減菌技術在冷卻肉關鍵安全控制點抑菌分子機制的研究進展

楊 君，羅 欣，梁榮蓉，朱立賢，韓明山，楊嘯吟,*，張一敏,*

（1.山東農業(yè)大學食品科學與工程學院，山東 泰安 271018；2.國家肉牛牦牛產業(yè)技術體系通遼站，內蒙古 通遼 028100）

冷卻肉在屠宰、分割、貯藏銷售過程中極易受到單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、大腸桿菌O157:H7（Escherichia coliO157:H7）等致病菌以及假單胞菌（Pseudomonasspp.）、熱殺環(huán)絲菌（Brochothrix thermosphacta）、乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）等腐敗菌的污染[1]。為提高肉品安全性并延長其貨架期，肉類工業(yè)生產者在各個環(huán)節(jié)采用了不同的柵欄因子以協同控制微生物的生長，比較常見的有在屠宰環(huán)節(jié)中使用有機酸噴淋胴體[2]，在分割環(huán)節(jié)中利用電解水對加工接觸面和設備工具進行清洗消毒[3]，以及在貯藏銷售環(huán)節(jié)中對冷卻肉進行氣調包裝[4]等。通常情況下，采用單一的減菌措施并不足以完全殺滅微生物，而通過將各環(huán)節(jié)的殺菌措施進行科學組合，可實現對微生物的多靶位協同攻擊，從而最大限度地抑制冷卻肉中微生物的增殖。然而，目前關于各減菌技術抑菌機理的研究還相對獨立，缺乏相互之間的內在聯系，并且其中的很多分子減菌機制仍不明確，這已遠不能滿足企業(yè)實現微生物精確控制的生產需求。近年來，組學技術已逐漸成為在分子水平上闡釋不同減菌技術誘發(fā)細菌衰亡及產生應激反應機制的有力工具，這為理解減菌過程中細菌的蛋白質調控機理以及代謝通路變化提供了可能。

因此，本文以冷卻肉生產過程中的動物屠宰、胴體分割和冷卻肉貯藏銷售這3 個關鍵安全控制點為主線，針對各節(jié)點所采取的有機酸噴淋、電解水清洗和氣調包裝3 種重要柵欄因子減菌處理手段，通過總結、分析細菌胞內蛋白質和代謝物的變化水平來揭示這些減菌措施對細菌蛋白表達和代謝通路調控的影響，為全面理解上述減菌措施的減菌機制提供理論依據，并為企業(yè)科學設計配套柵欄技術提供便利，提高殺菌的針對性和有效性。

1 有機酸抑菌機理（動物屠宰環(huán)節(jié)）

在屠宰環(huán)節(jié)中，畜禽經去皮后，整個胴體完全暴露在外界環(huán)境中，此時胴體極易受皮毛污染物、腸道內容物和外界環(huán)境的污染[5]，因此應盡快采取適宜的減菌措施。有機酸胴體噴淋作為現行屠宰環(huán)節(jié)中一個非常重要的柵欄因子，其使用已得到肉類工業(yè)的廣泛認可。有研究表明，采用2%乳酸噴淋即可使肉牛胴體表面菌落總數減少1.6（lg（CFU/cm2））[2]。

目前關于有機酸抑菌機理的解釋多為有機酸以未解離的形式自由擴散進入細菌細胞內部，并在其中解離產生H+導致細胞質酸化，進而干擾細菌的DNA表達和轉錄，以及蛋白的表達，引起細菌能量失衡[6]。但鑒于微生物體內所發(fā)生的生化反應的復雜性，傳統有機酸抑菌理論并不適用于所有的微生物。經有機酸處理后，L. monocytogenes、E. coli、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）等不同細菌的蛋白質表達和代謝物合成會發(fā)生不同的變化（表1），進而細菌結構會遭到破壞或其代謝發(fā)生紊亂，以達到抑菌的效果。

表1 有機酸對不同細菌蛋白表達和代謝途徑的影響Table 1 Influence of organic acids on protein expression and metabolic pathways in different bacteria

續(xù)表1

1.1 影響細菌細胞結構相關的蛋白表達

有機酸對細菌的抑制主要體現在其對細胞膜蛋白的影響上，當參與細胞膜構建的蛋白發(fā)生改變時，會直接影響膜的完整性和通透性。Rodriguez-Moya等[7]對辛酸（15 mmol/L）處理的E. coliK12進行雙向電泳（twodimensional electrophoresis，2-DE）分析，發(fā)現與未施加辛酸的對照組相比，辛酸能夠調控運載碳水化合物進入細胞的外膜孔蛋白（outer membrane protin，Omp）F和OmpX下調表達（表1）。類似地，檸檬酸會抑制P. putida外膜孔蛋白OmpB的表達，并抑制該菌對葡萄糖的攝入，從而實現抑菌功效[11]。由此可見，一些有機酸會破壞膜上的通道蛋白使其產生孔洞，進而導致細胞內代謝物流失，并干擾細胞與外部環(huán)境的物質交換[12]。

除乳酸、乙酸、檸檬酸這些常見的有機酸外，石炭酸有時也被用于減菌處理中[13]。鞭毛作為附著在細菌外膜外側的一類運動器官，具有運動和黏附、識別環(huán)境信號等功能；然而，鞭毛的裝配和運動也會消耗細胞更多的能量[14]。研究表明，不同種類有機酸對鞭毛的調控機制并不完全相同。比如，乳酸和石炭酸分別抑制了編碼E. coliO157:H7和熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）鞭毛蛋白合成fliC和fliA基因的表達，從而抑制了這些細菌鞭毛的生物合成[15-16]。然而，Rodriguez-Moya等[7]卻發(fā)現控制E. coliK12鞭毛合成的鞭毛絲蛋白FliC在辛酸處理后表達量上調，促進了能量消耗，進而使該菌存活率降低[17]。造成上述辛酸和乳酸導致E. coli鞭毛蛋白差異表達的原因可能是不同種類的有機酸對不同菌種細菌的蛋白表達調控機制不同，因此若想全面揭示有機酸減菌技術的分子機制不能僅基于蛋白質組學的單一分析結果，還需在此基礎上對上游關聯基因的表達、轉錄、翻譯水平進行靶向分析。

1.2 干擾細菌胞內代謝相關的蛋白表達

有機酸會破壞細菌的胞內pH值（pHi）和氧化還原平衡，影響細菌中某些調控糖代謝和氨基酸代謝等供能途徑的關鍵蛋白的表達，進而干擾細菌生長所需的能量合成[18]。

研究表明，乳酸（23.6 mmol/L）和辛酸（15 mmol/L）會分別抑制L. monocytogenes和E. coliK12磷酸轉移酶系統（phosphotransferase system，PTS）中磷酸載體蛋白的表達，進而抑制糖酵解途徑中磷酸烯醇丙酮酸向丙酮酸的轉化[7,19-20]。除此之外，乳酸還會抑制L. monocytogenes磷酸甘油酸激酶的表達[19]，該酶可催化1,3-二磷酸甘油酸生成3-磷酸甘油酸和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）；而石炭酸（800 mg/L）則會下調P. putida胞內葡萄糖-6-磷酸異構酶和果糖-1,6-二磷酸酶的表達[10]。在酸處理條件下，以上調控糖酵解進程的蛋白酶出現下調表達都能有效破壞細菌增殖所需要的能量供應。有機酸還能通過下調參與三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環(huán)關鍵酶的表達對細菌能量代謝途徑產生抑制作用。研究發(fā)現辛酸（15 mmol/L）會使E. coliK12丙酮酸脫氫酶下調表達[7]，該酶可催化丙酮酸氧化脫羧成乙酰輔酶A，乙酰輔酶A是連接糖酵解與TCA循環(huán)兩大供能體系的重要節(jié)點。另外，石炭酸則會抑制P. putida中諸如異檸檬酸脫氫酶、順烏頭酸酶、延胡索酸水合酶等一系列TCA循環(huán)關鍵酶的表達[10]。一旦TCA循環(huán)途徑無法正常進行，也將對細菌的能量攝入產生不利影響，進而抑制其生長繁殖。但值得注意的是，在冷卻肉實際生產中，工業(yè)化生產目前所使用的有機酸濃度要遠低于實驗研究設計的濃度，因此，對有機酸抑菌機理的探索還應與實際生產操作相結合。

有機酸還會影響細菌DNA的合成進而影響轉錄進程[21]，然而目前關于有機酸究竟如何影響與DNA合成相關的酶的表達及其所調控的代謝通路仍不明確，亟待闡明。

1.3 有機酸誘導耐酸響應機制

值得注意的是，有機酸會激發(fā)某些細菌的誘導耐酸響應。面對酸處理，細菌通常會通過調控自身代謝途徑和蛋白表達以提高適應性來應對有機酸脅迫，這種應激調控反應會減弱有機酸的抑菌效果，因此明確細菌耐酸性的形成機制也是研究有機酸抑菌原理的重要一環(huán)[18]。

1.3.1 調控蛋白表達和代謝物合成以維持細菌內環(huán)境穩(wěn)態(tài)

谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）系統是E. coli產生誘導耐酸響應的主要耐酸機制之一[22]。經乙酸（pH 3.2）或乳酸（pH 2.56）處理后，E. coliO26:H11會利用谷氨酸脫羧酶GadA和GadB催化谷氨酸轉化為γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA），而GABA含量的增加會消耗掉細胞內多余的H+，從而維持pHi穩(wěn)定，防止細菌被有機酸殺死[8,23]。此外，采用乳酸（pH 5.0）處理或者乙酸和乳酸（pH 5.0）的協同處理都會促進L. monocytogenes中全局轉錄調控因子CodY和胞內抗氧化酶（過氧化氫酶和超氧化物歧化酶）的表達，進而清除活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），減少有機酸脅迫所帶來的細菌氧化應激反應以維持其內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[9,19]。但目前有關CodY在L. monocytogenes抗酸脅迫中的作用仍需進一步研究。

1.3.2 調控蛋白表達和代謝物合成以干擾細菌胞內代謝活動

為提高耐酸性，L. monocytogenes經乳酸（pH 5.0）處理后，具有修復蛋白質錯誤折疊功能的3 種伴侶蛋白（DnaKJ、GrpE、GroEL）表達量顯著增加，這與乳酸菌在酸脅迫下的蛋白質表達類似[19,24]。其中GroEL可以促進順烏頭酸酶的折疊，有利于TCA循環(huán)途徑的進行，并抑制了細胞凋亡[25]，但關于GroEL是如何阻止蛋白錯誤聚集并顯著提高其折疊速度的調控機制至今仍未有明確定論。He Lei等[9]利用2-DE技術發(fā)現乙酸和乳酸（pH 5.0）協同處理會促進L. monocytogenes中參與磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway，PPP）的6-磷酸葡萄糖酸內酯酶和核酮糖-5-磷酸-3-差向異構酶的表達，并且降低L-乳酸脫氫酶的表達，進而抑制了丙酮酸向乳酸的轉化，而丙酮酸的積累有利于細菌維持其胞內糖代謝途徑的進行，最終減少了有機酸對L. monocytogenes的損傷。此外，L. monocytogenes還會通過上調磷酸鹽轉乙酰酶和乙酸激酶的表達量來提高自身耐酸性[9,19]，但由這些酶介導的底物磷酸化途徑尚不清楚。

Chen Lin等[8]利用核磁共振氫譜（proton nuclear magnetic resonance，1H-NMR）代謝組學技術發(fā)現乳酸（體積分數2%、pH 2.56）酸激處理可使E. coliO26:H11胞內葡萄糖-1-磷酸和丙酮酸大量積累，從而加速了該菌的糖酵解進程；并且發(fā)現α-酮戊二酸、琥珀酸的含量也升高，這有利于TCA循環(huán)的進行，也從下游代謝物層面上驗證了上文中關于有機酸會促進某些參與糖酵解和TCA循環(huán)代謝酶的表達來提高細菌耐酸性的研究結果。另外，乙酸則會抑制E. coliK12胞內蛋氨酸的合成，并促進半胱氨酸的積累，這會對細菌產生毒害作用[26]。

針對上述誘導耐酸響應的產生機制，為提高有機酸的抑菌效果，在實際生產中可以嘗試與其他減菌技術相結合，靶向抑制這些與細菌耐酸作用相關的糖代謝或氧化應激調控酶的表達和代謝物的合成，以便降低細菌的耐酸性來更好地發(fā)揮有機酸的殺菌效果。

2 電解水抑菌機理（胴體分割環(huán)節(jié)）

冷卻肉的初始微生物污染除來自屠宰環(huán)節(jié)中的胴體污染外，分割時所用的刀具以及操作接觸面也是另一重要污染源[1]。有研究表明，肉牛屠宰線中案板上有高達5.09（lg（CFU/cm2））的細菌，每把刀具上的菌落總數也高達6.54（（lg CFU））[5]。因此，對加工工具進行嚴格的清洗和消毒尤為重要。

電解水是一種具有消毒功能的溶液，其生產是利用電化學方法，將低濃度的電解質溶液（如NaCl溶液、稀鹽酸溶液或兩者的混合溶液）在電解槽內進行電解，使其pH值、氧化還原電勢（oxidation reduction potential，ORP）、有效氯濃度（available chlorine concentration，ACC）、ROS等發(fā)生一系列變化[3]。電解水不僅制取方便、成本低廉、貯藏穩(wěn)定、廣譜高效[3]，還能夠有效降低次氯酸鈉與食品中的有機物發(fā)生反應生成含氯副產物的風險[27]。根據加工工藝、電解質和pH值的不同，可將電解水分為酸性電解水（pH 2.5～3.5）、微酸性電解水（pH 5.0～6.5）、中性電解水（pH 7～8）和堿性電解水（pH 10～13）4大類[3]。在以上電解水中，酸性和微酸性電解水的殺菌應用比較廣泛，可抑制E. coli、L. monocytogenes、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）等大多數有害微生物的生長，其中酸性電解水已被推薦成為新型食品接觸面的優(yōu)良消毒劑[3]。但酸性電解水和微酸性電解水的抑菌機理目前尚且處于探索階段，通過了解其分子水平上的抑菌機制，可為這兩種電解水在肉品工業(yè)中的應用以及新型電解質殺菌劑的開發(fā)提供理論基礎。

2.1 影響細菌細胞結構

酸性電解水的殺菌效果主要取決于HClO和ClO-在微生物細胞膜上的擴散能力。由于細菌的某些細胞壁結構和質膜的磷脂雙分子層結構使得離子化的ClO-無法穿透其細胞膜，ClO-只在細胞外起氧化作用，ClO-可先使細菌細胞壁和細胞膜出現破裂或解體，再使位于質膜的功能蛋白失活[32]。HClO則是以被動擴散的形式穿透質膜，Rahman等[3]指出這可能會抑制與細胞膜轉運功能和細胞增殖功能相關的酶的活性，從而加速細菌失活速率，進一步增強酸性電解水的殺菌效果。另外，電解水電離過程中形成的ORP也會因影響細胞膜蛋白的表達而破壞其完整性，使細胞內成分釋放，導致細菌凋亡[33]。

2.1.1 調控蛋白表達

蔡林林等[34]發(fā)現，P. fluorescens菌懸液經ACC為20、40、60 mg/L的酸性電解水處理后，菌落數均降低了7（lg（CFU/mL）），菌體膜完整性也分別降低至2.26%、1.87%、1.20%，而且該菌胞外聚合物中的總糖和蛋白含量也呈現降低趨勢，但該研究并未指出具體哪些蛋白受到了影響。V. parahaemolyticus經微酸性電解水（pH 5.5，ACC 80 mg/L）處理后，外膜孔蛋白OmpK、OmpU出現上調表達[31]，這可能是該菌為適應微酸性電解水環(huán)境而啟動的一種自我保護機制，從而有助于細胞外膜完整性的恢復。雖然與前面提到的有機酸對Omp表達的影響不一致，但以上結果均說明細胞膜的孔蛋白是有機酸和電解水發(fā)揮作用的一個重要共同靶點。

2.1.2 調控代謝物合成

電解水（ACC 4 mg/L）會抑制E. coliO157:H7脂質Iva的生物合成[29]，該化合物是合成細胞膜脂質A的前體物質，因此電解水會破壞細胞膜的通透性，進而抑制細菌生長[35]。英諾克李斯特菌（L. innocua）與L. monocytogenes在生化、血清學和形態(tài)學特性上具有高度相似性，但由于L. innocua的非致病性使其成為研究L. monocytogenes的重要替代菌種[36]。Liu Qin等[30]利用低濃度電解水（pH 3.6～4.4、ORP 910～1 014 mV、ACC 4 mg/L）對L. innocua進行處理，通過1H NMR代謝組學技術分析發(fā)現電解水處理使得該菌胞內的丙氨酸、賴氨酸、纈氨酸、脯氨酸等氨基酸含量下降。關于E. coliATCC25922的類似研究也有相似的發(fā)現[28]（表2）。由于丙氨酸和賴氨酸是肽聚糖生物合成所需乙酰胞壁酰五肽的前體物，這也側面印證了電解水會干擾細菌細胞壁的合成。另外，一定量的氨基酸是細胞維持滲透壓平衡，并防止亞細胞結構崩潰的必要條件[37]。上述氨基酸的減少意味著電解水會破壞細胞質滲透壓平衡和亞細胞結構，不利于細菌的生長繁殖。

2.2 干擾細菌胞內代謝活動

2.2.1 調控蛋白表達

Chen Taiyuan等[31]利用2-DE蛋白組學研究微酸性電解水（pH 5.5，ACC 80 mg/L）對V. parahaemolyticus的抑制作用，發(fā)現與未處理的對照組相比，電解水處理同石炭酸處理相似[10]，也會抑制細菌胞內與轉錄和翻譯調節(jié)相關的延伸因子EF-Tu的表達（表2）；另外，負責能量代謝的磷酸甘油酸激酶、腺苷酸激酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶和烯醇酶的表達量也出現了下降。其中，磷酸甘油酸激酶的表達變化與其在L. monocytogenes面對乳酸（pH 5.0）處理時的表達情況相近[19]。該酶在維持細胞能量代謝過程中起著重要作用，它能催化單磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）磷酸化成二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP），生成的ADP則會通過氧化磷酸化生成ATP來為機體供能[38]。此外，在糖酵解中3-磷酸甘油醛脫氫酶催化3-磷酸甘油醛生成1,3-二磷酸甘油酸，而烯醇酶則負責催化2-磷酸甘油酸生成磷酸烯醇丙酮酸。因此，電解水會直接干擾糖酵解途徑的進行并減少ATP的合成，從而抑制細菌的生長。

表2 電解水對不同細菌的蛋白表達和代謝調控的影響Table 2 Influence of electrolyzed water on protein expression and metabolic pathways in different bacteria

續(xù)表2

2.2.2 調控代謝物合成

參考國外機構知識庫建設的經驗和建庫技術，再加上一些課題及文獻的出謀劃策，所以國內機構知識庫的建設雖然起步比較晚，但是發(fā)展勢頭強勁。根據文獻資料可知，截至2010年5月9日，在OpenDOAR上注冊的中國大陸及港、澳、臺地區(qū)的機構庫總數為30個，而截至2018年9月該數目增加至106個。可見，8年內注冊的中國機構庫數目增長了近4倍，還不包括一些目前在建的沒有注冊的機構庫。但是，這已注冊的106個機構庫中，大陸及港、澳地區(qū)僅有45個，其中屬于高校建設的機構庫不足10個。

電解水制備過程中，次氯酸和過氧化氫的存在會促使微生物體內ROS的產生，引起DNA結構和功能的損傷，進而加速細胞壞死和凋亡[3]。L. innocua和E. coli經過電解水處理后，核苷酸生物合成所需的關鍵前體物：5-磷酸核糖以及尿嘧啶核苷酸和胞嘧啶核苷酸均出現相應減少，因此電解水通過影響細菌的核苷酸代謝來抑制其DNA復制，對細胞增殖造成了明顯不良影響。值得注意的是，電解水還會減少L. innocua和E. coli細胞內延胡索酸這種參與TCA循環(huán)的關鍵代謝物含量（表2），致使這兩種細菌的能量代謝活動紊亂。

酸性電解水不僅能抑制L. innocua和E. coli懸浮細胞和貼壁細胞的糖代謝進程，還能抑制L. innocua和E. coli懸浮細胞丙氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸等氨基酸的代謝，但其對E. coli貼壁細胞的氨基酸代謝則沒有明顯的抑制作用（表2）。另外，貼壁細胞還會促進GABA的合成以增強其耐酸性，增加琥珀酸含量來促進TCA循環(huán)途徑的正常運行[28]，因此，貼壁細胞可能正是通過調節(jié)以上代謝途徑降低了電解水對其抑菌效果。Mik?-Krajnik等[39]指出單獨使用電解水這一種柵欄因子并不足以完全滅活微生物，因此探尋電解水與其他技術的組合應用或將成為下一步研究的重點。Mansur等[40]發(fā)現微酸性電解水和體積分數0.5%延胡索酸對E. coliO157:H7、L. monocytogenes的協同抑菌作用要優(yōu)于微酸性電解水的單獨使用。這可能是由于不同柵欄因子針對細菌胞內的不同靶點從多個方向共同打破了細菌的內平衡，而在相同靶點上則發(fā)揮了它們抑菌的疊加功效，實現了柵欄交互作用。因此在噴淋胴體或清洗工具殺菌時，可將電解水與有機酸復配從而更加有效地減少細菌污染，如何實現不同種類有機酸和電解水的優(yōu)化配比值得下一步深入探究。

3 氣調包裝抑菌機理（冷卻肉貯藏銷售環(huán)節(jié)）

作為肉制品供應流通體系的重要柵欄因子，氣調包裝通常被用于冷卻肉貯藏銷售環(huán)節(jié)以減少微生物的污染。該包裝系統可影響微生物群落的演替過程并抑制優(yōu)勢腐敗菌群的生長，并有效抑制微生物的代謝活動來降低醇、醛、酮、酯等異味代謝物的生成，最終實現冷卻肉貨架期的有效延長[4]。氣調包裝中的常用氣體成分主要有O2、N2、CO2，其中CO2是氣調包裝中的關鍵抑菌氣體，可延長微生物生長的遲滯期并降低對數期的生長速率，使微生物的生長速率降低25%～30%[41]。但CO2對不同微生物的抑制效果并不相同，比如對革蘭氏陰性菌的抑制效果要大于革蘭氏陽性菌[41]。這可能是由于革蘭氏陽性菌的細胞壁更加致密，且肽聚糖含量更高[42]，所以導致細菌對CO2不敏感，也可能是CO2對兩種類型細菌蛋白表達和代謝通路的影響機制不同造成的。因此，了解氣調包裝的分子抑菌機制以及該系統下的微生物耐受機制，可為將來更好地發(fā)揮其抑菌作用提供理論指導，同時還有助于加強氣調包裝與其他減菌技術（如有機酸噴淋、電解水減菌）的聯合應用研究，以此通過設計更合理的多重減菌技術來顯著增強原有單一減菌措施的抑菌效果。

3.1 干擾細菌胞內代謝相關的蛋白表達

相較于其他優(yōu)勢腐敗菌，包裝內CO2對假單胞菌的抑制效果較為明顯[43]。研究顯示，類似于石炭酸對P. putida關鍵代謝酶的抑制作用[40]，CO2也可以抑制P. fluorescensTCA循環(huán)中異檸檬酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、順烏頭酸酶、琥珀酸脫羧酶和延胡索酸水合酶的活性，進而降低細菌對碳源的利用率，造成細菌能量代謝紊亂[44-45]。有研究發(fā)現氣調包裝（30% CO2/70% N2）會抑制莓實假單胞菌（Pseudomonasfragi）胞內負責調控DNA復制的相關酶的表達（表3），從而影響細胞的增殖；同時電子傳遞鏈復合體I中的NuoA和NuoB亞基也出現了下調表達，這會降低NADH-輔酶Q氧化還原酶的表達量，進而降低細菌的跨膜質子梯度和ATP合成能力，抑制其增殖[46]。還有研究指出30% CO2/70% N2包裝環(huán)境能夠抑制廣布肉食桿菌（Carnobacterium divergens）胞內血紅素氧化酶的表達，降低了該菌對血紅素的吸收和降解，促使C. divergens呼吸作用被抑制[47-48]。

3.2 影響細菌細胞結構相關的蛋白表達

CO2會作用于細胞膜脂質來影響細胞膜通透性，也可能會抑制某些轉運酶的表達來降低細胞吸收離子的能力[41]。Kolbeck等[47]發(fā)現70% O2/30% CO2氣調包裝下，冷生明串珠菌（Leuconostoc gelidum）細胞膜上參與錳離子和鈷離子轉運的ATP結合盒式（ATP-binding cassette，ABC）轉運蛋白表達量發(fā)生下調（表3），這破壞了該菌金屬離子跨膜轉運的動態(tài)平衡，該研究為上述理論提供了依據。然而，Wang Guangyu等[49]卻發(fā)現氣調包裝（30% CO2/70% N2）雖會增大P. fragi細胞膜的通透性，但并不能破壞其完整性，因此氣調包裝對細胞膜結構的作用靶點可能與有機酸和電解水并不相同。除此之外，該包裝體系還顯著抑制了負責調控P. fragi鞭毛（flgB、fliF、fliJ、fliO、fliP和motA）和菌毛（flimA）組裝及運動的基因表達，進而抑制了相關鞭毛結構蛋白的表達[46]。

3.3 包裝體系內的菌群拮抗作用

有些氣調包裝系統能夠誘導菌群結構朝向有利于冷卻肉貨架期延長的方向發(fā)展，例如，低氧包裝貯藏后期的優(yōu)勢菌群乳酸菌能分泌乳酸、過氧化氫和細菌素等抑菌代謝物，拮抗抑制其他細菌的生長[50-51]。然而，Nilsson等[52]卻發(fā)現某些麥芽糖C. divergens并不會產生細菌素等抑菌物質，而主要是通過競爭葡萄糖來降低L. monocytogenes的生長速率，并導致其嘌呤和嘧啶代謝被抑制。Orihuel等[53]也發(fā)現在與其他細菌共同培養(yǎng)時，E. coli生長受限并非乳酸菌分泌的乳酸或細菌素所致，更有可能緣于其他菌群的競爭性抑制；該研究還將蒙氏腸球菌（Enterococcus mundtii）和E. coliO157:H7進行共同培養(yǎng)，并對Ent. mundtii進行2-DE蛋白質組學分析，發(fā)現Ent. mundtii的磷酸烯醇丙酮酸鹽磷酸轉移酶上調表達，這加劇了該菌與E. coliO157:H7對葡萄糖的競爭。另外，與E. coliO157:H7相比，Ent. mundtii的肽酶、氨肽酶、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶和酮糖轉移酶也都表達上調，說明Ent. mundtii的肽分解代謝和糖代謝更為旺盛。綜上，Ent. mundtii會與E. coliO157:H7直接競爭營養(yǎng)物質，從而抑制E. coliO157:H7的生長。乳酸菌作為傳統的肉制品生物保護菌，以后的研究如果能在蛋白表達和代謝層面上充分闡釋其對其他菌群的抑制作用，從營養(yǎng)競爭等方面全面揭示該菌的抑菌機制，將能進一步幫助企業(yè)更好地使用乳酸菌等有益優(yōu)勢菌群作為柵欄因子以提高冷卻肉的感官品質和安全性。

3.4 細菌對氣調包裝的耐受機制

表3 氣調包裝對不同細菌的蛋白表達和代謝途徑的影響Table 3 Influence of modified atmosphere packaging on protein expression and metabolic pathways in different bacteria

3.4.1 調控蛋白表達以維持細菌內環(huán)境穩(wěn)態(tài)

通常認為CO2的抑菌效果的實現主要依賴于其溶于水后形成H2CO3，解離出H+從而降低pHi[57]。然而，高濃度CO2無氧環(huán)境會促進C. divergens和C. maltaromaticum胞內精氨酸脫亞胺酶、丙氨酸脫氫酶、酪氨酸脫氫酶的表達，催化產生氨氣和生物胺等堿性產物以維持pHi穩(wěn)定，減弱CO2的抑菌效果[47]。另外，CO2還會促進B. thermosphacta中用于降解乙醇胺所需的酶（如乙醛脫氫酶、乙醇脫氫酶、磷酸丙酰基轉移酶等）的表達來加劇乙醇胺的降解，從而導致氨氣和乙酰輔酶A的產生[47,54]。這種氨氣誘導合成途徑可能會中和B. thermosphacta胞內的H+而使pHi維持穩(wěn)定，進而減弱CO2的抑制效果，然而關于該解釋還有待進一步驗證。

Kolbeck等[47]對從牛肉糜中分離出的B. thermosphacta、Leu. gasicomitatum在密封的玻璃瓶中進行不同氣體處理（空氣、100% N2、70% O2/30%CO2、30% CO2/70% N2），通過非標記定量蛋白質組學發(fā)現不同種類細菌為適應高氧的氣體環(huán)境，均能通過調控不同酶的表達來降低氧化應激造成的損傷。比如B. thermosphacta在有氧條件下會上調對氧敏感的丙酮酸甲酸裂合酶、硫氧還蛋白和過氧化氫酶的表達，而Leu.gasicomitatum胞內硫氧還蛋白還原酶和過氧化物酶的表達量也會出現增加，這與上文提到的當L. monocytogenes面對有機酸處理時會上調與氧化應激相關酶的表達來維持細菌胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的報道[9]具有相似性（表1）。

3.4.2 調控蛋白表達和代謝物合成以維持細胞結構穩(wěn)定

在逆性生長環(huán)境下，細菌為維持細胞膜的穩(wěn)定性及正常生理功能，通常會通過改變細胞膜的脂肪酸種類和組成來調節(jié)其流動性[58]。與100% N2氣體環(huán)境相比，30%CO2/70% N2無氧條件會促進C. maltaromaticum中與細胞膜脂肪酸合成相關的關鍵酶（乙酰輔酶A羧化酶、S-丙二酰轉移酶、3-酮脂酰ACP還原酶）的表達，以使該菌在CO2環(huán)境下維持細胞結構穩(wěn)定[47]。30% CO2/70% N2氣調包裝雖然會影響P. fragi的生命活動，抑制其致腐能力，但也會促進絲氨酸的積累，進而有利于S-腺苷甲硫氨酸的合成，此代謝物屬于甲硫氨酸代謝途徑中的關鍵節(jié)點物質[59]，盡管氣調包裝對該代謝途徑的調控機理尚不清楚，但S-腺苷甲硫氨酸甲基化后可與不飽和脂肪酸結合生成環(huán)丙烷脂肪酸（cyclopropane fatty acids，CFAs）[60]，CFAs已被證實可以降低鹽酸對E. coli造成的膜損傷，對維持細胞存活起重要作用[61]，因此推測CO2也可能會誘導P. fragi通過上述途徑調節(jié)細胞膜結構來提高其對逆性環(huán)境的抗性，而相關方面的探索至今仍鮮有報道，值得深入研究。

4 3 種減菌技術的協同減菌機制

食源性致病菌和腐敗菌的生長是影響冷卻肉安全性與貨架期的關鍵因素，因此如何對二者實施全鏈條的有效控制一直是肉類企業(yè)實際生產中的迫切需求。對于有機酸胴體噴淋、電解水清洗減菌以及氣調包裝技術這3 種常用柵欄因子，除已知的傳統抑菌機制外，了解其對細菌蛋白表達和代謝物合成的分子調節(jié)機制將直接決定著未來實施這些措施的最終抑菌效果。

綜上所述，基于冷卻肉生產的屠宰、分割、貯藏銷售3 個關鍵環(huán)節(jié)的有機酸胴體噴淋、電解水清洗以及氣調包裝技術均主要通過干擾細菌的糖代謝（糖酵解和TCA循環(huán)）、氨基酸代謝進程從而抑制食源性致病菌和腐敗菌的增殖。這3 種減菌技術雖然在各個生產環(huán)節(jié)上相互獨立，但在抑菌機制上卻又互相關聯，存在共通之處。如圖1所示，有機酸和電解水會抑制磷酸甘油酸激酶的表達，進而不利于糖酵解途徑的進行[19,31]；有機酸和氣調包裝會抑制異檸檬酸脫氫酶、順烏頭酸酶、胡索酸水合酶的表達從而抑制TCA循環(huán)[10,44]；電解水和氣調包裝則對細菌纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸的分解代謝具有一定的抑制作用[10,26,44,47,54]。此外，有機酸和電解水還會調控細菌外膜孔蛋白的表達，從而造成細菌的細胞膜損傷[7,31]；而有機酸和氣調包裝會通過影響細菌鞭毛蛋白的表達來影響細菌的運動和黏附[7,46]；電解水會抑制細菌5-磷酸核糖、胞嘧啶核苷酸等代謝物的合成，而氣調包裝則會抑制細菌DNA聚合酶III、核糖核酸酶HI、脫氧核糖核酸外切酶I的表達，進而干擾細菌DNA的合成[28,46]。因此，這3 種減菌技術在冷卻肉生產的不同環(huán)節(jié)從不同的抑菌角度協同發(fā)揮抑菌作用，從而降低冷卻肉的終端污染水平。

圖1 3 種減菌措施對細菌代謝途徑的抑制作用[3,7-10,19,28-31,46-47,54]Fig. 1 Inhibitory effects of three decontamination technologies on bacterial metabolic pathways[3,7-10,19,28-31,46-47,54]

但是，某些細菌在不同的減菌處理后也能夠表現出一定的耐受性。例如，在有機酸或酸性電解水處理過程中，L. monocytogenes和E. coli等細菌為適應逆性環(huán)境會促進參與自身PPP、糖酵解、TCA循環(huán)這些代謝途徑關鍵酶的表達或代謝物的合成，而B. thermosphacta、Leu. gelidum和C. divergens會促進調控氧化應激和細胞膜脂肪酸合成相關酶的表達來維持自身細胞結構穩(wěn)定及內環(huán)境穩(wěn)態(tài)，進而減弱相應的減菌效果。因此，在應用單一減菌技術時，應充分考慮細菌的誘導性應激反應對該措施抑菌效果所產生的不利影響。而多重減菌技術的聯合應用能夠從一定程度上避免上述弊端，因此，減菌技術的選擇要結合多種柵欄因子，發(fā)揮其協同作用，通過靶向激活或抑制相關的信號通路來提高細菌對柵欄因子的敏感性，從而增強冷卻肉生產企業(yè)對有害微生物的靶向控制。

5 結 語

雖然有機酸胴體噴淋、電解水清洗減菌以及氣調包裝技術3 種減菌技術的分子機制正在逐漸完善，但目前對有機酸分子抑菌機理的研究還大多停留在致病菌的蛋白表達層面上，對其代謝層面上的抑菌機制還有待進一步探索，并且當前對有機酸抑制腐敗菌的作用機理也所知甚少。在細菌產生應激反應時，分子伴侶蛋白對調控其轉錄和細胞凋亡等復雜通路至關重要，因此可從蛋白互作圖譜入手，找尋有意義的應激網絡調控通路，從而為闡明細菌適應環(huán)境脅迫的分子機制提供研究新思路。

另外，目前關于有機酸、電解水、氣調包裝對微生物胞內蛋白和代謝物的研究仍多為實驗室體外培養(yǎng)，這可能與細菌在肉中或在屠宰場實際環(huán)境下的代謝調控存在差異，且這些實驗室研究多為在蛋白或代謝物水平上的單一分析，若將蛋白表達和代謝調控相結合，以代謝通路為載體，探尋出差異蛋白和差異代謝物所參與的共同通路，再施以轉錄組學進行上游靶向驗證，則能夠建立起一套自上而下系統的抑菌理論體系。