助陽補肺除痹顆粒藥效學實驗研究

胡少丹，仕 麗，王 旭

（長春中醫藥大學附屬醫院，長春 130021）

間質性肺疾病（ILD）是一類主要累及肺間質與肺泡腔，導致肺泡毛細血管功能單位喪失的彌漫性肺疾病[1]，病變位置包括肺泡壁、細支氣管等組織，繼續發展最終會產生肺間質纖維化、蜂窩肺等不可逆病理改變[2]。臨床表現主要有呼吸困難（呈進行性加重）、低氧血癥、限制性通氣功能障礙、彌散功能減低以及雙肺彌漫性病變等[3]。王檀認為間質性肺疾病屬于中醫“肺痹”范疇，并根據多年教學及臨床經驗，創立助陽補肺湯治療間質性肺疾病，效果顯著[4-5]。助陽補肺除痹顆粒（長春中醫藥大學附屬醫院制劑中心制）是在陽和湯的基礎上進行加減，主要成分包括鹿茸、熟地黃、當歸、干姜、肉桂、補骨脂、人參、白術、茯苓、桃仁、紅花、炙麻黃、炙甘草等，可益精助陽，除濕通痹，臨床用于脾腎陽虛、濕滯痹阻所致的肺痹。本研究通過評價助陽補肺除痹顆粒抗炎、止咳及非特異性免疫功能等方面的作用，以期為臨床合理用藥提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 動 物 SPF 級KM 小 鼠（18～20 g）、SPF 級ICR 小鼠、清潔級Wistar 大鼠（180～220 g）雌雄各半，購自遼寧長生生物技術有限公司，動物合格證號：SCXK（遼）2015-0001；普通級豚鼠（250～350 g），雌雄各半，購自長春生物制品研究所有限責任公司，動物合格證號：SCXK（吉）2016-0008。

1.2 藥品與試劑 助陽補肺除痹顆粒（規格：每袋10 g，人用量：每次10 g，每日3 次，由長春中醫藥大學附屬醫院制劑中心提供，生產批號：20170201），醋酸潑尼松片（浙江仙琚制藥股份有限公司，批號：1504132），伊文斯蘭（上海楷洋生物技術有限公司，批號：S0039），氯化鈉（分析純，北京化工廠，批號：2017-01-09），乙酸（冰醋酸）（分析純，西隴化工股份有限公司，批號：1607131），注射用青霉素鈉（華北制藥股份有限公司，批號：E0913420），乙醚（分析純，北京化工廠，批號：20161206），聚維酮碘溶液（吉林省明星醫用消毒藥械廠，批號：161023），消炎止咳片（吉林敖東集團大連藥業股份有限公司，批號：170306），檸檬酸（分析純，北京化工廠，批號：20160322），氨水（分析純，西隴化工股份有限公司，批號：1606161）。

1.3 儀器 紫外/可見分光光度計（型號：Lambda 25，美國Perkin Elmer 公司），賀利氏（Heraeus）臺式離心機Stratos（型號：Biofuge Stratos，德國賀利氏公司），電子天平（型號：YP1201N，上海舜宇恒平科學儀器有限公司），電子天平（型號：JY2002，上海舜宇恒平科學儀器有限公司），SQP313 型（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司），YLS-8A 多功能誘咳引喘儀（山東省醫學科學院設備站）。

2 方法

2.1 抗炎實驗

2.1.1 助陽補肺除痹顆粒對小鼠腹腔注射醋酸（HAc）所致腹腔毛細血管通透性的影響[6-8]取KM 小鼠50只，按體質量隨機分為5組，依次為對照組、陽性對照藥醋酸潑尼松（強的松）（10 mg·kg-1·d-1）組（給藥劑量相當于臨床每天使用量的2 倍）、助陽補肺除痹顆粒高、中、低劑量3組（18.84，9.42，4.71 g·kg-1·d-1），每組10 只。先預防性給藥7 d，在末次給藥后1 h，給各組小鼠均按0.5%伊文思藍生理鹽水溶液0.1 mL/10 g體質量行靜脈注射，每只給予腹腔注射0.6% Hac 溶液0.2 mL，于20 min 后處死小鼠，打開腹腔，以2 mL 注射器分3 次各抽取2 mL 生理鹽水沖洗腹腔，吸出沖洗液。合并3 次沖洗液后加入生理鹽水至10 mL。3 000 rpm離心15 min 后取上清液于590 nm 波長比色測定吸光度（OD值）。結果以均數±標準差（）表示，采用組間t檢驗統計數據。

2.1.2 助陽補肺除痹顆粒對大鼠棉球肉芽腫形成的影響[9-10]選用Wistar 大鼠50 只，清潔級，按體質量隨機分為5組，依次為對照組、陽性對照藥醋酸潑尼松（強的松）5 mg·kg-1·d-1組（約臨床用藥量的2 倍）、助陽補肺除痹顆粒設高劑量（9.28 g·kg-1·d-1）、中劑量（4.64 g·kg-1·d-1）和低劑量（2.32 g·kg-1·d-1）3 個給藥劑量組，每組10 只。以15 mL·kg-1體質量給藥，對照組給予同體積蒸餾水以便對照。

實驗第1天，將各組大鼠在乙醚麻醉下胸部剔毛，用碘酒消毒后，于前胸正中開小口，約1 cm 長，取滅菌棉球2 個（每個棉球質量20 mg，高壓滅菌，經濃度為10 mg·mL-1青霉素溶液浸透，烘干處理）分別植入皮下兩側腋窩處，縫合切口。

實驗第2 天，按劑量將各組大鼠灌胃給藥，連續給藥7 d。于第8 天給藥1 h 后處死大鼠，取出棉球及周圍結締組織，剔除周圍脂肪，即得棉球肉芽腫。以電子天平獲得其重量，除去棉球重量則獲得肉芽腫濕重。將棉球肉芽腫在室溫下放置24 h 后自然晾干，再以電子天平獲得其重量，除去棉球重量則獲得肉芽腫干重。以均數±標準差（）表示各組數據結果，用t檢驗統計組間差異的顯著性檢驗。

2.1.3 助陽補肺除痹顆粒對博來霉素所致肺纖維化大鼠模型肺組織的影響[11]SPF 級Wistar 大鼠，按體質量隨機分為6組，每組10 只。分別為假手術組，模型組，陽性對照藥醋酸潑尼松（5 mg·kg-1·d-1）組，助陽通痹顆粒設高劑量（9.28 g·kg-1·d-1）、中劑量（4.64 g·kg-1·d-1）和低劑量（2.32 g·kg-1·d-1）3 個給藥劑量組（以下簡稱中藥高/中/低劑量組）。給藥體積為15 mL·kg-1體質量，假手術組及模型組給予同體積蒸餾水。

以博來霉素誘導肺纖維化，建模后第2 天起各藥物干預組大鼠分別灌胃給藥，每日1 次。假手術組和肺纖維化模型組灌胃給予等體積蒸餾水。分別于造模后第7 天、第14 天和第28 天3 個時間點每組隨機選取大鼠，剖取左側肺組織標本交病理研究室進行蘇木精-伊紅（HE）染色和Masson 三色染色做肺病理組織學檢測。

2.2 止咳實驗

2.2.1 助陽補肺除痹顆粒止咳試驗（豚鼠枸櫞酸噴霧引咳法）[12]選取50 只普通級豚鼠，雌雄各半，隨機分為5組，分別為對照組、陽性對照藥消炎止咳片（0.3 g·kg-1·d-1）組（相當于臨床用藥的2 倍）、助陽補肺除痹顆粒設高劑量（7.38 g·kg-1·d-1）、中劑量（3.69 g·kg-1·d-1）和低劑量（1.85 g·kg-1·d-1）3個給藥劑量組（相當于臨床用藥的4 倍、2 倍和1 倍），每組10 只。先預防性灌胃給藥7 d。末次給藥后1 h，將實驗豚鼠分別放置于YLS-8A 多功能誘咳引喘儀箱體內，噴霧17.5%枸櫞酸溶液1 min 引咳，觀察和記錄豚鼠的咳嗽潛伏期（s）（從開始噴霧到豚鼠發出咳嗽聲的時間），以及在5 min 內的咳嗽次數（以聽到豚鼠洪亮的咳嗽聲計算）。結果以均數±標準差（）表示，采用組間t檢驗統計。

2.2.2 助陽補肺除痹顆粒止咳試驗（小鼠氨水引咳法）[13]將50 只SPF 級ICR 小鼠隨機分為5組，分別為對照組，陽性對照藥消炎止咳片0.76 g·kg-1·d-1組（相當于臨床用藥的2 倍），助陽補肺除痹顆粒設高劑量（18.84 g·kg-1·d-1）、中劑量（9.42 g·kg-1·d-1）和低劑量（4.71 g·kg-1·d-1）3個給藥劑量組（相當于臨床用藥的4 倍、2 倍和1 倍），每組10 只。預防性給藥7 d，每天灌胃給藥1 次，于末次給藥后1 h，分別將小鼠放入YLS-8A 多功能誘咳引喘儀箱體內，噴霧25%氫氧化氨溶液5 s 刺激引咳，觀察并記錄實驗小鼠的咳嗽潛伏期（s），以及2 min內的咳嗽次數（以觀察到小鼠劇烈收縮腹肌并張嘴為小鼠咳嗽的判斷指征）。結果以均數±標準差（）表示，以組間t檢驗處理數據。

2.3 統計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行統計分析，數據以均數±標準差（）表示，多組數據進行單因素方差分析（One-way ANOVE），方差齊性時用最小顯著性差異法（LSD）檢驗，方差不齊性時用Tamhane’s T2法檢驗，P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 助陽補肺除痹顆粒抗炎作用

3.1.1 助陽補肺除痹顆粒對小鼠腹腔注射醋酸（HAc）所致腹腔毛細血管通透性的影響 實驗結果表明，陽性對照（醋酸潑尼松）組與助陽補肺除痹顆粒高劑量組（18.84 g·kg-1·d-1）、中劑量組（9.42 g·kg-1·d-1）動物腹腔滲出液明顯低于對照組（P＜0.01）；助陽補肺除痹顆粒低劑量組（4.71 g·kg-1·d-1）動物腹腔滲出液與對照組比較也顯著性降低（P＜0.05），說明助陽補肺除痹顆粒可顯著拮抗醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性增高，改善急性炎癥。見圖1。

圖1 助陽補肺除痹顆粒對小鼠腹腔注射醋酸（HAc）所致腹腔毛細血管通透性的影響

3.1.2 助陽補肺除痹顆粒對大鼠棉球肉芽腫形成的影響 實驗結果表明，助陽補肺除痹顆粒高劑量組（9.28 g·kg-1·d-1）動物肉芽腫濕重和干重均明顯低于對照組（P＜0.01）；陽性對照（醋酸潑尼松）組、助陽補肺除痹顆粒中劑量組（4.64 g·kg-1·d-1）和低劑量組（2.32 g·kg-1·d-1）動物肉芽腫濕重和干重也明顯低于對照組（P＜0.05）。說明助陽補肺除痹顆粒對慢性炎癥反應過程中的內芽組織增生具有很好的抑制作用。見表1。

表1 助陽補肺除痹顆粒對大鼠棉球肉芽腫形成的影響（） g

表1 助陽補肺除痹顆粒對大鼠棉球肉芽腫形成的影響（） g

注：與對照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

3.1.3 助陽補肺除痹顆粒對博來霉素所致肺纖維化大鼠模型肺組織的影響 如圖2，基于造模7 d、14 d、28 d 的大鼠肺組織病理，假手術組肺組織形態正常，結構清晰，偶有局部肺泡壁增厚，炎癥細胞增生程度輕。模型組大鼠肺組織肺泡結構破壞已難以分辨，以大量炎癥細胞及成纖維細胞浸潤為主，肺纖維化改變明顯。陽性對照組大鼠肺泡間隔增寬，以炎癥細胞及成纖維細胞浸潤為主，間有成纖維細胞增加，與模型組比較程度減少。中藥組大鼠肺組織結構較為清晰，與模型組相比，中劑量（4.64 g·kg-1·d-1）和低劑量（2.32 g·kg-1·d-1）組的肺泡炎癥和纖維化程度在不同程度上均有所減輕，高劑量（9.28 g·kg-1·d-1）組效果尤為顯著。

圖2 造模7 d、14 d、28 d 時觀察各組大鼠肺組織病理學改變

3.2 助陽補肺除痹顆粒止咳作用

3.2.1 助陽補肺除痹顆粒止咳試驗 本實驗中，助陽補肺除痹顆粒各給藥劑量組和陽性對照組動物的咳嗽潛伏期均較對照組明顯延長（P＜0.05，P＜0.01），咳嗽次數均較對照組明顯減少（P＜0.05，P＜0.01）。實驗結果表明，助陽補肺除痹顆粒對枸櫞酸誘發的豚鼠咳嗽具有明顯的抑制作用。其機制可能是通過相關的化學感受器發揮作用，抑制支氣管黏膜對刺激的反應性而發揮出外周性鎮咳作用。見表2。

表2 助陽補肺除痹顆粒對豚鼠枸櫞酸噴霧引咳的影響（）

表2 助陽補肺除痹顆粒對豚鼠枸櫞酸噴霧引咳的影響（）

注：與對照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

3.2.2 助陽補肺除痹顆粒止咳試驗 實驗結果表明，助陽補肺除痹顆粒高劑量（18.84 g·kg-1·d-1）組、中劑量（9.42 g·kg-1·d-1）組、低劑量（4.71 g·kg-1·d-1）組3 個給藥劑量組和陽性對照藥組（0.76 g·kg-1·d-1）動物的咳嗽出現的潛伏期均較對照組明顯延長，且咳嗽次數明顯減少（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。說明助陽補肺除痹顆粒可明顯抑制氨水刺激引發的咳嗽，具有明顯的止咳作用。見表3。

表3 助陽補肺除痹顆粒對小鼠氨水引咳的影響（）

表3 助陽補肺除痹顆粒對小鼠氨水引咳的影響（）

注：與對照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01，### P ＜0.001

4 討論

炎癥是活體組織對內外環境有害刺激所產生的一種復雜生理、病理的防御反應。早期炎癥因炎癥介質刺激，血管擴張，血管內皮細胞間隙增寬，血管壁通透性提高，炎癥局部組織血管內的液體和細胞成分通過血管壁進入組織間質、體腔和黏膜表面，造成組織腫脹。因此，炎性滲出是急性炎癥早期的重要指標。本試驗通過冰醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性增高動物模型，證實助陽補肺除痹顆粒可顯著拮抗醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性增高，改善急性炎癥。

慢性炎癥增殖期是以組織變性和纖維化為特征。滅菌棉球是機體的物理性致炎因子，埋入大鼠局部皮下，刺激局部組織細胞分裂增殖，可導致與臨床某些炎癥后期病理變化相似的肉芽增生，模擬慢性炎癥的發生[14]。本試驗采用大鼠腋部皮下植入棉球肉芽腫試驗觀察，評價了助陽補肺除痹顆粒對炎癥晚期肉芽組織增生的抑制作用。

鎮咳藥的藥理作用機制主要分為中樞性和外周性兩類。枸櫞酸誘發的豚鼠咳嗽反應通過C 纖維釋放遞質引起咳嗽反射和支氣管收縮反應，可歸類為外周性咳嗽模型[15]。本試驗采用枸櫞酸溶液噴霧引咳法，刺激豚鼠呼吸道黏膜感受器，反射性引起咳嗽，證實助陽補肺除痹顆粒對枸櫞酸誘發的豚鼠咳嗽具有明顯的抑制作用。其機制可能是通過相關的化學感受器發揮作用，對支氣管黏膜對刺激的反應性起到抑制作用而發揮出外周性鎮咳作用。

動物吸入濃氨水后，因刺激性臭味強烈可刺激呼吸道黏膜而誘發咳嗽。本試驗采用濃氨水噴霧法使小鼠吸入氨水氣霧后，刺激呼吸道黏膜感受器，反射性引起咳嗽。以此方法觀察、評價了助陽補肺除痹顆粒的止咳作用。

綜上所述，助陽補肺除痹顆粒有抗炎、止咳作用，具有良好的開發和應用前景。本研究結果為助陽補肺除痹顆粒的臨床應用提供了實驗依據，作用機制方面還有待進一步探討。