列賦予一個等位基因編號，將每一株的等位基因編號按一定順序排列就是該菌株的序列型（sequence type，ST）[11]。該方法最早由Salcedo等[11]建立，同時巴斯德實驗室為了方便比較全球不同實驗室間的數據，建立了專用于LM菌株MLST分型的在線數據庫（https://bigsdb.pasteur.fr/listeria/listeria.html），可實現MLST型及基因組等數據的共享，截至2020年7月6日，該數據庫已收錄2 036 個ST分型。當7 個管家基因中至少有6 個管家基因有相同的等位基因編號時，認為菌株屬于同一個CC型，即相同CC型可能會包含進化關系較近的不同ST分型LM[8,11]。

表1 LM的不同分型方法Table 1 Different subtyping methods for L. monocytogenes

LM菌株具有高度的異質性，根據多種分型方式可分成不同亞型。食品和臨床分離的菌株主要屬于譜系I和II，譜系I的主要血清型為1/2b和4b，譜系II的主要血清型為1/2a和1/2c，譜系III主要包含4a和4c血清型，譜系IV菌株較少[9]。1/2a在食品中分離率最高，臨床感染病例主要由1/2a、1/2b和4b血清型引起[9]。ST9、ST8和ST121主要從食品或食品加工環境中分離得到，僅有少量臨床事件與這些ST型有關[12]。在法國，CC121和CC9在食品中檢出率較高，CC1、CC2、CC4和CC6有較高的臨床流行率，且CC1和CC6與肝臟感染病例相關，CC1、CC4和CC6與大腦神經感染病例相關，而CC9和CC121與免疫力低下人群感染相關[13]。在北美洲、南美洲、歐洲、大洋洲的李斯特菌病暴發事件相關的食品、環境及臨床樣品中均未分離到ST87菌株，而ST87（CC87）在我國有較高的臨床檢出率[12,14-15]。不同分型LM在不同樣品中檢出率的差異可能與菌株致病潛力基因的異質性有關，因此在食品中LM的風險評估及其發病機制研究過程中不可忽略菌株的異質性。

2 LM主要抗性基因及分布差異

LM抗性相關基因有應激生存島（stress survival islet，SSI）-1、SSI-2和其他環境抗性基因（熱抗性、耐冷性、酸抗性、耐高滲、耐干燥、耐金屬和去污劑及調控基因），具體如表2所示。

表2 LM的抗性基因Table 2 Resistance genes of L. monocytogenes

SSI-1總長8.7 kbp，包含5 個基因簇，分別是lmo0444、lmo0445、pva、gadD和環境gadT，這些基因與LM對高濃度NaCl、高濃度膽鹽、低pH值等環境因素有耐受性有關[5,16]。其中gadD和gadT組成微生物的谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）系統，該系統對LM在低pH值環境中的存活具有重要作用[5]。LM可以利用GAD系統在酸性條件下維持細胞內pH值穩態，適應低pH值環境[5]。SSI-1主要存在于譜系I的CC3和CC5中以及譜系II的CC101、CC121、CC14、CC20、CC21、CC415和CC7中[34]。

lin0464和lin0465基因構成了SSI-2，最初被認為是英諾克李斯特氏菌（L. innocua）特有的基因，有研究發現ST121型LM中也攜帶這兩個基因，并命名為SSI-2。目前研究未在其他分型中發現該基因島[34]。該基因島有助于菌株在堿性和氧化脅迫下存活，可使其在食品加工環境中持久存在[18]，如在加工環境中ST121長期存在[32]。

2.1 與熱抗性相關的基因

不同分型的LM熱抗性不同，有研究發現LM的D57（指LM在57 ℃熱處理條件下數量降低90%所需要的時間）在6.5～26.0 min之間，這可能是熱抗性相關基因的差異造成的[33]。與LM熱抗性相關的基因包括danK、clpBELP、mcsB和ctsR等，其中clpB基因在譜系II菌株中完整，但在譜系I菌株中被破壞[22,35-36]，該基因的突變可能會導致LM熱抗性降低。

2.2 與耐冷相關的基因

LM能在冷藏溫度下生長，然而不同分型的菌株適應冷脅迫的能力是有差異的[22,37]。Hingston[23]和Junttila[38]等都發現1/2a、1/2b血清型菌株的耐冷性普遍高于血清型4b和1/2c菌株，盡管有很多類似的研究說明菌株耐冷性的異質性，但這種差異不顯著。然而，有研究表明4b血清型菌株耐冷性較低是由于缺少lmo1078基因，該基因能編碼與耐冷相關的蛋白酶——尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶[23]。因此，菌株的耐冷性與血清分型沒有直接相關性，而與其耐冷基因相關。如lisK和yycG基因能編碼組氨酸激酶，能使LM適應低溫并生長[37]。betL、gbuA/B和opuCA/B/C/D基因均與LM的冷抗性相關[20-21]。目前，不同ST型LM間冷脅迫基因的差異不是很明確，有待后續研究。

2.3 與耐高滲相關的基因

甘氨酸甜菜堿轉運蛋白I、II及肉堿轉運蛋白OpuC與LM的耐高滲環境相關，三者分別由基因betL、gbu和opuC編碼表達[39]。BetL蛋白能響應NaCl脅迫[40]，bsh和pva基因也與LM能耐受膽鹽存在的高滲環境有關[16]。菌株對NaCl、KCl和膽鹽的耐受差異與上述基因的分布差異有一定關系，但相關研究還較少，同時耐高滲基因在不同分型LM的分布也不明確，因此相關研究還仍需進一步推進。

2.4 與酸抗性基因

Hingston[23]和van der Veen[40]等研究表明4b型菌株較1/2a型有更強的酸抗性，雖然4b血清型整體有較強的酸抗性，但在4b血清型中仍檢出酸敏感菌株，同樣1/2a血清型中也存在耐酸性菌株[23]。pva基因不僅與LM耐受高滲環境有關，還與耐受酸性環境相關[16]。此外，基因ctaP與LM的酸抗性有關，有研究報道稱缺失ctaP基因的菌株膜通透性和酸敏感性增加，對宿主細胞的黏附性減弱[21]。gadD和gadT基因與酸、鹽及膽鹽的抗性有關，屬于SSI-1[16]。基于血清型不能概括LM表型變化趨勢，因此可分析耐酸基因與ST型之間的關系。

2.5 與耐干燥相關的基因

菌株的耐干燥性反映了菌株在營養物質和水都缺少的條件下在表面存活能力，不同菌株的耐干燥能力不同。雖然在不同分型之間未發現很明確的研究結果，但也觀察到一些明顯的趨勢，1/2c和1/2b血清型較耐干燥，其次是4b和1/2a血清型，其中菌株CC224、1/2b最耐干燥，菌株CC193、1/2a對干燥最敏感[23]。研究發現菌株的耐干燥性可能和其長期生存于干燥環境，從而適應干燥環境有關；菌株的耐干燥可能與鞭毛等菌株運動相關的基因有關，如flip、flhB、flgD/L、motB、fliM/Y等[23]。在干燥環境下，這類基因的表達使菌株有更強的生命力，能向可被自身利用的營養物質游動，從而在干燥環境中有更強的生命力。而不同分型菌株耐干燥能力及基因差異并未有詳盡的報道，仍有待研究。

2.6 耐金屬和殺菌劑基因

耐金屬和殺菌劑基因包括bcrABC、qacHAC、emrEC和cadA[23,27-31]。Mullapudi等研究了火雞加工廠分離得到的192 株LM對鎘、砷及苯扎氯銨（benzalkonium chloride，BC）的抗性，發現1/2a和1/2b血清型的菌株較4b型的抗性更高；同時，研究發現對鎘和砷有抗性的菌株不一定對BC具有抗性，但對BC有抗性的菌株對鎘和砷均有抗性；對鎘具有抗性的LM外排系統與轉座基因Tn5422有關[41]。BC存在條件下，LM中與運動、代謝、肽聚糖合成及磷壁酸合成相關的基因表達量均有一定的上調；與運動相關的MotA/B蛋白由motA/B基因編碼表達，該基因在BC消毒劑的作用下轉錄表達量上調，這可能是由于在BC應激作用下需通過該蛋白進行跨膜轉運外排[26]。除上述SSI外，攜帶基因bcrABC和qacHAC的LM對BC具有抗性[28-29]。基因emrC與BC的抗性也有一定關系，Hurley等發現由于該基因的存在，ST101和ST6型LM對BC具有抗性[42]。同樣，argB基因在添加乳酸鈉抑菌劑的培養液中表達量增加，說明argB基因與抗乳酸鈉作用相關，該基因能編碼乙酰谷氨酸激酶，使其在乳酸鈉存在的逆境環境下生存[43]。不同ST型對金屬和殺菌劑抗性研究較少，關系還未明確，后續可進行深入研究探索。

2.7 調控基因

SigB（σB）作為重要的調控基因，是LM生存和適應壓力所需的基因，可以調節多種抗性基因（如bcrABC、betL、SSI-1）的表達，對逆境環境下菌株的存活起重要作用[16]。除了σB調控基因外，σH、σL和σS也可以作為σB的替代基因，調控基因的表達，如σH參與了SSI-2基因的調控[19]，σS能激活熱抗性基因，實現細菌的熱抗性[32]，基因prfAB可以調控耐膽鹽基因bsh的轉錄表達[44]。調控基因與不同ST型LM的關系尚不明確，有待更進一步的探索研究。

3 LM主要毒力因子及分布差異

LM的毒力因子主要指毒力基因，從其功能角度來分類，包括黏附性基因、侵襲性基因、逃逸增殖基因、與鞭毛相關的基因等；按李斯特菌毒力基因島（Listeriapathogenicity islands，LIPI）可分為LIPI-1、LIPI-2、LIPI-3、LIPI-4。

3.1 功能毒力基因

當食用被LM污染后的食物后，細菌會通過食道進入胃部環境，由于其抗性的差異，大多細菌在胃酸作用下死亡，僅有少量存活細菌會通過小腸細胞進入人體[45-46]。LM對宿主細胞的作用主要包括黏附、侵襲與逃逸增殖，根據與不同作用的相關性，將基因進行詳細分類，具體如表3所示。

表3 LM致病性基因種類及其差異Table 3 Types of pathogenic genes in L. monocytogenes

LM對細胞黏附作用是其細胞感染的第一步。與黏附作用相關的基因主要包括lapB、ami和actA等。Painset等發現lapB基因僅在CC31菌株中缺失[34]，該基因主要在細菌黏附宿主細胞過程中起作用。Hurley等研究發現菌株CFS059缺少actA基因，該菌株在感染胚胎細胞24 h后，細胞存活率高達97%，說明該基因對細菌的致病性起顯著促進作用[42]。

LM對細胞黏附后，會在多個基因（如inlA、inlB、inlF、inlJ、inlP、vip、auto、aut、cheA和cheY等）作用下入侵宿主細胞。InlA和InlB是內化素蛋白質家族中的兩個成員，能與宿主細胞的受體結合，從而入侵宿主細胞。inlA基因會出現提前終止密碼子（premature stop codons，PMSC），有的PMSC為無義突變，并未影響其毒力[22]，而有的PMSC會使菌株的inlA基因變短，從而使其毒力降低。inlF基因在譜系I菌株中缺失，在譜系II菌株中僅CC121和CC14中含有[45]。另外，基因inlP與LM對胎盤細胞的侵襲相關，含有該基因的菌株對孕婦有專一侵襲性，可導致流產[45]。譜系I菌株中均攜帶基因vip，70%的譜系II菌株中攜帶基因vip，且在臨床菌株中出現頻率較高[32]。編碼自溶素的基因aut在所有譜系II菌株中均有發現，而僅在譜系I的CC3、CC5、CC59和CC87菌株中攜帶[34]。

當LM經黏附、侵襲作用進入細胞后，會形成吞噬泡[49]。與LM逃逸吞噬體相關的李斯特菌溶血素（listeriolysin O，LLO）、磷脂酰膽堿酶（phosphatidyl choline，PC）和膽堿磷酸水解酶（phosphatidylcholine choline phosphohydrolase，PC-PLC）分別由hly、plcA和plcB基因編碼[39,50-51]。PC和PC-PLC能降解脂類從而破壞液泡，幫助LM逃逸吞噬體[40]。當LM被釋放至宿主細胞的細胞質中時，便立即增殖，且增殖速度接近于營養豐富肉湯培養基中的增殖速度[52]。LM中磷酸己糖運輸蛋白Hpt（由基因hpt編碼表達）的合成使其能利用細胞質中的磷酸葡萄糖作為能量來源[46]。LM進入細胞質中可利用細胞質中磷酸葡萄糖作為能量來源，使人患李斯特菌病。

除上述黏附、侵襲和逃逸過程外，LM在宿主細胞間及細胞內的運動與其運動能力有關。LM的周生鞭毛能提供給細菌一定的能量，使細菌朝著營養豐富適宜生存的方向運動，促使細菌在細胞質和細胞間傳播[47]。

3.2 毒力基因島

LM的毒力基因島如表4所示。LIPI-1主要包括6 個毒力基因：prfA、plcA、hly、mpl、actA和plcB[51]。prfA作為調控基因，與LM侵襲相關基因的轉錄表達有關，當菌株prfA基因缺失或被截短，則其毒力降低[53]。對巴斯德實驗室分型數據庫中LM的序列分析，發現LIPI-1的6 個基因均發生突變（插入、缺失、轉變和顛變）。而LIPI-1基因與不同分型LM間的關系暫不明確，因此可后續深入研究。

表4 LM的毒力基因島Table 4 Four Listeria pathogenicity islands of L. monocytogenes

LIPI-2能編碼一系列內化素家族蛋白，這些蛋白與宿主細胞表面相互作用，是重要的毒力基因。這些基因最初在伊氏李斯特菌中發現，屬于李斯特氏菌專有的多基因家族，包括inlA、inlB、inlC、inlE、inlF、inlG、inlH、inlJ和inlK[51]。其中，inlA和inlB基因是LM的兩個經典主要致病基因[15]，inlC在細胞間擴散過程中發揮作用[54]。

LIPI-3由8 個基因構成，包括llsA、llsB、llsD、llsG、llsH、llsP、llsX和llsY[22]，李斯特菌溶血素S（listeriolysin S，LLS）由其編碼。基因llsX可以作為LIPI-3產生的標志，同時可通過其推斷LLS的產生[50]。目前的研究表明LIPI-3僅存在于譜系I菌株中[22]。后續可深入探索不同分型LM中LIPI-3基因的差異。

LIPI-4包括與神經及胎盤感染有關的磷酸轉移酶系統（phosphotransferase system，PTS）基因，具體包括ptsA、licC、licB、licA、glvA、Lm900558-70013[5,13]。LIPI-4主要存在于譜系I的菌株中，在譜系II、III和IV中少有發現[49]。研究表明由于PTS的存在，ST87、ST4型菌株具有高毒力，且與神經系統和胎盤感染有密切關系[5,13]。同樣，Chen Moutong等研究發現含ptsA基因的53 株菌株中多數屬于ST87型，比例高達97.78%（44/53）[52]。2010、2012—2014年和2016年我國都有孕婦因感染ST87型LM導致流產或新生兒患李斯特菌病的事件發生[46-47]。

3.3 提前終止密碼子

inlA基因是重要的致病基因。研究發現由于基因突變，inlA基因會出現PMSC，PMSC可出現在該基因上的不同位點，形成截短的inlA，Nightingale[55]和van Stelten[56]等研究發現inlA的截短形式與菌株毒力降低有關[55-56]。目前共發現20 種PMSC，具體如表5所示。有的PMSC不會影響基因的轉錄表達，如ST8型LM（3419-1LM）在1380位點G轉變為A，是最新發現的PMSC，屬于無義突變[52]；而有的PMSC會將菌株毒力降低，如ST121由于攜帶1 474位的C→T突變位點使菌株的毒力降低，因此臨床分離較少[19,55]。PMSC主要出現在譜系I和譜系II中[54-55]，在ST5、ST9、ST8和ST121型LM中均有發現。Moura等研究發現在譜系II中有24%的菌株攜帶PMSC，較譜系I（1%）的比例高[57]。同時也有研究表明食源菌株中攜帶inlAPMSC的可能性較病源菌株高[47,58]。基因inlA上PMSC的差異說明在研究LM的致病機制及進行風險評估過程中應考慮到菌株之間的異質性，需后續研究inlAPMSC與不同分型LM之間的關系。

表5 LM的inlA PMSCTable 5 Types of premature stop codons in the inlA gene of L. monocytogenes

除了在inlA上發現PMSC，在prfA、actA和inlB等基因上也發現了PMSC[29,42,53]。研究發現prfA基因突變產生PMSC導致產生截短的prfA，該基因的截短會影響并降低LM的毒力[53]。如Maury等發現在L2-SL7-ST7-CT270中由于PMSC將prfA截短而不能溶血[67]。在ST121中發現actA基因的截短使其產菌膜能力降低[29]。但目前關于PMSC與不同分型之間關系的研究甚少，有待后續進一步深入研究。

4 結 語

本文對LM的不同分型方式與抗性基因和毒力基因的相關性進行綜述，雖然暫無明確相關性結論，但仍有一些規律性結論：LM的熱抗性與clpB等基因有關，clpB在譜系II菌株中完整，而在譜系I中被截短，使得譜系II菌株熱抗性普遍較強；1/2a、1/2b菌株的耐冷性普遍高于4b菌株，這可能與4b菌株中lmo1078基因的缺失有關；同樣，4b菌株的酸抗性普遍強于1/2a菌株，1/2c、1/2b菌株的耐干燥性平均強于4b、1/2a菌株，1/2a、1/2b菌株對BC的抗性普遍強于4b型菌株，但是其相關抗性基因與不同分型之間的關系尚不明確；SSI-1主要存在譜系I和II的部分菌株中；而SSI-2僅在ST121中攜帶。LM的毒力基因inlA、prfA、actA和inlB易出現PMSC，導致菌株毒力降低；LIPI-3和LIPI-4主要出現在譜系I中。

此外，LM的分型方法較多，導致與致病潛力基因的相關性研究無法統一，因此未來可從以下幾方面進行研究：1）進行不同分型菌株的致病潛力差異的研究；2）通過不同分型致病潛力差異的研究，對其致病機制進行全面探索；3）對食品中不同分型LM進行風險評估報告；4）對不同分型LM的預警、鑒定及防控進行深入探索研究。