治療扁平疣的臨床驗方DSH-001對小鼠免疫功能的影響*

范蘊隆 姚譞 邵文遠 張艷紅* 路鈞鑭 唐英

上海中藥制藥技術有限公司，上海 201203

扁平疣(Verruca plana)是由人乳頭瘤狀病毒(HPV)引起的良性贅生物，是人體免疫低下狀態(tài)下的常見皮膚病。它具有一定傳染性，其病期長，發(fā)病率高，且難以根治，對患者的身心健康與日常生活影響頗大[1-2]。目前臨床治療扁平疣的技術方法眾多，如化學腐蝕劑、廣譜抗病毒劑等局部藥物治療法、激光療法、冷凍液氮療法等，具備一定的治療效果，但副作用普遍較大，患者依從性較低[3]。本文擬圍繞臨床驗方DSH-001，進行對小鼠免疫功能的考察實驗，評價其調節(jié)機體免疫系統(tǒng)的功效。

1 材 料

1.1實驗試劑 環(huán)磷酰胺(南京博碩生物科技有限公司)，印度墨汁(南京森貝伽生物科技有限公司)，酞丁安(北京協(xié)和藥廠，國藥準字H11022281)，脫毛膏(加拿大奈爾Nair公司男士專用脫毛膏)，抗小鼠CD3APC、CD4FITC、CD8a PE抗體，(Ebioscience公司)，小鼠細胞因子趨化因子磁珠試劑盒(美國Millipore公司)。

臨床驗方DSH-001(圖中均以DSH-001表示)：批號：20151220，規(guī)格：磚紅色粉末，江蘇丹晟生物科技有限公司提供。

1.2實驗儀器 電子天平(賽多利斯有限公司)；酶標儀(ThermoScientific Multiskan GO)；流式細胞儀(美國BD公司，C6)；多功能液相芯片檢測分析平臺(美國Millipore公司，Luminex 100)。

1.3實驗動物 ICR小鼠，體重18-22g，雄性，由揚州大學比較醫(yī)學院提供，合格證號：NO.201602715，許可證號碼：SCXK(蘇)2012-0004。

2 實驗方法

2.1制劑配制與實驗分組 臨床驗方DSH-001粉末溶解于75%乙醇中，并稀釋至一定濃度，外用涂抹給藥，每只動物涂抹10μl；陽性藥酞丁安給藥濃度0.1g/10g，每只動物涂抹膏體約1厘米。ICR雄性小鼠隨機分為6組，每組10只分別為：空白對照組、環(huán)磷酰胺模型組(80mg/kg)、酞丁安組(0.1g/10g)、驗方DSH-001制劑(2.5mg/ml)、驗方DSH-001制劑(5mg/ml)、驗方DSH-001制劑(10mg/ml)。

2.2動物模型構建與給藥 小鼠分別于第一天進行稱重，隨機分組，并進行腹部脫毛處理，用脫毛膏對小鼠腹部進行脫毛處理，脫毛面積為2×2cm。60只ICR小鼠被隨機分成6組。臨床驗方DSH-001制劑高、中、低劑量組分別按照相應劑量每日腹部涂抹給藥，即劑量分別為10mg/ml、5mg/ml和2.5mg/ml，每只10 μl進行涂抹，給藥7天。而對照組和Cy模型組采用等體積0.9%氯化鈉溶液每天同樣腹部涂抹，連續(xù)7天，每天1次。除對照組外，其余各組第6、7、8天每日腹腔注射Cy 80 mg/kg造模，對照組腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液。

2.3碳粒廓清試驗 小鼠末次給藥后，即實驗第9天，進行稱重。印度墨汁稀釋至0.1ml/10g后自小鼠尾靜脈注射，立即計時，分別于注射后 2 min(t1) 和 10min(t2)眼球后靜脈取血30μl，記錄時間，將血加入到盛有2ml 0.1% Na2CO3的試管中，搖勻。在675nm(600nm)波長比色，測定光密度OD值(以下分別用OD1和OD2來表示2min和10min所取血樣的光密度)用1%溶液做空白對照。斷頸處死小白鼠，取肝、脾臟稱重。

按以下公式計算碳廓清指數K和吞噬指數a，評價各組小鼠巨噬細胞吞噬功能。

K=(lgOD1-lgOD2)/(t2-t1)

a= 體重×K1/3/(肝重+脾重)

注:k ：廓清指數；a：吞噬指數；t2：給墨汁后第二次取血的時間；t1：給墨汁后第一次取血的時間；OD1：t1時的光密度值；OD2：t2時的光密度值。

所得實驗數據進行歸一化處理，應用GraphPad Prism5軟件對實驗數據進行單因素方差分析，P<0.05 表示有顯著性差異。

2.4免疫器官臟器指數、T細胞檢測、外周血清細胞因子檢測

小鼠末次給藥后，即實驗第9天，進行稱重。眼眶取血致死，取小鼠肝臟和脾臟。

免疫器官臟器指數：各組動物的肝臟、脾臟進行稱重，計算臟器指數。計算公式如下，臟器指數臟器指數( mg/g) = 10*器官重量 /小鼠體重。

T細胞檢測：取小鼠腋下和頸部淋巴結，分離制備淋巴細胞單懸液并計數。取各組適量細胞懸液，避光條件下分別加入抗小鼠CD3APC抗體2μl、CD4FITC抗體0.5μl、CD8a PE抗體1μl，混勻后避光常溫孵育15min。洗去多余抗體，重懸混勻細胞，4℃避光1h內上流式細胞儀進行檢測。

外周血清細胞因子檢測：小鼠眼眶取血，室溫靜置4小時，1000xg離心10min，取上層血清。按照小鼠細胞因子趨化因子磁珠試劑盒說明書進行操作，通過Luminex 100多功能液相芯片檢測分析平臺檢測小鼠外周血清細胞因子。

數據統(tǒng)計：T淋巴細胞亞群利用FlowJob 7.6.1軟件進行分析，血清細胞因子利用luminex分析軟件進行定量分析，所得實驗數據進行歸一化處理，應用GraphPad Prism5軟件對數據進行單因素方差分析，P<0.05 表示有顯著性差異。

3 實驗結果

3.1巨噬細胞吞噬功能變化

環(huán)磷酰胺是一種典型的免疫抑制劑，能夠顯著破環(huán)脾臟、胸腺與骨髓功能，是構造免疫抑制模型的理想藥物[4]。碳廓清法是一種觀察免疫功能的經典方法，通過計算由靜脈注射的印度墨汁在體內的吞噬清除率，評價巨噬細胞吞噬功能的強弱[5]。碳廓清實驗結果顯示，80mg/kg的環(huán)磷酰胺作用下的小鼠，吞噬指數相比空白對照組出現(xiàn)顯著下降(**P<0.01)，酞丁安則極顯著地改善這一抑制作用。臨床驗方DSH-001在不同濃度下均反映出對抗環(huán)磷酰胺免疫抑制的功能，其中5mg/kg和10mg/kg給藥組的巨噬細胞吞噬功能顯著高于模型組(*P<0.05)，說明臨床驗方DSH-001制劑具有修復巨噬細胞吞噬功能，保護機體非特異性免疫功能的作用。

3.2免疫器官臟器指數變化

實驗顯示，環(huán)磷酰胺組(80mg/kg)中，小鼠肝指數(*P<0.01)和脾臟指數(*P<0.05)出現(xiàn)顯著下降，說明環(huán)磷酰胺會造成肝臟和脾臟的萎縮，降低機體免疫功能。酞丁安對這一免疫抑制過程呈現(xiàn)了極顯著的對抗作用，而臨床驗方DSH-001制劑對于也呈現(xiàn)出濃度依賴性的緩解，尤其在10mg/kg的情況下，肝臟臟器指數顯著高于模型組。環(huán)磷酰胺所致的脾臟萎縮損傷經DSH-001驗方制劑或酞丁安治療均有一定改善，但不顯著。以上結果證明，驗方制劑DSH-001對機體免疫功能的保護作用。

3.3外周血清細胞因子水平變化

利用luminex液相芯片檢測技術，對各組外周血清細胞因子水平的檢測結果如下圖所示，環(huán)磷酰胺對IL-4、IFN-γ、IL-12、TNF-α、、IL-10在外周血清中的分泌表達沒有顯著性影響，而DSH-001驗方制劑對它們也沒有調控作用(圖1A)。酞丁安對IL-6的分泌水平沒有顯著影響，但是臨床驗方DSH-001制劑從2.5mg/ml濃度下就能夠顯著性促進IL-6的分泌(**P<0.01)，且5mg/ml濃度下促進達到最高(***P<0.001)，然而10mg/ml的促進程度明顯下降，但仍然呈現(xiàn)顯著性促進效應(圖1B)。此外，環(huán)磷酰胺顯著性抑制CXCL-1(趨化因子-1)的分泌(*P<0.01)，而臨床驗方DSH-001制劑在2.5mg/ml下能夠顯著改善環(huán)磷酰胺對該細胞因子分泌的抑制作用(*P<0.01)(圖1C)。模型組和各給藥組中G-CSF(粒細胞集落刺激因子)的含量均得到一定程度的提高，但與空白組無顯著差異，推測DSH-001驗方對該細胞因子的分泌可能具有調控作用，但不顯著(圖1D)。以上結果提示，DSH-001驗方制劑的調節(jié)免疫作用機理可能與促進IL-6和CXCL-1的分泌相關。

圖1 各個制劑對免疫抑制動物細胞因子分泌的影響

(1)八個細胞因子的血清分泌情況；(B)IL-6的分泌情況；(C)CXCL-1的分泌情況；(D) G-CSF的分泌情況。

3.4T細胞亞群比例變化

通過對T淋巴細胞亞群數量變化的分析結果顯示，環(huán)磷酰胺能夠顯著抑制T細胞的形成與分化，降低T細胞數量以及Th細胞亞群比例，陽性藥對這一情況沒有明顯的改善作用。制劑組中T細胞呈現(xiàn)劑量依賴性地增加，且T細胞中，CD3、CD4雙陽性的Th細胞亞群比例明顯升高，說明DSH-001驗方能夠通過恢復機體T細胞的數目，有效緩解免疫抑制狀態(tài)。

4 討 論

扁平疣的治療手法上，西醫(yī)中并沒有特效藥物，且部分藥物造價昂貴，存在一定不良反應與禁忌癥；而像激光療法這樣的直接療法，操作簡單，療效直觀，但難以根治容易復發(fā)。中醫(yī)認為扁平疣，古稱扁瘊，病位在肝膽，常因風熱毒邪阻塞氣血運行導致血瘀阻滯，肌膚失養(yǎng)而成，因此治療上以疏肝理氣、疏風散熱、涼血解毒、軟堅散結等法進行立方治療[6]。

驗方DSH-001由丹參和苦參組成，在臨床治療扁平疣上具有顯著的療效，其中丹參能夠涼血活血，祛瘀消癰，通經止痛；苦參能夠清熱燥濕，殺蟲利尿[7-8]。根據已有丹參、苦參的藥理作用研究，以及扁平疣的病理特征，推測驗方DSH-001能發(fā)揮藥物的協(xié)同治療作用，有效對抗扁平疣，其治療機制可能是包括改善機體免疫力，抑制皮膚角質形成相關細胞的異常增殖，促進異常增生細胞凋亡等方面[9]。T細胞是機體免疫的重要單位，在分化成熟后由循環(huán)系統(tǒng)分布至外周免疫器官，其中Th-2細胞主要分泌參與免疫執(zhí)行的細胞因子是 IL-4，IL-5，IL-6和IL-10等[10]。本研究證明驗方DSH-001制劑能夠改善由于免疫抑制導致的巨噬細胞吞噬功能下降以及臟器萎縮，其調控機制可能與促進STAT-3的磷酸化入核相關，同時提高T細胞的數量以及Th細胞亞群比例，誘導增加外周IL-6和CXCL-1等免疫應答相關因子的分泌。以上實驗結果證明DSH-001驗方擁有良好的免疫調節(jié)作用，在治療扁平疣方面具有較高的研究價值，有望成為安全有效的治療選擇。