乳酸桿菌脂磷壁酸的結構及免疫調控功能研究進展

關曼緹，張英春,*，盧衛紅，王 傲

（1.哈爾濱工業大學化工與化學學院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.四川工大西南食品研究有限責任公司，四川 巴中 636063）

益生乳酸桿菌在宿主體內通過對營養物質的消化和吸收，傳遞信號給免疫細胞，如吞噬細胞、抗原遞呈細胞（antigen-presenting cell，APC）和T、B淋巴細胞等，對宿主免疫反應進行調節[1-2]。乳酸桿菌的黏附定植是其在宿主腸道發揮益生作用的重要前提[3]。國內外研究已證實脂磷壁酸（lipoteichoic acid，LTA）作為一類重要的黏附素，與病原菌競爭腸內黏附位點、參與細菌與宿主間的信號交流[4]。然而，敲除LTA合成的關鍵基因和特定位點可能會改變某些菌株形態，從而影響其對腸道疾病的抗炎作用。與其他研究較早的革蘭氏陽性菌LTA相比，益生乳酸桿菌LTA目前的研究工作還很少。因此深入分析其LTA的結構和生理功能，為今后預防和治療相關疾病提供新思路，也可為乳酸桿菌的營養調節提供新的線索。

1 LTA的理化性質及提取方法

磷壁酸（teichoic acid，TA）是革蘭氏陽性菌表面的特異性聚合物，根據其在細菌上的分布，可分為錨定在細胞膜上的LTA和與細胞壁肽聚糖共價結合的壁磷壁酸（wall teichoic acid，WTA）[5]。LTA最初被稱為膜磷壁酸，屬于跨細菌表面肽聚糖層的兩親性分子。絕大多數LTA的親水區由1,3-磷酸二酯鍵結合的聚磷酸甘油酯（poly-glycerol phosphate，poly-GroP）組成，GroP重復單元上的游離羥基在不同程度上被葡萄糖、半乳糖、D-丙氨酸（D-alanine，D-Ala）或N-乙酰葡萄糖胺（N-acetylglucosamine，GlcNAc）取代。LTA的疏水區是一種錨定在細胞膜上的糖脂，通常為Glc(β1-6)Glc(β1-3)二?；视?，poly-GroP鏈通過己糖殘基與糖脂共價連接[6-7]（圖1）。乳酸桿菌LTA poly-GroP上的取代基以D-Ala為主，其糖脂錨定物由三己糖基-二?；视徒M成[6]。LTA的基本生理功能有調節自溶素的活性、清除二價陽離子（如Mg2+）、貯藏磷元素、改變細胞壁的電荷性質，從而能夠影響細菌與宿主細胞之間的相互作用，此外還具有抵抗微生物、抑制腫瘤細胞生長、調節免疫、抗氧化、抗衰老等作用。目前研究表明LTA的表達有3 個階段：1）糖基轉移酶合成糖脂類錨定單元；2）糖脂錨通過膜相關蛋白轉運到細菌外；3）磷酸甘油轉移酶將poly-GroP添加到糖脂錨中[8]。

圖1 典型LTA的結構[9]Fig. 1 Structure of typical lipoteichoic acid[9]

LTA的微觀異質性（脂肪酸組成和飽和度、取代基的種類和取代程度以及親水鏈的長度）導致致病菌和乳酸桿菌LTA的結構多樣性。植物乳酸桿菌KCTC 10887BP LTA的poly-GroP鏈被葡萄糖和半乳糖取代，糖脂部分含有不飽和脂肪酸，侵襲性金黃色葡萄球菌ATCC 29213的LTA由GlcNAc修飾，糖脂上含有飽和脂肪酸，除此之外，兩者重復單元被D-Ala取代的水平相似[10]。通過基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrum，MALDI-TOF MS）檢測到不同乳酸桿菌（植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、德氏乳桿菌和沙克乳桿菌）LTA的糖脂結構由不同脂肪酸基團和鏈長構成，這表明LTA分子之間結構的差異性可使其具有不同的免疫活性[11]。

LTA的高純度和結構完整性是闡明其真正免疫活性的重要前提，從革蘭氏陽性菌細胞壁肽聚糖內部和細胞膜中分離出完整的LTA，且不包含任何雜質或雜質殘留量極低，選擇合適的方法是提高提取率的關鍵。早期研究人員使用三氯乙酸法提取LTA，三氯乙酸是一種酸性較強的溶液，通過水解磷壁酸與肽聚糖之間的共價鍵達到分離目的[12-13]。苯酚法（尤其是熱酚-水法）應用時間較長，但萃取物含有較多的蛋白質和殘余不溶物質，需利用二乙氨乙基-纖維素陰離子交換層析柱和辛基-瓊脂糖疏水層析柱進一步純化，缺點是該方法可能導致poly-GroP降解和D-Ala的含量降低，此外苯酚具有毒性，必須小心使用[14-16]。TritonX-114（TX114）是一種新型非離子去垢劑，已被證明可以從水溶性蛋白質中分離出兩親性蛋白質[17]。樂軍[18]使用2% TX114成功提取雙歧桿菌的LTA，純化后無明顯的蛋白質和核酸的污染，提取率約為45%～55%。雖然TX114法回收LTA的產量比苯酚法低，但前者提取時間短，危險性和腐蝕性小，雜質污染更低，足以彌補產量低的缺點[19-20]。此外，正丁醇法也被廣泛應用于植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和金黃色葡萄球菌等LTA的提取[21-25]。利用超聲波破碎法破壞細胞壁肽聚糖緊密連接的網狀結構，使嵌入在其中的LTA暴露出來，隨后用水飽和的正丁醇溶液萃取，即可得到LTA。該法提取的產物結構完整，純化后檢測到極少的蛋白質和內毒素。還有少數研究采用氯仿-甲醇-水提取法[26]。由此可見，需要根據不同菌株間LTA的結構和特性，對比不同提取方案對LTA結構和純度的影響，選擇最佳的提取方法。

2 LTA在乳酸桿菌的黏附和定植過程中的作用

目前已經發現乳酸桿菌表面成分，如表層蛋白（surface layer protein，SLP）、胞外多糖（exopoly saccharides，EPS）、完整肽聚糖（whole peitidoglycan，WPG）和LTA等黏附素，在細菌的黏附過程中起到一定的作用，其中國內外研究最多的是乳酸桿菌的S-層蛋白。但LTA作為乳酸桿菌外層疏水部分，介導乳酸桿菌或其他細菌與人類上皮細胞黏附的重要性已被證明。LTA通過其脂質部分與沉積在上皮細胞并結合在上皮細胞上的纖維連接蛋白受體相互作用，起到黏附分子作用，同時LTA的低等電點使菌株表面分布負電荷，賦予細菌細胞壁陰離子的性質，由此為細菌與細胞受體之間的黏附提供了基礎[27-29]。

Granato等[29]將約氏乳桿菌La1用于小鼠免疫實驗并提取和制備單克隆抗體，研究發現提取的單克隆抗體可檢測到La1表面的LTA，進一步分離純化LTA，發現其能強烈地抑制La1與Caco-2細胞之間的黏附，并呈濃度依賴性抑制，當LTA質量濃度為150 μg/mL時，抑制率大約為60%。孫進等[30]用三氯乙酸溶液處理植物乳桿菌Lp6，破壞細胞壁外露的LTA，并進行乳酸桿菌黏附大鼠小腸黏液實驗，處理后的Lp6的黏附性降低，該研究還發現黏附性在不同菌株之間具有顯著差異。杜蘭蘭等[31]利用質量分數0.25%胰蛋白酶和質量分數2%牛血清白蛋白酶分別處理類植物乳桿菌L-ZS9，處理后的L-ZS9對結腸癌HT-29細胞的黏附能力極顯著下降，初步判定其主要黏附素為表面蛋白和LTA。

為了測定LTA是否參與乳酸桿菌對上皮細胞的黏附過程，可先用堿處理乳酸桿菌表面，NaOH溶液可破壞LTA的部分酰基鏈，使其結構發生改變，若經檢測發現該菌株的黏附能力下降，說明該乳酸桿菌的主要黏附素之一就是LTA[32-33]。

3 乳酸桿菌LTA的腸道免疫調控作用

控制腸道細胞和菌群穩態的免疫調節機制的不穩定可能導致有害炎癥，甚至導致糖尿病、肥胖癥和腫瘤等，例如炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD），常見的有潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅恩?。–rohn’s disease，CD）等，這些與腸內促炎和抗炎分子的異常表達有關，導致腸道先天性免疫和適應性免疫系統失衡，炎癥的惡化可增加患結直腸癌（colorectal cancer，CRC）的風險[34]。LTA被普遍認為是革蘭氏陽性菌的主要病原相關分子模式（pathogenassociated molecular patterns，PAMPs），與各種炎癥性疾病有關，可通過多種信號通路（以核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogenacivated protein kinases，MAPKs）信號轉導通路為主）調節相關免疫細胞和生物體內促炎因子和抗炎因子之間的平衡，從而影響炎癥進程。

3.1 致病菌與乳酸桿菌的LTA對免疫調節的影響

金黃色葡萄球菌[35-38]、變形鏈球菌[32]和肺炎球菌[39]等幾種致病菌的LTA已被證明在各種細胞類型中促進促炎因子、一氧化氮（NO）或腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等的產生，從而引發膿毒癥休克、動脈粥樣硬化和癌癥等嚴重的炎癥性疾病。有研究表明，LTA參與乳酸桿菌的免疫調控和對結腸內致病菌的抑制過程，與來自致病菌的LTA相比，益生乳酸桿菌的LTA具有較弱的刺激活性。Kim等[33]采用正丁醇萃取法分別從植物乳桿菌KCTC 10887BP和金黃色葡萄球菌中提取LTA，純化后分別處理THP-1人單核細胞，研究發現金黃色葡萄球菌的LTA（aLTA）呈劑量依賴方式產生TNF-α，而植物乳桿菌LTA（pLTA）單獨作用幾乎不會誘導TNF-α的產生，同時高度純化的pLTA抑制aLTA誘導的強烈信號轉導，表現為MAPK信號通路相關的細胞外信號調節蛋白激酶1/2（extracellular signal regulated kinase，ERK1/2）、c-Jun N末端激酶1/2（c-Jun N-terminal kinases，JNK1/2）和p38 MAPK的磷酸化水平和NF-κB活性的降低，有效改善了致病菌引發的免疫反應，產生這種現象可能是兩者LTA結構不同的緣故。

3.2 乳酸桿菌LTA對腸道炎癥的調節作用

從益生乳酸桿菌分離出LTA還保留調控腸道相關疾病的能力，具有與親本菌株相似的免疫調節活性。Kim等[40]利用福氏志賀氏菌（Shigella flexneri）肽聚糖刺激THP-1細胞，通過過度激活NF-κB引發腸道炎癥，經植物乳桿菌K8的LTA預處理后，福氏志賀菌肽聚糖誘導的TNF-α和白細胞介素（interleukin，IL）-8含量明顯減少，NF-κB活化被抑制，這種效應與NOD2-RICK信號轉導密切相關，LTA通過下調核苷酸結合寡聚化結構域蛋白（nucleotide oligomerization domain-containing protein，NOD）樣受體家族中的NOD2，以及下游信號通路來增強細胞的交叉耐受力。Gao Quanxin等[41]分別設計競爭實驗、預防實驗和治療實驗，證實植物乳桿菌CICC6257的LTA有效抑制鰻弧菌（Vibrio anguillarum）對魚腸上皮細胞FIECs的黏附，其中競爭組抑制效果最顯著；鰻弧菌誘導的細胞因子是受NF-κB轉錄復合體控制的，LTA能抑制NF-κB的活化和NF-κB抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB）的降解，降低IL-8和TNF-α的水平，減輕炎癥；此外通過提高抑凋亡蛋白B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）和抑制促凋亡Bcl-2相關x蛋白（Bcl-2 associated x protein，Bax）的含量，并降低半胱天冬酶（caspase）-9和caspase-3的活性，有效地抑制細胞凋亡和壞死，其中半胱天冬酶是半胱氨酸蛋白酶的一個重要家族，在多種細胞外和細胞內凋亡刺激下起協同作用。植物乳桿菌KCTC 10887BP的LTA分別阻斷人重組rhTNF-α和病毒雙鏈RNA合成類似物poly I:C誘導IL-8的生成，減弱p38 MAPK的磷酸化以及NF-κB的活性，從而抑制HT-29細胞和IPEC-J2細胞的過度炎癥反應，減輕細胞損傷；然而用0.1 mol/L Tris-HCl和0.5 mol/L NaOH溶液分別制備重復單元缺乏D-Ala和?；溔笔У腖TA，失去了這種抑制作用，以此說明LTA的脂鏈和D-Ala對自身的活性尤為重要[42-43]。

3.3 TLRs介導的免疫作用

Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）是一類跨膜糖蛋白，由富含亮氨酸重復序列的胞外結構域、跨膜結構域和與信號傳導有關的胞內TIR同源域組成，通常在巨噬細胞、自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）以及樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）等中表達[44]。TLRs可識別PAMPs中的分子結構，進而激活MAPK或NF-κB通路的信號轉導，誘導細胞因子、趨化因子和共刺激分子的上調，因此被定義為模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs），是研究最多的PRRs家族之一[45]。其中TLR2常與其他TLR（如TLR1和TLR6）結合形成異源二聚體，因此能夠識別較廣泛的配體，包括革蘭氏陽性菌的細胞壁成分，如LTA、脂蛋白和肽聚糖等[44,46]。研究證實，LTA可被宿主腸道細胞上的TLR2識別，通過TLR2介導的信號通路抑制嚴重的炎癥反應[47-48]。

Wang Shaohua等[49]研究表明副干酪乳桿菌D3-5細胞壁成分LTA具有獨特的生物活性，通過激活C57BL/6J小鼠的TLR2-p38 MAPK信號，進一步招募和啟動下游信號級聯，促進黏蛋白（mucin 2，MUC2）mRNA的表達和提高腸內杯狀細胞質量，抑制NF-κB活化，其中MUC2是腸杯狀細胞分泌的主要黏蛋白，可阻止與年齡相關的腸道滲漏和病原菌入侵，同時檢測到炎癥標志物IL-6、IL-1β和TNF-α被抑制，但以上現象在TLR2基因敲除小鼠中被消除，證實LTA依賴于完整的TLR2信號轉導來減輕腸道炎癥。來自不同乳酸桿菌的LTA對TLR2介導的細胞因子具有差異調節作用[50]。

LTA還可特異性地與TLR2和共受體CD14結合，達到抵抗炎癥的目的。人單核細胞分化抗原CD14也是一種PRR，可作為TLR的一個適配器和共受體，以增加配體與TLR的親和力并增強它們的活性[51-52]。Kim等[53]通過實驗證明植物乳桿菌LTA可抑制金黃色葡萄球菌LTA或脂多糖（lipopolysacccharide，LPS）處理THP-1細胞后TLR2和CD14的表達。Matsuguchi等[54]通過實驗發現單獨轉染CD14的HEK293T細胞不增加NF-κB對干酪乳桿菌YIT 9029和發酵乳桿菌YIT 0159的LTAs的反應活性，然而當TLR2和CD14共轉染時，隨著LTAs的處理NF-κB被激活。還有其他報道稱，LTA的識別是通過TLR2/TLR6異源二聚體與兩個共受體CD14和CD36實現的[55]，前人已證實乳酸桿菌LTA與TLR2/TLR6和CD14相互作用發揮益生作用，但這種作用是否有CD36的參與還有待研究[56]。

4 LTA突變對乳酸桿菌的影響

為了更全面地認識乳酸桿菌LTA在調節腸道炎癥中的穩定性，還需觀察LTA突變體對菌株細胞的形態特征和生理活性的影響。例如構建鼠李糖乳桿菌GG的dltD基因敲除突變體，導致D-Ala取代基完全消失，甘油磷酸酯殘基數量減少，透射電子顯微鏡從形態學層面上觀察到突變體隔膜形成缺陷和細胞長度增加，在體外模擬胃液中的存活能力降低[57]。兩株缺乏LTA的嗜酸乳桿菌突變體表現出比野生株長兩倍的細胞形態，這可能是細胞異常分裂介導的，而且突變體菌株的生長繁殖在高濃度的錳離子作用下受到嚴重抑制，通透性或自溶性增加，導致細胞內成分的釋放[58]。相反，缺失磷酸甘油酸轉移酶基因的嗜酸乳桿菌NCK2025沒有表現出生長速率和形態缺陷，但在體外胃液和小腸液中的存活率降低[8]。這些研究強調了LTA作為乳酸桿菌細胞壁的結構成分在維持細胞形態和離子穩態中發揮的巨大作用，其詳細作用有待進一步研究。

乳酸桿菌經口服后通過腸胃道并長期定植在腸道內，提高代謝活動效率，維持本地微生物群和對腸道的免疫調節，然而敲除LTA合成關鍵基因可能會改變該菌株的這種特性。Mizuno等[59]利用基因敲除技術，獲得植物乳桿菌CRL1506的dltD敲除株，經Western Blot法證實，與野生型相比，突變株中LTA的含量降低，用TLR3激動劑poly I:C注射預先口服突變株的BALB/c小鼠腹腔，檢測發現干擾素-β（interferon-β，IFN-β）水平提高，但對小鼠腸內IL-10和促炎介質TNF-α、IL-6和IL-15的表達沒有作用，并失去抑制了腸黏膜上皮內淋巴細胞（CD3+、NK1.1+、CD8αα+）激活的能力，表明在TLR3介導的腸道炎癥中，LTA可能是植物乳桿菌CRL1506產生抗炎作用的關鍵分子。Lee等[60]證實干酪乳桿菌BL23在葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS）誘導的小鼠結腸炎模型中發揮了良好的作用，喂食野生株保持了小鼠正常體質量，此過程伴隨著腹瀉、直腸出血以及腸道壞死和病變的改善，以及疾病活動指數（disease activity index，DAI）降低，與之相比，dltD突變株不能抑制DSS誘導的組織損傷，使小鼠恢復到與健康動物相似的水平。

與上述結論相反，有學者提出，缺乏LTA的乳酸桿菌其調節炎癥的能力增加。Khazaie等[61]通過敲除嗜酸乳桿菌NCK2025上合成LTA的磷酸甘油酸轉移酶基因，建立小鼠結腸息肉病模型，口服突變株使小鼠回腸末端和結腸的息肉數量明顯減少，并且下調了DCs中IL-10、IL-12和TNF-α的水平，改善調節性T細胞（regulatory cell，Treg）保護功能，這些與小鼠結腸炎癥的減輕現象一致。Claes等[56]用野生型鼠李糖乳桿菌GG與TLR2/6（非單獨的TLR2）相互作用，可使HEK293T細胞內的NF-κB呈濃度依賴性激活，而dltD突變體在HEK293T細胞內激活TLR2/6依賴性NF-κB信號的能力降低，同時減弱了對IL-8 mRNA的誘導能力，說明dltD突變體的促炎能力顯著降低，對宿主細胞負面損傷減少，甚至增強了抗炎和上皮修復活性。在這些研究基礎上引出了一個重要的問題：為什么不同乳酸桿菌LTA突變體會對其炎癥能力調節產生不同的影響。由于LTA突變具有多效性效應，單獨考慮LTA的突變并不能解釋這一現象，還需要結合菌株SLP、DNA和EPS等活性成分共同分析。

5 結 語

綜上所述，LTA作為革蘭氏陽性菌表面分子與多種生物學效應有關，過去人們對金黃色葡萄球菌、糞腸球菌和變形鏈球菌等的LTA在致病菌方面的研究頗多，近年來乳酸桿菌LTA的抗腫瘤、抑制動脈粥樣硬化形成和治療炎癥性腸病等方面的作用已得到證實，相關的體內外研究結果層出不窮。對乳酸桿菌LTA的關鍵基因進行合理敲除或者改變LTA的結構，在不影響菌體本身形態和耐受能力的前提下提高其抗炎能力，是如今需要重視的熱點問題。值得注意的是，乳酸桿菌LTA在病毒感染或病毒模式識別受體介導炎癥中的潛在有益作用鮮有深入探討。探究乳酸桿菌LTA的免疫調節機制，開發功能性更強的乳酸桿菌發酵食品，對于人類疾病防治具有重大指導意義。